酵母工程菌表达的几丁质酶分离及酶学性质研究毕业论文.doc

青岛农业大学毕 业 论 文（设计） 题 目：酵母工程菌表达的几丁质酶分离纯化及酶学性质研究 毕业论文（设计）诚信声明本人声明：所呈交的毕业论文（设计）是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，论文中引用他人的文献、数据、图表、资料均已作明确标注，论文中的结论和成果为本人独立完成，真实可靠，不包含他人成果及已获得青岛农业大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖。论文（设计）作者签名： 日期： 年 月 日 毕业论文（设计）版权使用授权书本毕业论文（设计）作者同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文（设计）的复印件和电子版，允许论文（设计）被查阅和借阅。本人授权青岛农业大学可以将本毕业论文（设计）全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本毕业论文（设计）。本人离校后发表或使用该毕业论文（设计）或与该论文（设计）直接相关的学术论文或成果时，单位署名为青岛农业大学。聞創沟燴鐺險爱氇谴净。论文（设计）作者签名： 日期： 年 月 日指 导 教 师 签 名： 日期： 年 月 日毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日期： 使用授权说明本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。酽锕极額閉镇桧猪訣锥。作者签名： 日 期： 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日指导教师评阅书指导教师评价：一、撰写（设计）过程1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神 优 良 中 及格 不及格2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度 优 良 中 及格 不及格3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问题的能力 优 良 中 及格 不及格4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计方案的合理性 优 良 中 及格 不及格5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况 优 良 中 及格 不及格二、论文（设计）质量1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格三、论文（设计）水平1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格建议成绩： 优 良 中 及格 不及格（在所选等级前的内画“”）指导教师： （签名） 单位： （盖章）年 月 日评阅教师评阅书评阅教师评价：一、论文（设计）质量1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格二、论文（设计）水平1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格建议成绩： 优 良 中 及格 不及格（在所选等级前的内画“”）评阅教师： （签名） 单位： （盖章）年 月 日教研室（或答辩小组）及教学系意见教研室（或答辩小组）评价：一、答辩过程1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况 优 良 中 及格 不及格2、对答辩问题的反应、理解、表达情况 优 良 中 及格 不及格3、学生答辩过程中的精神状态 优 良 中 及格 不及格二、论文（设计）质量1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格三、论文（设计）水平1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格评定成绩： 优 良 中 及格 不及格（在所选等级前的内画“”）教研室主任（或答辩小组组长）： （签名）年 月 日教学系意见：系主任： （签名）年 月 日目录摘要1厦礴恳蹒骈時盡继價骚。Abstract.2茕桢广鳓鯡选块网羈泪。引言3鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴。1 材料与方法4籟丛妈羥为贍偾蛏练淨。1.1 实验材料4預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴。