利用植物基因工程技术治理重金属污染

利用植物基因工程技术治理重金属污染刘毅1,2,丁元明1*,寸东义1,刘忠善1,曹云华1,杜宇1,和捷1(1.云南省出入境检验检疫局,云南昆明;2.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明)摘要利用植物治理重金属污染的土壤为生物治理提供了一个廉价有效的解决途径。但是普通超富集植物在污染地生长量不大、去除污染速率较低。通过植物基因工程技术将抗重金属的新特性引入到大生物量的植物中，改造其金属耐受性和富集能力，是一个有效提高植物修复能力的策略。关键词植物基因工程；重金属污染；植物修复Phytoremediation for Heavy Metal Pollution with Plant Genetic EngineeringLIU Yi et al(Yunnan Entry-Exit Inspection andQuarantine Bureau， Kunming， Yunnan )AbstractPhytore mediation for the soil polluted by heavy metals with plants is a low-cost and effective strategy. Wild plants with hyper accumulation capacity usually have small biomass and thus slow the velocity for pollution removing. The improvement of the fast growing plants with high-biomass for its metal toleration and accumulation capacity with plant genetic engineering is an effective strategy for the remediation ability increasing of plants.Key wordsPlant genetic engineering；Heavy metal pollution；Phytoremendiation全球工业化导致大量的潜在毒性化合物释放并进入生物圈，其中包括重金属主要是铅、镉、汞、砷、铜、镍、钴等1。铅是工业化国家的重要重金属污染物之一，在城市、房屋灰尘、居民区土壤和工业区中广泛存在。在人体里，铅的积累主要影响神经系统、血液细胞和肾，是儿童健康的第一环境威胁。镉污染的分布也很广泛，主要集中在排放锌矿废物的土壤、淤泥和过量施用富含镉的磷肥的土壤中，低浓度的镉对人具有高毒性并且可能致癌2。汞污染也威胁全世界的人类、野生动物以及鱼类的健康。为了使有毒元素进入食物链的可能性降到最低，急需解决环境中的这些重金属污染1。此外，重金属对人和动物的威胁还由于它们在环境中长时间的存在而加强3。例如，铅可在环境中存在1501 500年，并且有报道称其在进入土壤中150年后仍浓度较高4。镉的生物学半衰期估计为18年5，在人体内为10年6。它可通过食物链转移并富集，从而进入动物体或人体内，引发DNA损伤7。镉、铬和铜与从皮肤炎到癌症的一系列疾病有关8-9。一些金属以放射性同位素(238U、137Cs、239Pt、90Sr)形式出现，这大大增加了健康的风险10。利用化学方法和物理方法清除土壤中重金属的污染，通常因为成本太高和破坏环境而不能被大规模应用。植物修复是利用植物来转移、容纳或转化环境污染物以达到清除污染物、治理环境的目的，被认为是一个从土壤中清除有毒重金属污染的成本低且对环境友好的技术1。该技术包括植物提取、植物挥发和植物固定，其中针对植物提取的研究较多3-4。植物提取指利用超富集植物吸收、富集污染物，使植物地上部分的污染物含量达到一定的浓度，通过收获植物地上部分的方法，达到清除污染物的目的11。利用植物基因工程手段培育具有高富集能力的转基因植物技术的发展始于对汞离子还原酶的研究，并且已经有关于提高镉的耐受性和积累能力的转基因植物的报道。