分离科学与进展lecture1

分离科学与进展Password Go ustcers 课程概要 本课程主要面向分析化学专业的研究生 介绍与分析技术相关的各类分离和分析方法 着重方法的原理介绍 授课时间为18周 考试2周评分 暂定 考勤10 课堂测验30 二次 Paperpresentation10 考试50 授课计划 暂定 引言及课程介绍 2 沉淀 萃取 3 4周 色层分离 4 5周 离子交换及离子色谱 5 6周 膜分离 7周 气相色谱 8 9周 液相色谱 10 12周 毛细管电泳 13 14周 电色谱 15周 凝胶电泳 16 17周 其它分离方法 18周 Paperpresentation 4 18周 沉淀分离 无机沉淀剂分离法有机沉淀剂分离法均相沉淀法共沉淀分离法 无机沉淀剂分离法 沉淀法是最古老 经典的化学分离法 它通过沉淀反应把欲测的组分分离出来或将共存的组份沉淀去除 常用的有氢氧化物和硫化物沉淀分离法常用的氢氧化物沉淀剂有 NaOH溶液 氨水加铵盐 ZnO悬浊液等生成硫化物沉淀可使用H2S或硫代乙酰胺 后者通过在酸性或碱性溶液中加热煮沸发生分解反应而生成沉淀剂H2S或S2 有机沉淀剂分离法 无机沉淀剂虽然可以沉淀分离多种离子 但选择性较差 灵敏度也不够高 有机沉淀剂的出现很好地克服了这些问题 目前有机沉淀剂的种类已经很多 几乎对各种金属都发展出了较为特效的试剂 分析功能团 能使有机试剂与金属离子起选择性作用的特征结构称分析功能团 如a 二肟 胂酸基 有机沉淀剂与有机沉淀反应 形成螯合物 8 羟基喹啉 丁二酮肟 铜铁灵和新铜铁灵 铜试剂 苯胂酸及其衍生物 氨基酸类 苯并三唑形成缔合物 苦杏仁酸 二苦胺 六硝基二苯胺 四苯硼酸钠 联苯胺形成三元络合物 吡啶 1 10 邻二氮杂菲 形成螯合物的沉淀剂和沉淀反应 8 羟基喹啉 可与许多二价 三价和少数四价阳离子反应形成羟基或氨基的络合物 产生沉淀 不同离子产物沉淀的溶解度不同 因此完全沉淀时的pH也不同 形成螯合物的沉淀剂和沉淀反应 丁二酮肟 能与Ni2 形成2 1的螯合物 四个氮原子以平面正方形的构型分布在中心离子的周围 形成二个五员环的难溶化合物 于氨性溶液中沉淀 它是分离Ni2 的有效沉淀剂 形成螯合物的沉淀剂和沉淀反应 铜铁灵和新铜铁灵 是亚硝基化合物中的重要沉淀剂 两者作用相似 后者生成的沉淀更难溶解 该两种试剂能沉淀的离子种类较多 选择性不高 形成螯合物的沉淀剂和沉淀反应 铜试剂 即二乙基胺二硫代甲酸钠 简称DDTC 能与很多金属离子生成沉淀 但和Al3 碱土金属及稀土离子不产生沉淀 因此常用来沉淀除去重金属离子 形成螯合物的沉淀剂和沉淀反应 苯胂酸及其衍生物 是Zr4 Hf4 Th4 Sn4 等离子的较好沉淀剂 形成缔合物的沉淀剂和沉淀反应 苦杏仁酸 又名苯羟乙酸 及其衍生物 常用来沉淀Zr4 Hf4 形成缔合物的沉淀剂和沉淀反应 二苦胺 又名六硝基二苯胺 用来沉淀K Rb Cs 形成缔合物的沉淀剂和沉淀反应 四苯硼酸钾 用来沉淀K Rb Cs 四苯硼酸钾形成的沉淀溶解度小 其分子量大 因而适合重量法测定 联苯胺 在微酸性溶液中与H 结合生成阳离子 可以沉淀SO42 生成联苯胺硫酸盐 形成三元络合物的沉淀剂和沉淀反应 吡啶 在SCN 存在下可与Cd2 Co2 Mn2 Cu2 Ni2 Zn2 等生成三元络合物沉淀 均相沉淀法 通常的沉淀分离操作由于沉淀剂在溶液中无法做到分布 因此往往得到的是细小的晶形沉淀 如BaSO4 CaC2O4 或诉讼输送疏松的非晶形沉淀 如Fe OH 3 Al OH 3 容易吸附杂质 不利于过滤 洗涤等 均相沉淀法不是将沉淀剂加到溶液中去 而是借助于化学反应 在溶液中缓慢而又均匀地产生沉淀剂 均相沉淀得到的晶形沉淀颗粒较粗 非晶形沉淀结构致密 因此夹带的共沉淀杂质少 无需陈化 过滤 洗涤也较方便 均相沉淀的途径 改变溶液的pH值 最常采用的是尿素水解法 在溶液中直接产生沉淀剂 如利用丁二酮与盐酸羟胺的反应来产生丁二酮肟来沉淀Ni2 不但可以颗粒较粗的沉淀而且可以消除Cu2 Co2 等发生共沉淀干扰 逐渐除去溶剂 加热除去水相中的有机溶剂 使沉淀析出 破坏可溶性络合物 加热 络合离子置换 均相沉淀的缺点 操作时间冗长 生成的沉淀会牢固粘附于器壁 共沉淀分离法 共沉淀现象是由于沉淀的表面吸附作用 混晶或固溶体的形成 吸留或包藏等原因引起的 无机共沉淀剂 吸附或吸留作用的共沉淀剂 混晶作用的共沉淀剂形成晶核的共沉淀剂沉淀的转化作用 吸附或吸留作用的共沉淀剂 Cu Al分离 欲从金属铜中分离出微量的铝时 在溶解解试样后 在试液中加入过量的氨水 铜生成Cu NH3 42 而留于溶液中 但Al3 很少难以形成Al OH 3沉淀或沉淀不完全 这时可加入Fe3 生成的Fe OH 3表面吸附了一层OH 