布病病原学及血清学

布病病原学及实验室诊断,陕西省疾病预防控制中心陈宝宝,1,2,3,布氏菌的生物学特性,布氏菌的抗原及毒力,布病实验室检验,主要内容,1 布鲁氏菌的生物学特性,1.1 布氏菌的发现及分类,布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌侵入机体，引起的传染变态反应性人畜共患传染病，简称布病。 1887年英国军医Bruce首先从死于“马耳他热”的英国士兵的脾脏中分离出羊种布氏菌。,微生物分类学家将布氏菌归为布鲁氏菌属，下分 6个种19个生物型： 羊种布氏菌（Bvr.melitensis）1，2，3型； 牛种布氏菌（Br.abortus）1，2，3，4，5，6，7，9型； 猪种布氏菌（Br.suis）1，2，3，4，5型； 沙林鼠种布氏菌（Br.neotemae）； 绵羊附睾种布氏菌（Br.ovis）； 犬种布氏菌（Br.canis）,2013年，我省共分离出3株布鲁氏菌，均为羊3型；1991年以前流行优势种型为羊1、2型，1996年后则为羊1、3型 。 陕西省是以羊型菌为主，牛、犬种布鲁氏菌病的混合疫区，流行优势种随时间推移发生了变化。,1.2 形态和培养特征,布氏菌属细菌是一组微小的球杆状革兰氏阴性菌，宽0.30.6m，长0.61.5m，可被所有的碱性染料所着色，吉姆萨染色成紫红色；无芽孢、无鞭毛、无质粒、不形成荚膜。 一般说来，羊种菌最小，牛种菌次之，猪种菌最大。,鉴定布鲁氏菌的染色方法是：,A: 革兰氏染色B: 复红染色C: 亚甲蓝染色D: 吉姆萨染色E: 柯兹洛夫染色,柯兹罗夫斯基提出用0.5%沙黄水溶液染色，加热至出现水泡，水洗后用0.5%孔雀绿或1%煌绿或1%亚甲兰水溶液复染1分钟，布氏菌染成红色，其他细菌染成绿色或蓝色。,营养条件高，生长缓慢，生长所需温度为20-40，最适温度为37 .通常要经过4-6天，有的甚至要经过20-30天（双相培养基）才能长出菌落。,1.3 抵抗力,对物理因子的抵抗力对化学因子的抵抗力不同环境中的抵抗能力对抗生素的敏感性,不 同 温 度 对 布 鲁 氏 菌 影 响,对物理因子的抵抗力,布鲁氏菌对消毒剂的抵抗能力,对化学因子的抵抗力,不同环境中的抵抗能力,现已证明，布鲁氏菌对四环素最敏感，其次是链霉素，而对枯草杆菌肽、多黏菌素B、多黏菌素M素等有很强的抵抗力。,对抗生素的敏感性,2,布氏菌的抗原、毒力,布氏菌的抗原成分十分复杂，存在A、M、G成分。A抗原对牛种布氏菌有特异性，M抗原对羊种布氏菌有特异性，G为两种菌共有。与多种细菌存在共同抗原，因而有血清交叉反应。布氏菌不产生外毒素，只产生内毒素，有致热、致炎作用，可导致休克。,2.1 布氏菌的抗原及内毒素,从种上来说，羊种毒力最强，猪种和牛种次之，犬种的毒力很弱，几乎不引起人致病。 由于菌种毒力等因素的不同，患病后的临床表现也不完全一样。羊种布鲁氏菌患者中毒症状严重，多有典型的发烧、多汗、头痛、虚弱、关节痛、肝脾及睾丸肿大等急性症状。,2.2 布氏菌的毒力,2.3 布病发病过程,3. 布氏菌的实验室检验,实验室要求： 布氏菌是高致病性病原微生物，从危害程度来说为第二类病原微生物。布氏菌的分离培养要在生物安全二级以上实验室中进行。培养样品采集 培养 菌株鉴定 种型鉴定,3.1.1 布氏菌培养检查材料： 人或动物的全血 动物流产胎儿（胎儿的肝脏、肺、胃内容物） 动物脏器、动物胎盘、关节液、阴道分泌物等 新鲜乳汁,3.1.2 双相血培养瓶,采集对象：对急性期和慢性活动期病人未用药前进行血液采集 。,采样方法： 1.使培养瓶恢复至室温、编号； 2. 去掉培养瓶的保护帽，用酒精或碘消毒瓶塞； 3. 用注射器无菌静脉穿刺采集血液5mL，注入血培养瓶；4. 