利用植物基因工程技术培育的转基因植物能吸收、隔离和(或者)去除各种环境污染物的毒性，以便修复被污染的土壤、水或者空气，这方面的研究将为恢复由于人类活动而被重金属污染的大规模土壤和水提供一个有效的技术手段和方法11。1利用植物基因工程技术治理重金属污染的原理、具体步骤以及基本策略因为重金属污染物在土壤中可以稳定存在并且不能被完全无毒化，所以大多数植物修复策略的最终目标是收获积累了重金属的地表植物组织，例如，茎干、叶片等。通常认为，重金属离子浓度达到或超过植物干重的0.1%1.0%是超积累，大部分有毒重金属超富集的植物修复能替代代价极高的物理修复或化学修复12。1.1植物基因工程技术治理重金属污染的原理 理想的修复植物应该是高生物量、高积累量、生长快速、同时能耐受和富集土壤中多种有毒重金属、根系发达、容易种植和收获的植物。虽然存在能耐受和富集高浓度有毒重金属的天然植物，但这些植物生物量小、生长缓慢、种植困难。目前，随着分子生物学技术的发展，可使用基因工程手段来改进一些生长快、生物量大的植物使其对重金属具有高的耐受性和富集能力。目前的植物基因工程技术已经能把多种抗性基因导入到不同品种的植物中，通过研究转基因植物的修复能力，获得可以应用于重金属污染治理的超富集植物新品种。1.2植物基因工程技术治理重金属污染的基本步骤 首先，寻找到合适的排异生物和超累积生物，通过与同种系其他对重金属耐性低且富集量小的生物进行对比及用生物化学、分子生物学等方法鉴别出控制这些性状的基因。其次，分离或克隆出这些基因，并导入到目标植物受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。最后，将转基因植物进行田间测试，确定这种基因应用于该生物中的可行性。其中最关键的是鉴定和克隆在重金属排异和超累积中起决定作用的基因，并探明其中特定的分子生物学机制。1.3植物基因工程技术治理重金属污染的基本策略 提高植物对重金属的耐受性和富集能力是发展植物修复技术的关键，提高植物对重金属的耐受性和富集能力有两种基本策略。增加金属透过质膜的转运能力。多年的研究表明，大多数阳离子转运蛋白不仅能吸收二价阳离子Cd2+、Fe3+、Zn2+，还能转运其他阳离子。如拟南芥IRT1属于ZIP家族的金属转运蛋白，具有广泛的底物特异性，能转运Cd2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等离子13，缺铁时能诱导IRT1的高水平表达。这些转运蛋白在转录和转录后水平受到严格地调控，在植物修复中必须考虑应用不同底物特异性和高亲和力的转运系统，使非目标金属不参与竞争。因此，需要根据不同的底物要求进行不同的构建。例如，将各种ZIP家族转运子中保守残基用Ala替换，形成IRT1的突变体，使之不能转运Fe2+、Mn2+，保持对Zn2+、Cd2+的高水平转运活性14。对植物根系进行修饰。如通过加强植物根部分泌质子或螯合剂，改变根系的氧化还原状态等方法提高植物对重金属的耐性和积累能力；过量表达柠檬酸合成酶的转基因烟草，根部分泌的柠檬酸量是对照的4倍，铝耐性提高2倍；植物根系细胞内特定细胞器的区室化作用13。2利用植物基因工程技术治理重金属污染的研究进展2.1通过增强植物细胞表面金属转运蛋白的转运能力提高植物对重金属的生物利用率土壤中存在的金属离子被植物吸收之前，首先是被定位在植物根部的质外体。这些金属离子中的一部分被进一步转运定位到植物细胞内部，一部分更进一步被转移定位在质外体，还有一部分与植物细胞壁物质结合15。植物根细胞表面存在许多高亲和性的金属转运蛋白，这些蛋白用于转运相关的金属离子到植物细胞体内。例如，锌转运蛋白(ZIP)可以转运Zn2+和Fe3+16。每克鲜的锌超富集植物天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)根的表面与非富集植物菥(T. arvense)相比存在更多的锌转运蛋白17。因此，通过基因工程手段对编码金属转运蛋白的基因进行遗传操作可改进植物对重金属的耐受性和积累能力。