可以进一步吸附Al3 从而使微量的铝沉淀出来 得到分离 吸附或吸留作用的共沉淀剂 常用于此类的无机共沉淀剂通常生成非晶沉淀 其表面积大 与溶液中微量元素接触机会多 吸附量也大 有利于痕量元素的共沉淀 而且非晶形沉淀的聚集速率快 可将吸附在表面的微量元素很快地包藏起来 提高了富集的效率 另外 许多硫化物 如PbS CdS SnS2 等除了具有上述特点外 还易发生后沉淀 有利于微量元素的富集 混晶作用的共沉淀剂 如果两种金属离子生成沉淀时 具有相似的晶格 就可能生成混晶而共同析出 如BaSO4 Ra2 SrSO4 Pb2 SrCO3 Cd2 二苦胺钾 Cs 由于晶格匹配条件的限制该共沉淀方法有较好的选择性和抗干扰离子的能力 形成晶核的共沉淀剂 有些痕量元素含量实在太少 即使转化成难溶物质 也无法沉淀出来 但可把它作为晶核 使另一种物质聚集在该晶核上而一起沉淀下来 如溶液中极微量的金 铂 钯等贵金属离子 可以入少量Na2TeO3 再加入还原剂如H2SO3或SnCl2等 在贵金属离子被还原为金属微粒 晶核 的同时 亚碲酸盐被还原为游离碲 在贵金属微粒核心的周围聚集而沉淀析出 沉淀的转化作用 用一种难溶化合物 使存在于溶液中的微量元素转化成更为难溶的物质而使其得到分离的方法 如 CdS Cu2 Hg2Cl2 M CaCO3 Pb2 无机共沉淀剂 无机共沉淀剂除极少数 如汞化合物 可以经灼烧挥发除去外 在大多数情况下需分离载体元素和痕量待测元素 因此只有当载体离子容易被掩蔽或不干扰测定时才方便使用 有机共沉淀剂 形成缔合物的共沉淀剂 被富集的痕量离子与某种配位体形成络离子而与带相反电荷的有机试剂缔合形成难溶盐 而被具有相似结构的载体共沉淀下来 如甲基紫 孔雀绿 品红 亚甲基蓝等 惰性共沉淀剂 加入结构相似但不溶于水的惰性载体 促使痕量组沉淀析出 又称固相萃取剂 例如U VI 1 亚硝基 2 萘酚是微溶螯合物 量少时难以沉淀 在体系中加入a 萘酚或酚酞的乙醇溶液 a 萘酚或酚酞在水溶液中溶解度小 故析出沉淀 同时将U VI 1 亚硝基 2 萘酚螯合物一并共沉淀富集 有机共沉淀剂的优点 害集效率较高 选择性较好 有机载体容易通过高温灼烧除去 萃取分离 主要讨论金属离子的液液萃取 即使溶液与另一种不相混溶的溶剂密切接触 以使溶液中的某种或某几种溶质进入溶剂相中 从而与溶液中的其它干扰组分分离 通常为了实现无机离子的萃取分离 需在水溶液中加入萃取剂 形成不带电荷 难溶于水而易溶于有机溶剂中的物质 以螯合物形式被萃取 萃取剂为螯合剂 此类萃取剂有8 羟基喹啉 双硫腙 铜铁试剂 乙酰丙酮 二乙基胺二硫代甲酸钠 铜试剂 丁二酮肟 双硫腙 乙酰丙酮 以离子缔合物的形式被萃取 带有不同种电荷的离子 由于静电引力 互相缔合成不带电荷的 易溶于有机溶剂的分子而被萃取 1 被萃取的阴离子或阳离子 与大体积的有机阳离了或阴离子缔合成中性分子 可以被有机溶剂萃取 2 有机溶剂分子参加到缔合分子中去 形成易溶于有机溶剂的中性分子 溶剂化分子 以离子缔合物的形式被萃取 ReO4 C6H5 4As C6H5 4As ReO4R2OH 钅羊盐 Fe R2O 2Cl4 R2OH Fe R2O 2Cl4 乙醚萃取三氯化铁 乙醚萃取三氯化铁 各种溶剂形成钅羊盐的能力 ROR ROH RCOOH RCOOR RCOR RCHO 以三元络合物的形式被萃取 三元络合萃取体系往往比螯合和缔合的二元萃取体系更为优越 不但萃取效率高 速率快 而且选择性好 酸性磷类萃取剂萃取 此类萃取剂含有酸性基团 通过结构中的H 而与水溶液中的金属阳离子交换以进行萃取 因此又被称为液体阳离子交换剂 酸性磷类萃取剂对大多数的金属阳子都能萃取 萃取选择性较差 但速度快 价格便宜 酸性磷类萃取剂萃取 共萃取 若某一元素 通常为微量元素 单独存在时不被萃取 或很少被萃取 但当另一元素 通常为常量元素 存在而被萃取时 难萃取元素的萃取效率将大为增加这一现象称为共萃取 主要包括 1 形成复杂多核络合物形式的萃取和 2 形成复杂离子缔合物的共萃取 共萃取 协同萃取体系 通过两种萃取剂的同时使用 使得萃取效率 可用分配比来表示 比任何一种萃取剂单独使用时大大提高的象称为协同效应 这种萃取体系称为协同萃取体系 简称协萃体系 其本质可能是形成了三元或四元络合物 SynergicEffectsinSolventExtraction 协同萃取体系 协同萃取体系实质上也是一种三络合物体系 它是由被萃物质与螯合剂及中性有机磷萃取剂组成的三元络合物萃取体系 在这种体系中螯合剂与被萃取的金属离子螯合 中和了金属离子上的电荷 生成螯合物 有机磷萃取剂进一步置换了螯合物中金属离子上残留的水合分子 于是形成疏水性的三元络合物 而为有机溶剂萃取 协同萃取体系 协同萃取体系 