1.1.1 供试菌株4渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦。1.1.2 试剂4铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡。1.1.3 培养基及有关溶液的配制5擁締凤袜备訊顎轮烂蔷。1.1.4 主要仪器设备7贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷。1.2 实验方法7坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚。1.2.1 酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导分泌表达7蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘。1.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）标准曲线的建立7買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄。1.2.3 酵母工程菌产酶曲线的测定8綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴。1.2.4 几丁质酶的分离纯化8驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦。1.2.5 几丁质酶的SDS-PAGE检测8猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑。1.2.6 几丁质酶的酶学性质9锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔。2 结果与分析10構氽頑黉碩饨荠龈话骛。2.1 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线10輒峄陽檉簖疖網儂號泶。2.2 酵母工程菌产酶曲线的测定11尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅。2.3 几丁质酶的SDS-PAGE检测11识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒。2.4 几丁质酶反应的最适温度12凍鈹鋨劳臘锴痫婦胫籴。2.5 几丁质酶反应的最适pH值13恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦。2.6 几丁质酶的热稳定性13鯊腎鑰诎褳鉀沩懼統庫。2.7 几丁质酶的pH稳定性13硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹。2.8 不同金属离子对酶活性的影响14阌擻輳嬪諫迁择楨秘騖。2.9 变性剂、蛋白抑制剂和有机溶剂对几丁质酶活性的影响14氬嚕躑竄贸恳彈瀘颔澩。2.10 几丁质酶底物特异性测定15釷鹆資贏車贖孙滅獅赘。3 结论与讨论15怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉。3.1 结论15谚辞調担鈧谄动禪泻類。3.2 讨论16嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩。3.3 展望17熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库。致谢17鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞。参考文献18纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛。酵母工程菌表达的几丁质酶分离纯化及酶学性质研究生物科学专业 李云翔 指导教师 咸洪泉摘要：本文转几丁质酶基因的酵母工程菌株GS-tachit1-K进行诱导分泌表达，分离纯化发酵液中的几丁质酶，测定它的酶学性质。结果表明该酶的最适反应温度为50 ，在35 以下相对稳定，最适反应pH值为5.5，在pH 4.5-6.5之间稳定。Cu2+、Ag+、Hg2+ 和SDS对酶活性有明显的抑制作用，该酶能特异性降解胶体几丁质。本研究结果为该酶的研究和开发利用提供了科学依据。颖刍莖蛺饽亿顿裊赔泷。关键词：酵母工程菌；表达；几丁质酶；酶学性质Purification and Characterization of Chitinase Secreted by Yeast Engineering Strain濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。