再次消毒瓶塞和保护帽，盖好保护帽； 5. 从一侧到一侧倾斜培养瓶数次，混匀血液和肉汤。,双相血培养瓶培养方法,1. 将瓶子水平放置用肉汤冲洗琼脂5-10分钟以接种琼脂；2. 37直立培养。每隔一天观察一次结果，如未长菌，可通过冲洗再接种一次。30天未出菌，可定为阴性，其血培养瓶经高压灭菌处理；3. 培养后观察肉汤和琼脂：出现下列一种或更多现象者为阳性结果：琼脂上：出现菌落或产生气体。肉汤中：出现浑浊、沉淀或溶血。,3.1.3 布氏菌培养特性生长缓慢，延滞期长，尤其初代分离需氧或微需氧菌，PH 7.2，牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在5-10% CO2环境中培养菌落无色透明，光滑圆形，突起，均质，直径1-2mm液体培养均匀混浊，无菌膜粗糙型菌落较大，生长快,3.1.4 分离培养基,商用培养基：布氏琼脂 布氏肉汤制备培养基：肝浸液琼脂 血琼脂培养基 半固体培养基 胰蛋白眎琼脂培养基 选择性培养基：抗菌素和染料选择性培养基 杆菌肽 放线菌酮 制霉菌素,布氏菌特异的油滴样菌落,布氏琼脂布鲁氏菌菌落,血平皿 布氏菌菌落,布氏菌革兰氏染色,3.1.5 布氏菌菌株鉴定,布氏菌诊断血清凝集试验H2S产生试验，CO2培养依赖试验染料抑菌试验(硫堇，碱性复红)单项特异性血清A、M凝集试验粗糙型（R）血清凝集试验噬菌体裂解试验PCR检测其他方法检测 生化测定 脂肪酸分析 PFGE等,3.1.6 布氏菌噬菌体,我国1981年起从国外引进布氏菌分型噬菌体，对鉴定布氏菌有良好使用价值，可以将布氏菌鉴定到种目前使用的噬菌体有Tb Fi BK2 Wb R R/O R/C,噬菌体对布氏菌的裂解,羊种布氏菌噬菌体裂解,PCR检测,AMOS-PCR检测方法提取DNAPCR扩增电泳,3.2.1 诊断标准 （1）流行病学接触史：密切接触家畜、野生动物、畜产品、 布氏菌培养物等或生活在疫区内的居民（2）临床症状和体征（3）实验室检查：病原菌分离、试管凝集试验、 补体结合试验、抗人球蛋白试验 具备（1）、（2）和（3）项中的任何一项检查阳性 即可确定为布病病人,3.2.2 布氏菌的血清学诊断方法,虎红玻片凝集试验 (RBPT)试管凝集试验 (SAT)抗球蛋白试验 (Coombs试验)含巯基化物处理血清后的凝集试验（2ME 试验）补体结合试验 (CFT)乳环凝集试验 (MRT)酶联免疫吸附试验 (ELISA)金标法荧光偏振方法 （FPA）,虎红玻片凝集实验,原理：利用酸性带色的抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性，主要检查血清中的IgG类抗体。评价：简便快速、容易操作，适用于基层大面积检疫，容易出现假阳性，结果仅供参考.,方法：在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，充分混匀，5min之内观察结果。结果判定：出现可见的凝集反应就判为阳性；否则就为阴性。,注意事项：,血清静止的温度和时间对实验结果有很大的影响，在一定的时间和温度范围内，放置时间越长，温度越高，假阳性率越低；患者空腹血清出现假阳性少；凡是试验中凝集颗粒不规则，大小不匀，片状或絮状，凝集不清澈者，一般为假阳性，否则凝集颗粒规则，大小均匀，凝集清澈者，一般与SAT结果相符，为阳性。,原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体产生特异性抗体，其可与相应的抗原发生特异性结合，在电解质的作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也就是用已知抗原查未知抗体。