协同萃取作用 混合萃取剂同时萃取某一物质时 其分配比显著大于相同浓度下各单一萃取剂分配比之和 即 有协同效应 D协同 D加和 D1 D2 无协同效应 D协同 D加和反协同效应 D协同 D加和协萃系数R R D协同 D加和 协萃系数 二 2 乙基己基 磷酸 P204 与中性含磷萃取剂协萃体系萃取UO22 的协萃系数含磷萃取剂 B TBPBDBPTOPO单独含磷萃取剂DB0 00020 0020 06单独P204萃取剂DP204135135135混合萃取剂D协同47035003500协萃系数R3 525 925 9TBP 磷酸三丁酯 BDBP 二丁基膦酸丁酯 TOPO 三辛基氧膦 协同萃取机理 生成了更为稳定的含有两种以上配位体的可萃物 生成的配合物疏水性更强 更易进入有机相中 如单独阳离子交换萃取反应 Mn nHA org MAn org 加入中性配合萃取剂S后的协同萃取反应 Mn nHA org xS org MAnSx org nH 协同萃取机理 取代机理 如果形成的萃合物中含有自由萃取剂HA 则加入中性萃取剂S后 S取代HA生成更稳定或更疏水的萃合物 UO22 3HA org UO2 A 2HA org 2H UO2 A 2HA org TOPO org UO2 A 2TOPO org HA org 有时 加入强配位体后 也可以部分取代配位数已饱和的单一配体萃合物 TTA 噻吩甲酰三氟丙酮 Pu TTA 4 org HNO3 TOPO org Pu TTA 3 NO3 TOPO org HTTA 协同萃取机理 溶剂化机理 如果金属的配位数没有饱和 只有一部分被萃取剂A配位 剩下的配位部分被水分子占据 当加入中性萃取剂S后 S取代水分子 形成A和S的协同萃取体系 Y TTA 3 2H2O org 2TBP org Y TTA 3 2TBP org 2H2O 主要协同萃取体系 体系类型实例阳离子交换与中性配合P204和TBP萃取UO22 不同的二元阳离子交换与胺类协同TTA和TOA萃取Th4 协萃体系中性配合与胺类协同TOPO和TOA萃取Am3 阳离子交换与阳离子交换TTA和HAA萃取RE3 相同的二元中性配合与中性配合TBP和Ar2SO萃取UO22 协萃体系三元协萃体系阳离子交换 中性配合 胺类P204 TBP R3N萃取UO22 形成高分子胺盐的三元络合物萃取体系 溶于有机相中的高分子胺盐 与水相中的金属络阴离子接触时 发交换过程 使水相中的金属络阴离子与有机相中的胺盐阳离子缔合生成三元络合物而进入有机相 R3N o HA R3N HA o R3N HA o B R3N HB o A 形成高分子胺盐的三元络合物萃取体系 有机相中的高分子胺与水相中的酸作用生成胺盐 有机相中胺盐的阴离子与水溶液中的金属络阴离子交换 形成缔合三元络合物 而使阴离子进入有机相 这类反应具有溶剂萃取和离子交换两种作用 因此这类胺盐也称为阴离子交换剂 冠状化合物作为萃取剂的萃取体系 冠状化合物通常指大环多醚 包括冠醚和穴醚 冠醚形似皇冠 而穴醚为具有三维结构的双环穴状化合物 冠状化合物结构中疏水性的乙撑基处于外侧 而亲水性的杂原子朝向内侧 形成一个外面疏水 内腔亲水的结构 当金属离子的直径与空腔的大水相匹配时 可形成稳定的1 1络合物而被萃取 冠状化合物作为萃取剂的萃取体系 萃取过程中的基本参数 分配系数 溶质在互不相溶的两相中分配达到平衡后 其在两种溶剂中的浓度比值为一常数 不因浓度而改变 该常数值称为分配系数 KD Ao Aw 这关系称为分配定律 是溶剂萃取的基本定律 分配定律使用时应考虑温度和浓度的影响 萃取过程中的基本参数 分配比 当溶质在一相或两相中发生电离 聚合等化学反应时 需引入分配比的概念 D A总 o A总 w 分配比通常不一定等于分配系数 电离平衡 聚合平衡 分配平衡 分配比 D随 HAc o和 H w而变 配合平衡 分配平衡 分配比 D随 I W而变 萃取百分数 分离系数 在分析化学中 为了达到分离的目的 不仅要求被萃取物质的分配比大 萃取百分数高 而且要求溶液中共存组分间的分离效果好 分离效果的好坏可用分离系数b来表示 b DA DB 萃取条件的选择 形成螯合物的萃取体系 HR H R HRMn nR MRnHRMRn 水相 油相 KDR KDX Ki Kf D KDXKfKin KDRn HR o H n 萃取条件的选择 形成螯合物的萃取体系 萃取剂的选择 对于形成螯合物的萃取体系 应选择酸性较强的 较易电离和较易溶于水的萃取剂 萃取剂与被萃取离子螯合后所形成的螯合物越稳定越好 越易溶于有机溶剂越好 这些因素通常要综合考虑 D KDXKfKin KDRn HR o H n 萃取条件的选择 形成螯合物的萃取体系 萃取溶剂的选择 被萃取的螯合物在萃取溶剂中的溶解度越大 