Student majoring in bioscience Li Yunxiang Tutor Xian HongquanAbstract: In this work, the yeast engineering strain GS-tachit1-K transformed with chitinase gene was induced to express, purify the Chitinase of fermentation, to determine its enzymology characterization. It is proved that the optimal temperature for the chitinase was 50 and the chitinase activity was relatively stable when the temperature was under 35. The optimal pH value was 5.5 and the chitinase activity was stable when the pH value was between 4.5 and 6.5. The enzymatic activity was inhibited evidently by Cu2+, Ag+, Hg2+ and SDS. The protein had a specific activity to degrade colloidal chitin. This work supplies science evidence for the research and development of the chitinase.銚銻縵哜鳗鸿锓謎諏涼。Key words: Yeast Engineering Strains; Express; Chitinase; Enzymatic Characterization挤貼綬电麥结鈺贖哓类。引言几丁质（chitin）又称甲壳素、甲壳质或几丁聚糖，是N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-Acetyl-D-Glucosamine，简称NAG）以-1,4糖苷键聚合而形成的直链形大分子，广泛存在于自然界中，主要来源于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软件动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌（如酵母、霉菌）的细胞壁中，是除蛋白质外地球上数量最大的含氮天然有机化合物。据估计每年自然界中几丁质的生物合成量约100亿吨，其中可提取几丁质20亿吨以上，是仅次于纤维素的自然界第二大天然生物有机资源1。国际医学营养食品学会将这种物质定义为除糖、蛋白质、脂质、维生素和矿物质五大生命要素后的第六大生命要素，因此越来越受到广泛关注。然而自然界中的几丁质几乎以相等的速率产生和消失，在这个过程中，微生物起了非常重要的作用。细菌和真菌所分泌的几丁质酶可将几丁质中的-1,4糖苷键水解，最终分解为N-乙酰-D-葡萄糖胺。几丁质也可经脱乙酰作用形成脱乙酰几丁质（chitosan），脱乙酰几丁质又可进一步被脱乙酰几丁质酶（chitosanase）分解成氨基葡萄糖2。赔荊紳谘侖驟辽輩袜錈。目前几丁质生产一般是采用化学方法降解，这也是工业化生产中最早、最常用的方法。但由于化学方法降解几丁质条件苛刻、稳定性差、处理繁琐、污染严重，使得无法对它的进行大规模开发利用。温和、高效、无污染的生物酶法已成为研究的热点3。 塤礙籟馐决穩賽釙冊庫。几丁质酶（chitinase）是一类生物代谢的具有广泛用途的水解酶，它能催化水解真菌细胞壁中的几丁质，从而抑制真菌生长与繁殖4。早在1905年Benecke就首次分离到了能利用几丁质作为营养物质的微生物，并定名为Bacillus chitinovirous （溶几丁质芽孢杆菌），但当时并没有关于几丁质酶活性方面的直接证据。1921年Folpmers发现分解几丁质的细菌和放线菌在含几丁质的琼脂上形成透明圈，从而证明这些培养物内有水溶性的几丁质酶存在5。此后，人们又相继从多种微生物（包括细菌、放线菌、真菌）、植物及动物中分离到几丁质酶，并对几丁质酶的理化特性及生物学活性进行了大量的研究。随着几丁低聚糖、几丁寡糖在抗菌、抗肿瘤作用方面的研究不断深入，作为制备几丁低聚糖、几丁寡糖的重要工具几丁质酶受到广泛关注，同时几丁质酶还能抑制真菌生长、防治作物病虫害。因此几丁质酶基础理论和应用研究日益受到重视，前景广阔。裊樣祕廬廂颤谚鍘羋蔺。几丁质酶可以根据不同的标准进行分类。根据作用方式和酶解产物，几丁质酶可以分为：内切几丁质酶（endochitinase）、外切几丁质酶（exochitinase）和几丁二糖酶（chitbiosidase）。根据反应的最适pH不同，可将其分为酸性、中性与碱性几丁质酶。