从野生荠菜(Thlasai oesingense)中克隆出锌转运蛋白基因ZAT，然后导入拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其根部吸收锌的能力提高了两倍18。导入来自于拟南芥的Ca2+转运蛋白到烟草中，增强了烟草对钙、镉、锰的积累能力19。酵母FRE1和FRE2基因编码Fe3+还原酶，在烟草中导入这两个基因可以使烟草中Fe3+的含量提高1.5倍20。在拟南芥中过量表达金属转运蛋白AtNramp1，可以增强植物体对Fe2+的耐受性21，然而同时整合入另一个基因AtNramp3，却导致了植物体对镉耐受能力的下降22。2.2通过增强植物细胞内金属结合蛋白的表达提高植物对重金属的耐受性和富集能力 金属结合蛋白是一类能够特异性结合重金属、具有保持体内微量元素平衡及金属解毒功能的蛋白质。金属结合蛋白广泛存在于各种生物体内，是一类低分子量(67 kDa)、富含半胱氨酸，但不含芳香族氨基酸和组氨酸的蛋白质23。Ag+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Hg2+和Ni2+通过与这些蛋白质中的半胱氨酸残基上的巯基(R-SH)结合，形成无毒或低毒的螯合物，从而消除它们的毒害作用。植物络合素(PCs)最初发现于裂殖酵母，是它组成了由酶促反应合成的具有共同结构的多肽家族，结构一般为(-Glu-Cys)nX，n通常是2-11，X是Gly，但也可能是-Ala或者Ser。目前普遍认为，PC由相对保守的N末端结构域和可变的C末端结构域组成。植物在重金属胁迫下能快速合成PCs，PCs在植物重金属耐性中的作用通过对拟南芥cad1、cad2的研究发现，这些突变体由于PCs合成能力的缺陷，对镉超敏感24。PCs能与有毒金属离子形成螯合体复合物，并且被转运进入液泡而储存起来。此外，PCs还可以将金属离子转运给新的合成酶25，进一步调节植物体内的阳离子代谢平衡。研究表明，PCs的产生是高等植物解镉毒的普遍机制26。在植物体内，PCs的合成受GSH调控，还原型谷胱甘肽(GSH)为合成PCs的底物，在重金属镉胁迫条件下，GSH或PCs的水平决定了植物对镉的积累及抗镉的能力27。MTs最初发现于哺乳动物，植物中的金属硫蛋白(MTs)是一类金属结合蛋白，植物中有一个复杂的MTs基因家族，MTs基因家族编码的蛋白通常由6080氨基酸组成，包含916半胱氨酸残基。在植物体内MT定位在细胞质中，主要用于伴随营养金属元素执行其相应的功能(如在蛋白质折叠过程中将相应金属离子插入到其活性中心等)，也可以络合毒性重金属离子形成无毒或低毒络合物以保护植株免受毒害，从而有利于这些毒性重金属在体内的积累。例如，过量表达MTs以及转MTs突变体aa，可以显著提高植物对镉、铜等重金属的忍耐性28；在烟草中过量表达小鼠MTs32基因，能适度提高转基因烟草对Cd2+的抗性和积累能力11，29；番茄等植物引入MTs后，可以提高植物组织中MTs的含量，显著提高植物对镉、铜等的耐性或增加对这些金属元素离子的吸收30。但也有实验证明，在重金属胁迫条件下，MTs的表达量是下降的。例如，将酵母MT基因CUP1导入烟草，用4mmol/LCuSO4处理转基因的第3代烟草7 d，CUP1转录物下降31。植物络合素(PCs)和金属硫蛋白(MTs)都是由氨基酸组成的多肽，当植物细胞体内金属积累水平提高时，需合成大量的金属硫蛋白和植物络合素使植物体解毒，这会消耗植物中大量的氨基酸(尤其是半胱氨酸)，同时还要消耗大量能量和相当数量的生长必需元素:硫和氮。因此，增加金属结合蛋白合成在某些程度上可能影响植物生长，一些研究也表明，组成型表达哺乳动物金属结合蛋白基因的转基因烟草幼芽中金属积累的量比对照植物少，过量表达哺乳动物金属硫蛋白基因的烟草植物与对照植物相比在产量、开花时间、叶子数量等方面的表现都较差。转入人类hMTII烟草幼苗积累的Cd2+比对照植物少70%，并且在转基因植物中镉转运进入茎尖的量也减少了。在拟南芥中植物络合素合成酶的过量表达导致植物对重金属胁迫敏感31。