则萃取效率越高 萃取溶剂与水的比重差别要大 粘度要小 这样便于分层 有利于操作的进行 挥发性 毒性要小 而且不易燃烧 酸度的选择 萃取曲线 E pH绘图 D E 100 E K H nK KDXKfKin KDRn HR o n适当控制溶液酸度可以实现不同离子间的分离 各种双硫腙螯合物的萃取曲线 萃取操作 间歇萃取法 为分析化学中最常用的萃取方法 设备简单 分液漏斗即可 连续萃取法 对于分配比小的体系 用间歇法需反复萃取许多次才能达到定量分离 此时需连续萃取技术 逆流萃取法 连续萃取法 从烧瓶中不断地蒸发出萃取用的溶剂 让它冷凝下来 连续通过被萃取的溶液进行萃取 萃取液分离后仍流回原来的烧瓶中 在烧瓶中再将溶剂蒸发出来 再次经冷凝 萃取 并重复进行直到萃取完成 需采取一定的措施保证两相的充分接触 常在溶剂入口增加多孔玻璃或使用搅拌 连续萃取器 Friedrich萃取器 溶剂比水轻 Schmall萃取器 溶剂比水轻但不易挥性 连续萃取器 溶剂比水重 索氏萃取 提取 抽提 器 固体样品 逆流萃取Craig提出的萃取模式 一般来说 二项分布的图形形状取决于n和p 如果p q 1 2 不论n有多大 二项分布呈对称形状 当p q时 图的形状呈偏斜状 而且若在n一定情况下 p q n中的p值与q值相差越大 则偏度越大 当p与q为一定值 尽管二者相差较大 但随着n的增大而偏斜度相应减小 且逐渐接近于左右对称 当n适当大 n 30 且np和nq都不小于5时 p q n的二项分布趋近于正态分布 当n 时 二项分布的极限即为正态分布 P 0 P 1 P 2 P x P n f x 5 1 5溶剂萃取新技术 液相微萃取微波辅助溶剂萃取加速溶剂萃取 1 液相微萃取 LiquidPhaseMicro Extraction LPME 也称溶剂微萃取 solventmicroextraction SME 1996年在液 液萃取基础上发展起来的 结合了液 液萃取和固相微萃取的优点 只需极少量的有机溶剂 装置简单 操作方便 成本低 在样品前处理方面具有重要价值 适合萃取在水溶液中溶解度小 含有酸性或碱性官能团的痕量目标物 LPME技术还可以方便地与后续分析仪器连接 实现在线样品前处理 最初的液相微萃取 将一滴有机溶剂直接悬挂于色谱进样针尖 将其浸入样品水溶液中 分析物从被萃取到有机溶剂液滴中 直接注入色谱仪分析 分离 进样 缺陷 悬挂于针尖的有机溶剂液滴在搅拌样品时容易脱落 改进方法 将多孔中空纤维管固定在针头上保护和容纳有机萃取剂 同时 纤维的多孔性增加了溶剂与样品接触的表面积 从而提高萃取效率 中空纤维管剖面图 平面图 液相微萃取的萃取模式 两相微萃取和三相微萃取 在两相LPME中 中空纤维管壁微孔内浸入的作为萃取剂的有机溶剂与纤维腔内吸入的作为吸收液的有机溶剂相同 目标物被萃取到纤维腔内 在接收液和样品水相之间达到分配平衡 萃取剂与萃取溶剂相同 三相LPME 中空纤维管壁的微孔内浸入的是有机萃取剂 而纤维腔内吸入的是水溶液接收相 有机萃取剂成了样品水溶液和接收相水溶液的隔断 目标物先被有机萃取剂从样品水溶液中萃出 然后进入接收相 可离子化的分析物从水相萃取到中空纤维孔中的有机相中 再进入水相接受液中 萃取了样品的接受液可直接注入色谱仪分析 三相LPME的萃取装置 接受液在中空纤维管中循环流动 以加快纤维壁中萃取剂与接受液之间的传质速度 纤维管中的接受液在萃取结束后可以吸入注射器中 换上色谱进样针头 直接注入色谱仪 动态三相微萃取装置示意图 有机溶剂浸渍的中空纤维套在注射器上 注射器内存有少量受液 推动注射器反复更新中空纤维内的有机相 可提高富集倍数 已用于萃取水样中的芳胺 液滴微萃取 液滴萃取 进样方法是一种微量样品富集进样技术 样品富集机理为液液萃取 如水样中的十二烷基硫酸钠 与亚甲基兰形成离子对 用氯仿液滴 1 3 l 收集 用光学检测法检测 若样品为多个成分 可利用该富集技术 将富集后的样品液滴引入色谱系统进行分离检测 构思新颖 设计巧妙 液滴收集示意图 2 微波辅助溶剂萃取 微波辅助溶剂萃取 microwaveassistedsolventextraction MASE 也称微波辅助萃取或微波萃取 微波指波长在1mm至1m范围 300 300000MHz 的电磁波 915MHz和2450MHz两个频率广泛用于微波加热 微波辅助萃取就是利用微波加热来加速溶剂对固体样品中目标物的萃取 早期使用家用微波炉 几分钟就解决了传统加热萃取需要几个小时甚至十几个小时的问题 微波加热原理 传统加热 热传导 热辐射方式 由外向里 加热慢 受热不均 微波加热 被辐射物质偶极矩旋转 数亿次 分钟 和离子传导方式 由里向外 加热快 受热均匀 微波加热的选择性 不同物质的极性不同 吸收微波能的程度就不同 