而根据几丁质酶分泌性质的不同，又可以将其分为胞外酶与胞内酶。仓嫗盤紲嘱珑詁鍬齊驁。 几丁质酶应用范围非常广，具有巨大的开发潜力，对工农业生产、自然资源的利用、生物防治、环境保护、医药卫生等都具有重要的社会效益和经济价值。绽萬璉轆娛閬蛏鬮绾瀧。近年来，微生物几丁质酶的研究备受关注，但天然酶在生物体内的含量一般较低且容易受到底物和环境的影响，这对几丁质酶大量提取和制备造成了困难。随着DNA重组技术不断发展，通过构建遗传工程菌株，克隆各种天然酶的基因，使其在微生物系统中得以高效表达，从而克服上述困难。骁顾燁鶚巯瀆蕪領鲡赙。早期研究人员利用大肠杆菌来表达几丁质酶，但其表达率低且产生的酶多数不能分泌到胞外。酵母表达系统因为其具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，而受到越来越多的重视、利用。瑣钋濺暧惲锟缟馭篩凉。毕赤酵母是甲醇营养型酵母，它克服了酿酒酵母表达系统的诸多不足，成为国内外广泛应用的大量生产外源真核蛋白的较为理想的表达系统。鎦诗涇艳损楼紲鯗餳類。本文对转几丁质酶基因的酵母工程菌株进行诱导分泌表达，分离纯化发酵液中的几丁质酶，测定它的酶学性质，为以后该酶的大规模开发利用提供科学依据。栉缏歐锄棗鈕种鵑瑶锬。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 供试菌株 酵母工程菌GS-tachit1-K、转pPIC9K空载体的毕赤酵母GS115菌株（未导入几丁质酶基因）由青岛农业大学农业微生物实验室提供。辔烨棟剛殓攬瑤丽阄应。1.1.2 试剂酵母基本氮源（YNB）、D-生物素、甘氨酸购自BBI公司；蛋白质分子量标准（低）购自TaKaRa公司；几丁质、壳聚糖（Chitosan）、N-乙酰氨基葡萄糖购自上海生工；甘油，甲醇，HCl，95 % 乙醇，冰醋酸，无水乙醇，NaOH溶液，苯酚，-巯基乙醇，甲醇，乙醇，异丙醇，丙三醇；柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、巴比妥，硫酸铵，酵母提取物，胰蛋白胨，丙烯酰胺（Acr），双丙烯酰胺（Bis）， 三羟甲基氨基甲烷（Tris），十二烷基硫酸钠（SDS），过硫酸铵（AP），TEMED，琼脂，溴酚蓝，考马斯亮蓝R-250，3,5-二硝基水杨酸（DNS），酒石酸钾钠，无水亚硫酸钠，L-半胱氨酸，K3PO4，GuSO45H2O，CaCl2，MnCl2，FeSO47H2O，ZnSO4，BaCl2，KCl，NaCl，AgNO3，MgSO4，NH4NO3，HgCl2，EDTA，Na2SO4等化学试剂均为国产分析纯。峴扬斕滾澗辐滠兴渙藺。1.1.3 培养基及有关溶液的配制（1）培养基贮存液配制10YNB（13.4 % 酵母基本氮源，无氨基酸含硫酸铵）：将53.6 g YNB溶于400 mL 的蒸馏水中，过滤除菌后4 保存备用。詩叁撻訥烬忧毀厉鋨骜。500B（0.02 % Biotin，生物素）：将2 mg生物素溶于10 mL蒸馏水中，过滤除菌后4 保存备用。则鯤愜韋瘓賈晖园栋泷。10GY（10 % Glycerol，甘油）：将10 mL甘油与90 mL蒸馏水混合，高压灭菌20 min后4 保存备用。胀鏝彈奥秘孫戶孪钇賻。1mol/L K3PO4：将84.8 g K3PO4溶于400 mL蒸馏水中，调节pH至6.0，高压灭菌20 min。鳃躋峽祷紉诵帮废掃減。10M（5 % Methanol，甲醇）：将15 mL甲醇与285 mL蒸馏水混合，过滤除菌后4 保存备用。稟虛嬪赈维哜妝扩踴粜。（2）常用培养基的制备BMGY培养基：称取5 g酵母提取物，10 g 胰蛋白胨，溶于350 mL蒸馏水中，高压灭菌20 min，然后冷却至室温，再加入50 mL 10YNB、1 mL 500B、50 mL 10GY、50 mL 1 mol/L K3PO4（pH 6.0），最后4 保存备用。陽簍埡鲑罷規呜旧岿錟。BMMY培养基：称取5 g酵母提取物，10 g蛋白胨，溶于350 mL蒸馏水中，高压灭菌20 min，然后冷却至室温，再加入50 mL 10YNB、1 mL 500B、50 mL 10M、50 mL 1 mol/L K3PO4（pH 6.0），最后4 保存备用。沩氣嘮戇苌鑿鑿槠谔應。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制30 % 凝胶储液：称取29.1 g Acr，0.9 g Bis，加100 mL蒸馏水溶解。分离胶缓冲液：称取36.3 g Tris，48 mL 1 mol/L HCl，加100 mL蒸馏水溶解。钡嵐縣緱虜荣产涛團蔺。浓缩胶缓冲液：称取5.98 g Tris，48 mL 1 mol/L HCl，加100 mL蒸馏水溶解。懨俠劑鈍触乐鹇烬觶騮。电极缓冲液：称取1.5 g SDS，9 g Tris，43.2 g甘氨酸，加1500 mL蒸馏水溶解。謾饱兗争詣繚鮐癞别瀘。