,试管凝集试验,试管凝集试验,阴性,阳性,0.2ml血清,2.3ml盐水,0.5ml抗原,05ml弃去,1:1600,结果判定： 根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应程度（滴度），特别是50%清亮度（+）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。+ 液体完全透明，菌体成伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集。+ 液体近于完全透明，菌体成伞状沉淀，呈75%凝集。+ 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈50%凝集。+ 液体不透明，管底有很不明显的伞状沉淀，呈25%凝集。 液体不透明，无伞状沉淀。效价以产生50%凝集的血清最高稀释倍数为受检血清的效价。血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀浑浊，两种对照管成立，才可判定试验管，否则重做。人的诊断标准：滴度1100及以上或病程一年以上者滴 度为150及以上为阳性,试管凝集实验的评价,优点： 特异好，实用性、敏感性强；主要检查血清中的IgG和IgM，适合于急性期病人的诊断。缺点：有前带现象，有时出现假阴性结果；产生一定的交叉反应；出结果慢，需要两天,注意事项,受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不能超过10；采血后应于3-4日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低；受检血清静置2h后再进行检查；个别血清会出现前带现象，建议多做几个管，多采用几个稀释度。,抗人球蛋白实验（Coombs）,原理：机体受布氏菌抗原刺激后可产生“完全抗体”和“不完全抗体”。不完全抗体可与相应抗原结合，但不出现可见反应。若将预测不完全抗体的人血清球蛋白作为抗原，注射于另一种动物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗IgG、IgA、IgM）的抗体，再将此球蛋白抗体加入到抗原与不完全抗体复合体中，即可出现可见反应。分为两个阶段:不完全抗体与相应抗原结合为不可见阶段抗原抗体复合物有抗球蛋白抗体凝集而形成可见反应,布氏菌感染后，约在15天出现不完全抗体，3个月左右达到高峰。可持续一年左右。该实验可作为早期和追溯诊断。该试验特异性较强，尤其适用于诊断亚急性和慢性病人，所查抗体主要为IgG、IgA类。一般不作为常规项目，在试管凝集试验为可疑，患者又处于慢性期时，可考虑抗球蛋白试验予以诊断。,适用范围,试管凝集试验阶段 抗球蛋白反应阶段：吸取上项试验的可疑管和全部阴性管，4000转/分离心15分钟，反复洗涤3次。向各管中加入生理盐水0.5ml，混匀，再向各管中加0.5ml一定稀释度的抗球蛋白血清，将反应管置37温箱中20-22小时，取出室温放置2小时后判定结果。判定标准同试管凝集试验,方法,对照,被检血清对照（被检血清+盐水）试管凝集抗原对照（试管抗原+盐水）抗球蛋白血清加生理盐水对照抗球蛋白血清加试管凝集抗原对照抗球蛋白血清加被检血清对照对照全部为阴性时，实验才有意义我国试行的用于诊断人布病标准1:400及以上滴度。,注意事项,在进行Coombs试验时，洗涤抗原很重要，如不认真洗涤，在抗原表面上吸附血清中的某些其他蛋白物质，会干扰下一步加入抗球蛋白血清的反应，掩盖真正结果。一般采用加入抗球蛋白血清1:20-1:50之间的