因而产生和传递给周围环境的热量不同 非热生物效应 生物样品中的极性水分子在微波场中的强烈极性振荡 导致细胞分子间氢键松弛 细胞膜结构破裂 使萃取更快 更完全 密闭型微波萃取装置 萃取罐 可控温控压 萃取罐密闭 目标成分不易损失 压力增大时 溶剂沸点也相应提高 有利萃取 萃取溶剂既可以是无机酸 也可以是各种有机溶剂 包括正己烷 苯等非极性溶剂 开罐型微波萃取装置 通过一根波导管将微波聚焦于萃取体系上 萃取罐是开放式的 与大气连通 只能控温 不能控压 继承了索氏萃取的优点 不足之处是同时处理的样品数较少 加速溶剂萃取 加速溶剂萃取 acceleratedsolventextraction ASE 是一种连续自动萃取技术 在较高温度 50 200OC 和较高压力 10 20MPa 下用溶剂萃取固体或半固体样品 与索氏萃取 微波辅助萃取 超临界流体萃取等固体样品萃取技术相比 ASE使用的有机溶剂少 萃取10g样品仅需15mL溶剂 萃取速度快 完成一个萃取操作全过程只需15分钟 基体影响小 相同萃取条件可以用于不同基体的样品 萃取效率高 萃取选择性好 自动化程度高 加速溶剂萃取仪 传送装置将萃取池送入加热炉腔 泵将溶剂输送到萃取池 萃取池在加热炉中被加热和加压 5 8分钟 静态萃取数分钟 萃取液经滤膜进入收集瓶 少量多次向萃取池中加入清洗溶剂 然后用氮气吹洗萃取池和管道 将样品装入萃取池 放到圆盘式传送装置上 以下操作将完全自动进行 5萃取分离法 5 1溶剂萃取5 2胶团萃取5 3双水相萃取5 4超临界流体萃取5 5固相萃取5 6溶剂微胶囊萃取 5 2胶团萃取 1 基本概念胶团 胶体 萃取 被萃取物以胶体或胶团形式被萃取 胶体萃取也能用于无机物的分离 但应用较少 如 氯仿 或CCl4 萃取胶体金 乙醚或氯仿萃取胶体银或硫酸钡 正向微胶团 在水溶液中加入表面活性剂达到一定浓度时 会形成表面活性剂聚集体 胶团 在这种胶团中 表面活性剂的极性头朝外 向水 而非极性尾朝内 反向微胶团 与正相微胶团相反 当向非极性溶剂中加入表面活性剂达到一定浓度时 会形成憎水非极性尾朝外 向溶剂 而极性头 亲水基 朝内的胶团 胶团大小在毫微米级 正向微胶团 反向微胶团 生物物质对分离体系的要求严格由于在分离过程中生物物质容易被破坏 很多通常的分离方法 如蒸馏 难以采用 由于生物样品一般粘度较大 过滤和超滤等也困难 由于生物物质 蛋白质 的亲水憎油性 使其难溶于一般有机溶剂 不适合通常的水相 有机溶剂相体系 由于生物物质直接与有机溶剂接触会引起变性 应尽可能避免直接接触 对生物物质萃取所用溶剂的要求能溶解蛋白质并能与水分相 不破坏蛋白质生物功能 反向微胶团对生物物质的溶解反向微胶团中有一个极性核心 它包括了表面活性剂的极性头组成的内表面 平衡离子和水 此极性核心又称 水池 waterpool 水池可以溶解极性分子 于是 极性的生物分子就可以溶于有机溶剂而不直接接触有机溶剂 2 蛋白质的溶解模型 水壳模型蛋白质居于 水池 中心 水壳层则保护了蛋白质 使其生物活性不会改变 陆九芳p125a 蛋白质亲水基插入反向微胶团中仅蛋白质的亲水基插入胶团内部的 水池 中 而其亲脂基团露在胶团外面 与表面活性剂的疏水剂或有机溶剂的碳氢部分接触 陆九芳p125b 吸附模型蛋白质分子吸附在胶团内部由表面活性剂亲水头组成的亲水壁上 陆九芳p125c 溶解模型蛋白质被几个胶团包围而溶解于表面活性剂胶团 胶团的非极性尾与蛋白质的亲脂部分直接作用 陆九芳p125c 水壳模型是比较公认的蛋白质溶解机理 胶团中水含量 0 水池 中的水与正常水有所不同 特别是当 0相当低 如 0 10 时 其冰点通常低于00C 蛋白质表面的电荷与微胶团内表面的电荷之间的静电作用对蛋白质的溶解起重要作用 3 影响胶团萃取的主要因素 表面活性剂和溶剂种类对胶团萃取的影响表面活性剂多采用AOT 琥珀酸二 2 乙基己基 酯磺酸钠 阴离子表面活性剂 AOT作为反向微胶团的表面活性剂的优点 所形成的胶团的含水率高 0为50 60 比季铵盐高一个数量级以上 AOT形成反向微胶团时 不需要助表面活性剂 有机溶剂通常采用异辛烷 表面活性剂AOT能迅速溶于有机溶剂 也能溶于水而形成液晶态 非球状 胶团 水相pH值对胶团萃取的影响蛋白质为两性分子 各种蛋白质有确定的等电点 pI 当pHpI时 蛋白质分子和表面活性剂内表面都荷负电 相互排斥 蛋白质难溶于胶团中 pH过低时 蛋白质会变质 溶解度也降低 pH值对蛋白质溶解度的影响 离子强度增加 减小了蛋白质的表面电荷与微胶团内表面电荷的相互作用 从而降低蛋白质在胶团中的溶解度 陆九芳p127 320 离子强度对胶团萃取的影响 4 胶团萃取分离过程 制备含蛋白质的反向微胶团的三种方法相转移法 将含蛋白质的水相和含表面活性剂的有机溶剂相接触 在缓慢搅拌下 