1 mol/L、pH 8.0 Tris-HCl缓冲液：称取121.1 g Tris，加800 mL蒸馏水溶解，再加70 mL 1 mol/L HCl，混匀后调节pH至6.8，最后加蒸馏水定容至1000 mL。呙铉們欤谦鸪饺竞荡赚。样品缓冲液：取1 mL Tris-HCl缓冲液，0.4 g SDS，0.02 g溴酚蓝，2 mL甘油，0.2 mL -巯基乙醇，加10 mL 蒸馏水溶解。莹谐龌蕲賞组靄绉嚴减。10 % 过硫酸铵：称取1 g过硫酸铵，加10 mL 蒸馏水溶解（现用现配）。固定液：取45 mL 95%乙醇，10 mL 冰醋酸，加100 mL 蒸馏水。染色液：称取0.75 g考马斯亮蓝R-250，加入135 mL 95%乙醇，30 mL冰醋酸，加300 mL 蒸馏水，混匀，用滤纸过滤。麸肃鹏镟轿騍镣缚縟糶。脱色液：取70 mL 冰醋酸，200 mL 乙醇，加1000 mL 蒸馏水。（4）胶体几丁质的制备称取10 g片状几丁质（剪碎）置于500 mL三角瓶中，加100 mL浓盐酸浸泡，然后放入37 摇床中至几丁质完全溶解，4 过夜。納畴鳗吶鄖禎銣腻鰲锬。向溶液中加入500 mL 50 % 乙醇，不断搅拌至析出胶体，然后5000 r/min离心5 min，弃掉上清液。風撵鲔貓铁频钙蓟纠庙。在胶体中再加蒸馏水，搅拌后5000 r/min离心5 min，重复上述过程至pH约为7.0。（5）DNS的制备取3.15 g DNS，加500 mL水，45 水浴溶解。逐步加入NaOH溶液（20 g 溶于水），不断搅拌至溶液清澈透明。然后加入91 g酒石酸钾钠，2.5 g苯酚和2.5 g无水亚硫酸钠。45 水浴，同时加水不断搅拌至全溶。停止加热，冷却至室温，用水定容至1000 mL 。将液体储存于棕色瓶，避光保存7 d， 备用。（6）广泛pH缓冲液称取6.008 g柠檬酸 、3.893 g磷酸二氢钾 、1.769 g硼酸 、5.266 g巴比妥，加1 L 蒸馏水溶解。灭嗳骇諗鋅猎輛觏馊藹。1.1.4 主要仪器设备Anke DL-5-B低速大容量离心机，Anke TGL-16C高速台式离心机，恒温水浴锅，双层全温摇床（上海福玛实验设备有限公司），UV-2000紫外可见分光光度计，DYY-12型电脑三恒多用电泳仪、WD-9412A型恒温循环器、WD-9405A型脱色摇床（北京市六一仪器厂），夹心式垂直板电泳槽。铹鸝饷飾镡閌赀诨癱骝。1.2 实验方法1.2.1 酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导分泌表达（1）挑取GS-tachit1-K单菌落，接种到含25 mL BMGY培养基的250 mL摇瓶中，用纱布封口，放到摇床中，28 、130 r/min 振荡培养3 d至对数生长期（OD600为2-6）。攙閿频嵘陣澇諗谴隴泸。（2）将BMGY培养物以5000 r/min离心10-15 min，回收酵母细胞，弃掉上清液，将细胞重悬于BMMY培养基中，至OD600值为1.0-2.0（约100200 ml）。趕輾雏纨颗锊讨跃满賺。（3）将培养液置于500 mL摇瓶中，用双层纱布封口，在摇床中28-30 继续培养并开始诱导表达（注意温度不要超过30 ）。夹覡闾辁駁档驀迁锬減。（4）诱导开始后，每天补加100 % 甲醇使终浓度维持在0.5 %。（5）诱导开始后，每天取样一次，直至第7天。每次取样3 mL于1.5 mL离心管中-20 保存。样品用于制作产酶曲线和蛋白电泳。视絀镘鸸鲚鐘脑钧欖粝。1.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）标准曲线的建立表1 NAG浓度的配制Tab. 1 Standard curve of NAG项目01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NAG标准液（mL）0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 NAG的量（mg）0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 蒸馏水（mL）1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 DNS（mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 配制1 g/mL N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）溶液。取11支25 mL按(表1)加入试剂，将各管混匀，沸水浴煮沸10 min。取出后立即用冷水冷却至室温，再向每试管加入3 mL蒸馏水，混匀。测540 nm处的吸光值，以蒸馏水为空白调零，每组3个重复。以NAG浓度（mg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线。