以上结果表明，增加植物体内金属结合蛋白的含量能增加植物对重金属的耐受性，但会影响植物生长，在利用植物基因工程技术改造植物重金属的耐受性方面不适合应用此策略。2.3通过把有毒金属离子转运进入液泡中提高植物对重金属的耐受性和富集能力 液泡被认为是酵母和植物细胞体内储存金属离子的主要场所，液泡的区室化作用是一些金属超富集植物内部耐受机制的一部分。有研究表明，在某些植物体32和裂殖酵母33中，植物螯合素金属复合物通过某种机制被泵入液泡中。这种机制可用于改良植物修复品种，增加它们吸收重金属到安全区域的能力，同时只要求表达少量的转运蛋白。超富集镍的植物野生荠菜把叶片细胞内大部分的镍转运到液泡中，从而提高了它对镍的耐受性34。野生荠菜中的一个液泡金属离子转运蛋白TgMTP1的高水平表达被认为与这种植物对重金属离子的耐受能力提高有关35。到目前为止，研究较多的与金属耐受性有关的液泡转运蛋白是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡转运蛋白YCF1，它催化Cd2+(Cd-GS2)转运到液泡中36，同时也可催化As-GS337和Hg-GS238的转运。过量表达YCF1能增强酵母对Cd2+和Pb2+的抗性。YCF1可以将Cd2+转运并隔离到液泡中，对Pb2+的抗性有相似的机制。铅(更可能是谷胱甘肽铅复合体)可能是YCF1新的底物。研究结果表明，在ycf1的酵母突变株中过量表达YCF1的植株比野生型具有更高的抗性，这是因为定位于液泡膜的YCF1将金属转运进入到液泡中。最近的研究在拟南芥中成功地表达有功能活性的YCF1，在拟南芥中YCF1的过量表达明显提高了植物对高浓度铅、镉的耐受性，转基因植物叶、茎中的金属富集量比对照植物高出2倍，这些转基因植物对Pb2+和Cd2+有很高的抗性，液泡中铅和镉的含量增加。这个研究最主要的创新之处在于，低水平的蛋白表达能安全地隔离植物细胞中大量的重金属，无需MT和PC的大量表达。这是提高植物对金属耐受性的经济有效的策略，也是构建理想修复植物品种的重要方法2,39。在铅存在的情况下，转入YCF1的白杨树比野生型白杨树具有更高的耐受性2。这些研究结果激励人们去培育表达YCF1的转基因植物。2.4通过把有毒金属转化为低毒或无毒形式提高植物对重金属的耐受性和富集能力 很多元素(如汞、铁、铬)以多种化学状态存在，对人体的健康危害程度与其化学形态、环境条件和侵入人体的途径、方式有关。例如，环境中的汞主要是来自工业和有关安全事故中的液态汞，或者来自于燃烧的煤、垃圾、火山运动的微粒物质汞盐(Hg2+)，以及来自工业废水中的汞化合物。尽管Hg2+有毒，但是它和液态汞很少与人类汞中毒的事件有关，而有机汞化合物，尤其是甲基汞(MeHg)，对人类健康的危害性极大。在水中，不同化学形态的汞被厌氧细菌转变为MeHg，使之具有了比自然界存在的其他汞化合物更强的毒性。利用细菌mer操纵子的merA和merB基因可以在植物中设计一个汞转化的补救系统。细菌的merA基因编码一个NADPH依赖的Hg2+还原酶，转化Hg2+为汞40。汞的毒性比Hg2+的毒性低了2个数量级，并且由于液态汞易挥发而被清除掉。在植物中组成型表达merA能使植物对Hg2+的抗性比对照至少高出10倍。细菌merB基因编码一个有机汞裂解酶，能够降解MeHg为甲烷和Hg2+。在细菌中merA和merB是同时表达的，所以细菌mer操纵子的终产物通常是液态汞。merA和merB在植物中共同表达使MeHg经过两个阶段转化为挥发性的液态汞，使转双基因的植物对MeHg的抗性比对照植物高50倍，比转merB植物高5倍。在土壤中，Fe3+是铁的主要形式，对植物具有毒害作用并且不能被植物利用。在根表面，Fe3+通过铁络合还原酶(FRO2)被还原成低毒性亚铁Fe2+，并且通过Fe3+转运蛋白(ZIP)转运到植物根细胞41。这些研究结果表明，把有毒元素转化为低毒或者无毒元素的形式是一个很好的植物修复策略。3问题与展望近年来，对植物修复的研究集中于对天然金属超富集植物的筛选，其中部分植物已经应用于污染土壤治理。如陈同斌课题组在湖南郴州