部分蛋白质转入有机相 此过程较慢 最终得到的含蛋白质有机相是稳定的 注入法 向含表面活性剂的有机相中注入含蛋白质的水溶液 此过程较快 操作也很简单 溶解法 适用于水不溶蛋白质 将含水的反向微胶团的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌 制备含蛋白质的反向微胶团的三种方法 胶团萃取实例 胶团萃取分离3种蛋白质 核糖核酸酶 细胞色素C 溶菌酶 表面活性剂 AOT 有机相 异辛烷利用离子强度和pH值调节蛋白质的溶解度差异 pH 9 KCl 0 1M时 核糖核酸酶不溶于胶团 留在水相 进入有机相胶团中的细胞色素C和溶菌酶用pH 9 KCl 0 5M的水溶液反萃取 只有细胞色素C进入水相 仍留在有机相中的溶菌酶再用pH 11 5 KCl 2 0M的水相反萃取 陆九芳p128 323 核糖核酸酶不溶于胶团 留在水相 反萃取 只有细胞色素C进入水相 反萃取 5 3双水相萃取 1896年Beijerinck发现 明胶 琼脂 或 明胶 可溶性淀粉 混浊不透明溶液两个有界面的液相 两相的主成分都是水上相富含明胶下相富含琼脂 或淀粉 葡聚糖 甲基纤维素双水相体系 等体积的2 2 葡聚糖与0 72 的甲基纤维素的水溶液形成的双水相体系上相 0 39 葡聚糖0 65 甲基纤维素98 96 水下相 1 58 葡聚糖0 15 甲基纤维素98 27 水 几类双水相体系聚合物 聚合物 水 聚丙稀乙二醇 甲氧基聚乙二醇聚乙二醇 聚乙烯醇高分子电解质 聚合物 水 硫酸葡聚糖钠盐 聚丙稀乙二醇羧甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素高分子电解质 高分子电解质 水 硫酸葡聚糖钠盐 羧甲基纤维素钠盐硫酸葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐聚合物 低分子量组分 水 聚丙稀乙二醇 磷酸钾甲氧基聚乙二醇 磷酸钾聚丙稀乙二醇 葡萄糖表面活性剂 表面活性剂 水 生物物质在双水相体系中的分配生物样品的复杂性 分配机理的复杂性包括可溶物 蛋白质 核酸 悬浮颗粒 细胞或细胞器 各种物质的大小 形状和性质不同 存在形式不同 离解状态 聚集状态 分配机理的解释界面张力作用电位差作用 Donnan效应 界面张力作用微小粒子在液体中由于热运动而随机分布 界面张力的影响使它呈不均匀分布 并聚集在双水相体系中具有较低能量的一相中 电位差作用带电大分子 粒子 在两相中分配时 会在两相产生电位 Donnan效应 Donnan效应使得某些物质选择性地通过Donnan膜 即某种 类 物质在某相富集 影响分配的因素聚合物的组成和浓度pH值 影响两相的电位差 盐的种类和浓度 陆九芳p137 330 双水相萃取体系的应用 酶 核酸 生长激素 病毒等生物物质的分离纯化萃取流程 右图 聚乙二醇 PEG 磷酸盐体系萃取酶1 目标酶进入富PEG上相 2 富PEG上相中加盐后形成新双水相 目标酶进入上相 3 富PEG上相中加盐后形成新双水相 目标酶进入下相 破碎的细胞 PEG 磷酸盐下相 上相产物 目标蛋白质细胞碎片 杂蛋 盐白 核酸 多糖形成PEG 磷酸盐体系下相 核酸 上相产物 目标酶杂蛋白 多糖 盐形成PEG 磷酸盐体系下相 目标酶上相 PEG 蛋白质 双水相体系的特点 体系中水含量达70 90 组成双水相的高聚物及某些无机盐不会导致生物物质失活 有时还有保护作用 可直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需蛋白质 还能不经破碎直接提取细胞内酶 易于进行工业放大 处理量可以较大 萃取后 含有聚合物的目标产物可以采用常用的分离手段 超滤 电泳 色层分离等 将聚合物除掉 5 4超临界流体萃取 SupercrticalFluidExtraction SFE 以超临界流体作流动相 直接从固体 粉末 或液体样品中萃取目标物质 有机物 100年前人们就知道超临界流体可以溶解很多物质 20世纪50年代 美国将SFE用于工业分离 1963年 德国首次申请SFE分离技术的专利 20世纪80 90年代成为热门学科 超临界流体与气体 液体传递性能的比较气体超临界流体液体 常温常压 Tc Pc 常温常压 密度g cm30 006 0 0020 2 0 50 6 1 6粘度10 5kg m s 1 31 320 300自扩散系数10 4m2 s0 1 0 40 7 10 3 0 2 2 10 5 SFE的优点 萃取剂在常温常压下为气体 萃取后可以方便地与萃取组分分离 在较低的温度和不太高的压力下操作 特别适合天然产物的分离 超临界流体的溶解能力可以通过调节温度 压力 夹带剂 如 醇类 在很大范围内变化 