1.2.3 酵母工程菌产酶曲线的测定将保存的粗酶液样品取出，几丁质酶活性测定参照Antoni和Masarus方法6,7，并加以改进。1 mL胶体几丁质与稀释的0.5 mL 酶液放于50 水浴保温1 h，上清液中的还原糖采用DNS法测定。根据标准曲线得出还原糖的含量，然后计算酶活。偽澀锟攢鴛擋緬铹鈞錠。酶活性单位（U）定义为：每分钟水解几丁质产生1 mg还原糖所需的酶蛋白量8。1.2.4 几丁质酶的分离纯化1.2.4.1 粗酶液的制备根据分析最佳收获时间为7 d。第7天终止发酵收集发酵液。将发酵液5000 r/min离心10-15 min，收集上清液即为粗酶液。 緦徑铫膾龋轿级镗挢廟。1.2.4.2 硫酸铵沉淀向提取的粗酶液中加入固体硫酸铵至80%饱和度，冰浴后过夜。以5000 r/min离心15 min，收集沉淀。用适量50 mmol/mL pH 8.0 Tris-HCl缓冲液溶解，并在相同缓冲液中透析2-3 d，取少量溶液加BaCl2检测是否透析完全。透析完全后，将透析液以5000 r/min离心15 min，取上清液，-80保存。騅憑钶銘侥张礫阵轸蔼。1.2.5 几丁质酶的SDS-PAGE检测对纯化酶液和1-7 d的粗酶液进行SDS-PAGE，测定表观几丁质酶的分子量。（1）分离胶凝胶液与浓缩胶凝胶液的配制12 %分离胶凝胶液：取6.0 mL 30 % 凝胶储液，3.8 mL分离胶缓冲液，0.15 mL 10 % SDS，5.0 mL ddH2O，30 l 10 % 过硫酸铵，30 l TEMED，混匀。疠骐錾农剎貯狱颢幗騮。3 % 浓缩胶凝胶液：取0.5 mL 30 % 凝胶储液，0.7 mL浓缩胶缓冲液，0.15 l 10 % SDS，3.75 mL ddH2O，15 L 10 % 过硫酸铵，10 L TEMED，混匀（现配现用）。镞锊过润启婭澗骆讕瀘。（2）电泳操作9按照顺序安装玻璃板，然后沿两板缝隙加入15 % 融化的琼脂，待琼脂凝固后加入现配的12 % 分离胶凝胶液，至胶面距低板边缘3 cm左右，然后用滴管在胶面上轻轻铺注1 cm水层，垂直放置胶板，室温下放置30 min待胶凝聚。凝聚后用滤纸吸出胶面上的水。榿贰轲誊壟该槛鲻垲赛。将3 % 浓缩胶凝胶液迅速注入分离胶上层，使液面与低板边缘齐平，插入梳子。室温下放置2 h，待其完全凝聚。凝聚后小心拔出梳子，在玻璃板两侧倒入电极缓冲液。邁茑赚陉宾呗擷鹪讼凑。将1-7 d的粗酶液离心，取50 L上清再加入50 L上样缓冲液，对照组用提纯的酶液。混匀后在沸水中煮10 min，冷却后用微量加样器将25 L样品和低分子量标准蛋白质分别注入加样孔中。嵝硖贪塒廩袞悯倉華糲。将电泳槽与电泳仪相连，电压保持100 V进行电泳，至样品迁移至玻璃板下端1 cm时停止电泳。（3）染色及脱色将电泳完毕的凝胶取出，用去离子水冲洗，然后放到考马斯亮蓝R-250染色液中染色，过夜。弃去染色液，凝胶冲洗后置于固定液中固定。将凝胶置于500 mL脱色液中脱色，至胶脱色完全。脱色后，将胶板置于去离子水中室温下保存。（4） 分子量测定已知标准分子量蛋白质（低）各电泳条带的分子量，通过电泳图估计几丁质酶的分子量10。1.2.6 几丁质酶的酶学性质1.2.6.1 几丁质酶反应的最适温度将酶反应体系分别置于30 、35 、40 、45 、50 、55 、60 、65 、70 、75 和80 下反应1 h，DNS法检测几丁质酶的活性，确定酶反应的最适温度。最高的酶活力定义为100，分别计算不同温度条件下几丁质酶的相对酶活性（即在不同温度下的酶活性占最高酶活性的百分比）。 该栎谖碼戆沖巋鳧薩锭。1.2.6.2 几丁质酶反应的最适pH值用广泛pH缓冲液将酶反应体系pH值调为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0测定几丁质酶活性。将最高的酶活力定义为100 ，分别计算不同pH值条件下几丁质酶的相对酶活性（方法同上）。劇妆诨貰攖苹埘呂仑庙。1.2.6.3 几丁质酶的热稳定性先将酶液分别置于30 、35 、40 、45 、50 和55 下保温不同的时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min）后，立即在0 冰浴中冷却，然后加入几丁质在50 反应1 h ，测定几丁质酶活性，以剩余的酶活性作为酶的热稳定性的指标。将最高的酶活力定义为100，分别计算不同温度条件下几丁质酶的相对酶活性。臠龍讹驄桠业變墊罗蘄。1.2.6.4 几丁质酶的pH值稳定性将酶液分别在pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的缓冲液中处理1 h后，然后再将反应体系的pH值调至5.5，测定剩余的酶活性。将最高的酶活力定义为100，分别计算不同pH值条件下几丁质酶的相对酶活性。鰻順褛悦漚縫冁屜鸭骞。1.2.6.5 不同金属离子对酶活性的影响在几丁质酶反应体系中加入不同的金属离子（Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+、K+、Na+、Ag+、Mg2+、NH4+ 、Hg+）并使其最终浓度为0.05 mol/L，在50 下反应1 h后，以反应体系中不加金属离子的酶活性为100，分别测定加入不同金属离子后反应体系中几丁质酶的相对酶活性。穑釓虚绺滟鳗絲懷紓泺。1.2.6.6 变性剂、蛋白抑制剂和有机溶剂对酶活性的影响在几丁质酶反应体系中加入不同的变性剂、蛋白抑制剂和有机溶剂，使SDS终浓度分别为0.1 % 和1.0 %(w/v)，尿素终浓度分别为0.5 mol/L和3.0 mol/L，EDTA、-巯基乙醇终浓度为1 mmol/L和10 mmol/L，Na2SO4、L-半胱氨酸终浓度为1 mmol/L和5 mmol/L，而甲醇、乙醇、异丙醇、丙三醇终浓度为1 %和5 %，在50 下反应1 h后，以反应体系中不加任何试剂的酶活性为100 %，分别测定加入不同变性剂、蛋白抑制剂和有机溶剂后反应体系中几丁质酶的相对酶活性。隶誆荧鉴獫纲鴣攣駘賽。1.2.6.7 几丁质酶底物特异性测定用几丁质酶液分别水解2 %的不同底物（胶体几丁质、粉状几丁质、壳聚糖），每组做三个重复，DNS法测定几丁质酶对不同底物的水解活性。浹繢腻叢着駕骠構砀湊。2 结果与分析2.1 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线以N-乙酰氨基葡萄糖的含量为横坐标，在540 nm波长下测定OD540值为纵坐标，作出标准曲线（图1），回归方程为y = 2.1174x 0.0859。 鈀燭罚櫝箋礱颼畢韫粝。图1 NAG标准曲线Fig. 1 Standard curve of NAG 2.2 酵母工程菌产酶曲线的测定根据酵母工程菌株1-7 天的产酶结果绘制产酶曲线。结果如图2-2，随着诱导时间的延长，单位体积（mL）的几丁质酶活性不断增加，5-7 天趋于稳定。因此，选取第7天的发酵液进行酶学性质研究。惬執缉蘿绅颀阳灣熗鍵。图2酵母工程菌GS-tachit1-K的产酶曲线Fig. 2 The curve of activities to times for GS-tachit1-K 贞廈给鏌綞牵鎮獵鎦龐。2.3 几丁质酶的SDS-PAGE检测对纯化酶液11、酵母工程菌1-7 天的粗酶液进行SDS-PAGE检测，以转pPIC9K空载体的毕赤酵母GS115菌株的表达产物为对照。结果如图3所示，标准分子量蛋白（低）分子量分别为97.4、66.2、43.0、31.0、20.1和14.4 KDa，纯化后酶液有1条清晰地电泳条带，分子量约为41KDa，说明GS-tachit1-K经诱导表达产生了几丁质酶且分离纯化的方法有效。随着时间的延长，表达量逐渐增加，5-7天趋于稳定，与测定的产酶曲线相一致。 嚌鲭级厨胀鑲铟礦毁蕲。图3酵母工程菌表达几丁质酶的SDS-PAGE分析纯：纯化后几丁质酶酶液；M：标准分子量蛋白（低）；1-7：1-7天的粗酶液；CK：转pPIC9K空载体的毕赤酵母GS115菌株的表达产物薊镔竖牍熒浹醬籬铃騫。Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression chitinase from GS-tachit1-K齡践砚语蜗铸转絹攤濼。Pure: enzyme solution of purified chitinase; M: standard molecular weight proteins (low); 1-7: the crude extract from 1 to 7 day; CK: the expression products of Pichia pastoris GS115 strain with pPIC9K vector绅薮疮颧訝标販繯轅赛。2.4 几丁质酶反应的最适温度从图4中看出，GS-tachit1-K菌株表达的几丁质酶在30-55 条件下，都具有较高的活性，其最适反应温度为50 。当温度超过60 时，酶活性降低，在80 时，酶活性降低至30 %。饪箩狞屬诺釙诬苧径凛。图4几丁质酶反应的最适温度Fig. 4 The optimum temperature of chitinase reaction烴毙潜籬賢擔視蠶贲粵。2.5 几丁质酶反应的最适pH值几丁质酶的最适pH试验结果如图5，GS-tachit1-K菌株几丁质酶在pH 4.5-6.5之间都具有较高的活性，其中最适反应pH为5.5，当pH大于7.0时，酶活性迅速降低。在pH 10.0时酶活性小于20 %。鋝岂涛軌跃轮莳講嫗键。图5几丁质酶反应的最适pHFig. 5 The optimum pH value of chitinase reaction2.6 几丁质酶的热稳定性热稳定性试验结果见图6，几丁质酶在35 以下是比较稳定的，50 下处理1 h，残余酶活为12 %，55 处理10 min后几丁质酶没有活性。