而且还可以采用压力梯度和温度梯度 SFE的缺点 萃取率较低 选择性不够高 超临界流体的选择原则 化学性质稳定 对设备无腐蚀 临界温度应接近室温或操作温度 不能太高 也不能太低 操作温度应低于被萃取组分的分解 变质温度 临界压力应较低 降低压縮动力 对被萃取组分的溶解能力高 以降低萃取剂的消耗 选择性较好 易于得到纯品 原料目标产物超临界流体萃取容器收集分离发生装置装置 SFE的基本过程 超临界流体萃取典型流程 实例1 从咖啡豆中除去咖啡因大量饮食咖啡因对人体有害 以往工业上除咖啡豆中咖啡因采用二氯乙烷萃取 缺点是残留二氯乙烷影响咖啡品质 而且二氯乙烷同时将部分有用香味物质 芳香化合物 带走 SFE除咖啡因 浸泡过的咖啡豆直接置于萃取容器中 连续 循环 用超临界CO2萃取 T 70 900C p 16 20MPa 10h 咖啡因用水吸收 蒸馏可回收咖啡因 经SFE处理后的咖啡豆中咖啡因含量从0 7 3 降到0 02 实例2 从生物体中提取有机锡有机锡的用途 船体涂料 渔网防污剂 杀虫剂 塑料添加剂 杀菌剂 有机锡的污染 海洋生物 鱼 环境等 溶剂萃取的问题 繁琐费时 SFE法 从大量脂肪基体中分离出有机锡用于分析 CO2 500C 100kg cm2 萃取30min 萃取率94 5 5固相萃取 固相萃取 以固体吸附剂作固定相 被测物或干扰物吸附到固定相中 使被测物与样品基体或干扰组分得以分离 主要用于样品前处理 操作与柱层析 色谱 类似 往往同时使被测物得到富集 固相萃取的特点 与溶剂萃取比 是目前生物 医药 环境 食品等领域备受欢迎的样品前处理 分离和富集 技术 操作简单 快速 减少乳化现象 可处理大量样品 不需要使用大量有机溶剂 应用样品对象十分广泛 固相萃取原理 是发生在固定相和流动相之间的物理过程 其实质就是液相色谱色谱分离过程 只不过用于样品前处理的分离要求不是很高 只需将大量基体物质或其他干扰组分与被测物分离 即对柱效的要求不高 同液相色谱中分离柱的原理一样 固相萃取也是基于待测组分与样品基体在固定相上吸附和分配性质的不同来进行分离的 固相萃取的目的与要求 待测组分在固定相上没有保留 从样品中除去大量基体 待测组分牢固地吸附在固定相上 从复杂基体中将待测组分分离富集出来 与液相色谱不同的是 固相萃取并不需要特别好的峰形和相当短的分析时间 固相萃取的主要萃取模式 与LC分离模式相同 有正相固相萃取 反相固相萃取 吸附固相萃取和离子交换固相萃取 不同的萃取模式所使用的固定相不同 固定相选择原则也与LC相同 主要依据被测物和基体物质的性质 被测物极性与固定相极性越相似 则被测物在固定相中的保留就越强 固相萃取所用的固定相也与LC常用的固定相相同 只是粒度稍大一些 约30 50 m 正相固相萃取 采用极性固定相 可从非极性溶剂样品中萃取有机酸 碳水化合物和弱阴离子等极性物质 被萃取的极性化合物在固定相上保留的强弱取决于其极性基团与固定相表面极性基团之间的相互作用 氢键 键 偶极间相互作用等 固定相主要是以硅胶为载体的二醇基 丙氨基小柱 反相固相萃取 采用非极性或弱极性固定相 适用于萃取从非极性至中等极性的化合物 应用对象最广泛 是样品前处理中使用最多的一种固相萃取模式 被萃取物与固定相间主要是基于范德华力和色散力的疏水相互作用 使用的固定相主要是在硅胶载体表面键合了疏水性烷烃 如18烷 辛烷 二甲基丁烷 离子交换固相萃取 采用离子交换剂固定相 用来萃取有机和无机离子性化合物 如有机碱 氨基酸 核酸碱 离子性表面活性剂等 被萃取离子因与固定相表面的离子交换基团之间的静电相互作用而保留 所用离子交换剂通常是在硅胶载体表面接上季铵基 磺酸基 碳酸基等 吸附固相萃取 以吸附剂 氧化铝 硅胶 石墨碳材料 大孔吸附树脂等 作固定相 除石墨碳材料和大孔吸附树脂也可以萃取非极性物质外 吸附固相萃取主要用于极性化合物的萃取 吸附固相萃取在样品前处理中的应用也相当广泛 固相萃取装置 简易固相萃取仪 萃取小柱真空萃取箱蠕动泵 SPE真空装置 能同时处理多个样品 利用其独特的转动上盖 可方便地在SPE各步骤间任意切换 以收取所需要的组分 自动固相萃取系统 仪器操作原理 在进行柱预处理 样品添加 柱的洗涤 干燥时 支架如图所示位于托盘的前方位置 接着 安装在机械臂上的移液针将 支架移动到托盘后面的位置 使 柱位于相应的洗脱液收集管上方并将洗脱下来的化合物收集在收集管中 固相萃取与色层分离 萃取色层的区别固相萃取色层分离萃取色层两相固 液固 液液 液 水 固定相制备键合 化学修饰键合 化学修饰液体附于固体载体固定相种类较多很多较少分离机理吸附 分配 交换等吸附 分配 交换等分配柱尺寸小 3 5 cmX1cm大 20 100 cmX5cm中等主要用途样品前处理分离 纯化 工业制备无机分离 