撷伪氢鱧轍幂聹諛詼庞。图6几丁质酶的热稳定性Fig. 6 The thermostability of chitinase2.7 几丁质酶的pH稳定性几丁质酶的pH稳定性测定结果如图7，在pH 4.5-6.5之间酶稳定，最适pH值为5.5。当pH超过7.0时酶活性迅速降低，在pH为8.5时，几丁质酶基本没有活性。说明几丁质酶在酸性条件下稳定。踪飯梦掺钓貞绫賁发蘄。图7几丁质酶的pH稳定性Fig. 7 The pH stability of chitinase2.8 不同金属离子对酶活性的影响金属离子对酶活性影响如图8所示，Fe2+、 Ba2+、K+、Na+对酶活性无明显作用，而Cu2+、Ca2、Mn2+、Zn2+、Ag+、Mg2+、NH4+、Hg2+对几丁质酶活性有不同程度的抑制作用。其中，Cu2+、Ag+、Hg2+对几丁质酶的抑制作用明显。婭鑠机职銦夾簣軒蚀骞。 图8不同金属离子对几丁质酶活性的影响Fig. 8 Effects of different metallicions on chitinase activity譽諶掺铒锭试监鄺儕泻。2.9 变性剂、蛋白抑制剂和有机溶剂对几丁质酶活性的影响在酶的反应体系中加入不同浓度的变性剂、蛋白酶抑制剂和有机溶剂后，对几丁质酶活性的作用如下表2，SDS的终浓度为0.1 %、1 % (w/v)都对酶有很强的抑制作用，说明SDS能使几丁质酶蛋白分子间的氢键断裂，使分子去折叠，破坏蛋白分子结构，使酶失活。此外，终浓度为3 mol/L的尿素和10 mmol/L的-巯基乙醇也对酶有抑制作用。其中，尿素破坏氢键使酶蛋白分子结构松散，而-巯基乙醇能使二硫键还原，破坏蛋白质三级或四级结构，这些都使酶失活。俦聹执償閏号燴鈿膽賾。表2各种试剂对几丁质酶活性的影响Tab. 2 Effects of different regents on chitinase activity 缜電怅淺靓蠐浅錒鵬凜。试剂浓度相对酶活（%）试剂浓度相对酶活（%）SDS0.1%w/v24.26 L-半胱氨酸1mmol/L100.35 1%w/v17.61 5mmol/L96.17 尿素0.5mol/L94.32 甲醇1%99.91 3mol/L36.54 5%92.21 EDTA1mmol/L97.05 乙醇1%99.47 10mmol/L95.11 5%90.80 -巯基乙醇1mmol/L91.19 异丙醇1%98.68 10mmol/L22.81 5%82.65 Na2SO41mmol/L100.00 丙三醇1%99.38 5mmol/L95.33 5%88.37 2.10 几丁质酶底物特异性测定几丁质酶底物特异性试验结果如下表3，几丁质酶对胶体几丁质有水解活性，而对粉末状几丁质和壳聚糖无水解活性,说明该几丁质酶特异性降解胶体几丁质。骥擯帜褸饜兗椏長绛粤。表3几丁质酶对不同底物的酶活Tab. 3 Activities of chitinase on different matter底物酶活（U/mL）胶体几丁质5.32 粉末几丁质0.00 壳聚糖0.00 3 结论与讨论3.1 结论酵母工程菌GS-tachit1-K表达的几丁质酶的SDS-PAGE检测证明，经几丁质酶诱导表达和有效地分离纯化，获得了单一蛋白质，其分子量约为41KDa。 癱噴导閽骋艳捣靨骢鍵。 该几丁质酶的最适反应温度为50 ，最适pH值为5.5。在 温度35 以下、pH 4.5-6.5之间，几丁质酶具有较高的稳定性。底物特异性试验证明该几丁质酶特异性降解胶体几丁质。鑣鸽夺圆鯢齙慫餞離龐。Fe2+、Ba2+、K+、Na+对酶活性无明显作用，而Cu2+、Ca2、Mn2+、Zn2+、Ag+、Mg2+、NH4+、Hg2+对几丁质酶活性有不同程度的抑制作用。 此外，SDS、尿素、-巯基乙醇也对几丁质酶有抑制作用。因此，在应用过程中应避免上述金属离子和试剂的干扰。榄阈团皱鹏緦寿驏頦蕴。3.2 讨论（1）几丁质酶的分子量 微生物几丁质酶的分子量一般为10-100 KD。据报道，粘质沙雷氏菌（S. marcescens）表达五种几丁质酶，其分子量分别为21、36、48、52 和57KDa，而红色链霉菌（S. erythraeus）则仅产生一种12,13，分子量为30KDa。本试验研究的酵母工程菌GS-tachit1-K产生的几丁质酶经SDS-PAGE检测证明为单一蛋白质，分子量约为41KDa，与报道的几丁质酶的分子量不同。产生这种现象的原因是因为微生物几丁质酶的来源不同，其酶的性质有很大差异。逊输吴贝义鲽國鳩犹騸。（2）几丁质酶的酶学性质微生物几丁质酶最适温度一般在40-50 ，pH一般认为在3-11之间，但绝大多数微生物几丁质酶适于4-6的偏酸性环境 14。而本试验研究的酵母工程菌GS-tachit1-K产生的几丁质酶反应的最适温度为50 ，最适pH值为5.5，说明它与大多数微生物几丁质酶反应所需条件相近。幘觇匮骇儺红卤齡镰瀉。热稳定性实验中几丁质酶在35 以下是稳定的，证明该酶不具有较高的热稳定性。pH稳定性