残余硅醇基 非极性固定相通常采用封尾技术将硅胶表面的残余硅醇基屏闭 但极性或离子交换固定相通常不封尾 封尾程度非常重要 因为残留硅醇基对化合物的保留和洗脱起着不可忽视的作用 即使采用最严格的封尾方法 也只能将键合相形成后剩余的70 的硅醇基团封住 因此 那些残留硅醇基还会在待测组分的分离中发挥作用 残余硅醇基的作用 在pH小于2时 硅醇基不带电荷 pH大于2时 硅醇基逐渐离解而带负电荷 从而影响萃取 静电相互作用比疏水相互作用更强 因此 如果存在混合保留机理 必须采取措施减小或扩大残留硅醇基的影响 例如 固相萃取法萃取胺时 带正电荷的胺与带负电荷的硅醇基形成非共价键 很难离解 为了降低硅醇基的影响 最好选择封尾的固定相 残留硅醇基可用三乙胺或醋酸铵等竞争碱来屏蔽 残余硅醇基的利用 使用没有封尾的固定相和pH 4的缓冲溶液以保证残余硅醇基离子化 推荐采用缓冲溶液作为二级调节溶剂是因为水的pH值是波动的 而且没有缓冲能力 实例 血浆中舒喘宁的测定 未封尾的硅胶萃取小柱先用甲醇和水活化 血浆流经萃取柱 带正电荷的舒喘宁通过与硅醇基的相互作用被萃取在柱上 先用水然后用乙腈冲洗固定相以消除有可能产生干扰的成分 最后用含有0 5 醋酸铵的甲醇溶液将舒喘宁从萃取柱上洗脱下来 作为后续分析的样品 相互作用能 待测组分可以通过氢键 偶极 偶极相互作用 疏水作用力 静电相互作用等机理保留到固定相上 在萃取中 这些作用机理可能单独存在 也可能多种分离机理同时存在 了解是哪些力在起作用 有利于制订特效的分离方法 各种键合力的能量相差较大 疏水键合能 偶极 偶极 偶极 诱导偶极 色散相互作用 1 10kcal mol 极性基团间的氢键 5 10kcal mol 这种类型的相互作用在硅胶表面发生的机会较多 相反电荷间的离子或静电相互作用 50 200kcal mol 有机高分子聚合物固定相 也是利用范德华力 氢键 离子相互作用 偶极 偶极相互吸引等机理进行分离 与硅胶载体的固定相相反 有机聚合物固定相没有由硅烷醇或痕量金属引起的附加效应干扰待测组分在固定相表面的吸附 非极性物质 如脂肪 蜡 碳氢化合物 类脂类和芳香类化合物 可以强烈地吸附在这类固定相上 如果采用温和的洗脱条件 上述非极性物质可以与极性或离子性污染物分离 如果抑制离子型化合物的离解 使它们成为 电中性 的 它们也能在有机聚合物固定相柱上保留 然后通过改变淋洗液的pH将它们从柱上洗脱下来 固相萃取操作 基本步骤 用甲醇等溶剂活化固定相 用水或缓冲溶液 有时也用不含被测物质的空白溶液 平衡萃取柱 将样品负载在萃取柱上 用水或缓冲溶液冲洗萃取柱 以消除样品基体 用流动相或溶剂将待测组分从萃取柱上洗脱下来 最后将流出液直接或经蒸发浓缩后进行后续分析 用有机溶剂 如甲醇 润湿柱子的目的 消除萃取柱中可能会干扰待测组分的有机杂质 打开碳链 增加萃取柱与待测组分相互作用的表面积 也就是通常所说的活化 如果不进行这一步 就会减少待测组分的保留 影响回收率 而且有可能出现干扰峰 用纯水或合适的缓冲溶液冲洗吸附床将消除过量的甲醇 调节柱子的表面 为样品的负载作准备 实例1 HPLC测定人血清中胆汁酸的样品前处理 实验过程 SPE柱 ODS柱 先后用5ml甲醇和5ml水预处理 100 L血清样品中加入4ml0 4mol LNaHCO3上样 样品通过柱子后 用20mL水冲洗 再用2mL甲醇将胆汁酸洗脱 在45 下用N2将洗脱液吹干 以丙酮定容至1mL 衍生化 取20 L样品做HPLC分析 ODS柱 右图为经SPE处理并衍生后胆汁酸的HPLC谱图 SPE预处理已基本去除了人血清中其它物质对胆汁酸的干扰 实例2 固相萃取分离提纯紫杉醇 紫杉醇是一种具有独特抗癌机理的天然抗癌药物 它对乳腺癌和卵巢癌等有特殊的疗效 简化紫杉醇的提纯工艺 降低成本 是紫杉醇走入市场的一个技术关键 固相萃取方法 使用Sep PakC18硅胶载体柱 活化 往柱中依次加入10 乙酸乙酯 甲醇和0 01mol LpH5 0的乙酸铵水溶液并抽干 样品上柱 将100mg红豆杉浸膏溶解于40 60 的甲醇 乙酸铵水溶液后加到柱中 抽干 杂质淋洗 先用10ml的含20 甲醇的乙酸铵缓冲液淋洗并抽干 然后用10ml含60 甲醇的乙酸铵淋洗 紫杉醇洗脱 在淋洗好的柱子中加入10ml含80 甲醇的乙酸铵 收集洗脱液 减压蒸干 紫杉醇的质量控制可用 分析 紫杉醇的常压反相层析精制 经固相萃取初分离的紫杉醇 再用C18常压层析进一步纯化 50 乙腈水溶液为洗脱剂 可使紫杉醇的含量从10 提高到95 紫杉醇回收率95 固相微萃取 SPME 1989年加拿大Pawliszyn等提出 SPME是基于固相与样品之间的平衡而建立起来的集进样 萃取 浓缩功能于一体的技术 通过石英纤维头表面的高分子涂层对样品中的有机