Flow Cytometry.ppt

流式细胞术FlowCytometry Sourcesofinformation FlowCytometryandSorting 2nded M R Melamed T Lindmo M L Mendelsohn eds Wiley Liss NewYork 1990 FlowCytometry InstrumentationandDataAnalysis M A VanDilla P N Dean O D Laerum M R Melamed eds AcademicPress London 1985PracticalFlowCytometry3ndedition 1994 H Shapiro AlanR Liss NewYork IntroductiontoFlowCytometry J Watson CambridgePress 1991 MethodsinCellBiology Cytometry 3rdEd 2000 Darzynkiewicz Robinson Crissman EditorsFlowCytometry FirstPrinciples 2ndEd AliceLongobardiGivan Wiley Liss 2001 Moreinformationonflowcytometrybookscanbefoundonourwebsiteat http www cyto purdue edu flowcyt books bookindx htm MethodsandPracticalAssistance Forhelpwithprotocolsthereareseveralchoicesincluding TheHandbookofFlowCytometryMethodsCurrentProtocolsinCytometry AdditionalSources PowerpointpresentationsreferencesasJ PaulRobinson JPR RobertMurphry RFM CarletonStewart CS Websourcesofthesepresentationare http www cyto purdue edu flowcyt educate pptslide htmhttp www cyto purdue edu flowcyt educate1 htm AdditionalSourcesincludethePurdueCytometryCD ROMseries Vol 1Vol 2Vol 3Vol 4Vol 5Microscopy1 Volumes6and7 Cytomics arealsoavailableasof2002and2003 Publicationsusingthekeyword flowcytometry from Thegrowthofdiagnosticandphenotypicdeterminationtechnologies 123 622references Nov13 2011 7581 FlowCytometry是一项综合众多不同学科的先进技术 综合了生物学 生物技术 计算机科学 电子工程学 流体力学 激光技术 高等数学 分子生物学 临床医学 有机化学和物理学等学科的知识 它是众多学科知识的结晶 现代流式细胞术 由于应用了单克隆抗体技术 定量细胞化学以及定量荧光细胞化学 使其在免疫学 细胞学 生物学 临床医学 药物学等许多学科领域的应用有了突飞猛进的发展 Introduction When History1 Moldovan A 1934 Photo electrictechniqueforthecountingofmicroscopocalcells Science80 188 189Firstinstrumentthatcouldbedescribedasaflowcytometer GlasstubemountedonmicroscopestagNarrowtubes blockages interferenceWidertubes errors Moldovan用光电仪记录了流过一根毛细管的细胞 When History2 Gucker F T etal 1947 aphotoelectriccounterforcolloidalparticles Am J Chem 69 2422 31Designedtotestefficiencyofgasmaskfiltersvsparticlese g sporesFilteredairusedinsteadofsheathfluidFordheadlightusedaslightsource Theprinciple offlowcytometry shouldhavewideapplicationin bacteriology Gucker研制了烟雾微粒计数器 When History3 Crosland Taylor P J 1953 Adeviceforcountingsmallparticlessuspendedinafluidthroughatube Nature171 37 38IntroducedhydrodynamicfocusingSuccessfullycountedbloodcellsWallaceCoulter发明了在悬浮液中计数粒子的方法Coultecounterpatentedin1953CountsindividualcellsinflowElectricalratherthanopticalsignal 流式细胞仪的雏形 Crosland Taylor应用分层鞘流原理 成功地设计了红细胞的光学自动计数器 When History4 Kamentsky 1965 Spectrophotometer newinstrumentforultrarapidcellanalysis Science150 630 631CustomquartzflowcellFirstmeasurementmeasuredbyabsorptionof254nmlightQuantifiedDNAcontentandsizeof500cells secGoodreproducibility Kamentsky提出设想 用分光光度计定量细胞成分 结合测定值进行细胞分类 并首次用二维组方图显示和分析多参数 将计算机与流式细胞装置结合 产生了第一代流式细胞仪 Kamentsky Kamentsky Bio PhysicsSystems 1970commercialcytometer the Cytograph He Nelasersystemat633nmforscatter andextinction supposedlythefirstcommercialinstrumentincorporatingalaser ItcouldseparateliveanddeadcellsbyuptakeofTrypanblue Afluorescenceversioncalledthe Cytofluorograph followedusinganaircooledargonlaserat488nmexcitation 1970CytographpresentlyatthePurdueUniversityCytometryLaboratories Photo 2000 J P Robinson When History5 Fulwyler M J 1965 Electronicseparationofbiologicalcellsbyvolume Science150 910 911 FirstdemonstrationofsortingcellsCellsizedeterminedfromCoultervolumeSortingtechnologybasedoninkjetprinterSeparatedmouseandhumanredbloodcells Fulwyler构置了第一个采用激光光源的商业性仪器 MackFulwyler CoulterElectronicsmanufacturedtheTPS 1 Twoparametersorter in1975whichcouldmeasureforwardscatterandfluorescenceusinga35mWargonlaser Thisphoto 2000 J P Robinson isoneofonlyoneortwosurvivingTPSInstruments ItisverysimilartotheCoulterCounteroftheday Photo 2000 J P Robinson When History6 1970s迅速发展 Fulwyler Coulter改进了分选装置 计数器 同时 BD公司与Stanford大学合作 研制了FluorescenceActivatedCellSorter FACS Herzenberg BectonDickinson Herzenberg 1972 Argonlaserflowsorter placedanargonlaserontotheirsorterandsuccessfullydidhighspeedsorting CoinedthetermFluorescenceActivatedCellSorting FACS Thisinstrumentcoulddetectweakfluorescencewithrhodamineandfluoresceintaggedantibodies AcommercialversionwasdistributedbyB Din1974andcouldcollectforwardscatterandfluorescenceabove530nm Photo 2000 J P Robinson CoulterElectronics 1977 78developedtheEpicsseriesofinstrumentswhichwereessentially5wattargonionlaserinstruments completewithamultiparameterdataanalysissystem floppydriveandgraphicsprinter EpicsVfrontend left andMDADS right currentlyatPurdueUniversity Photo 2000 J P Robinson When History7 1965MammaliancellsanalysedBloodcellstudiesWhitebloodcelltypingusingCDmarkersCancercellstudies variableDNAcontentApoptosis1977 1987DemonstrationsofprincipleofflowcytometryformicroorganismsLast10 15yearsvariousmicrobiologicalapplications 现在生产流式细胞仪的主要厂家是美国BD和Coulter两家公司 单克隆抗体技术的引进 为细胞研究中大量特异性免疫试剂的应用奠定了基础 科学家们 仪器制造商们纷纷将研究焦点转向荧光染料的开发 细胞的制备方法以及提高电子信号的处理能力上来 FACSCalibur BD MoFloXDP Coulter FCM分为两大类 台式机 FACScan FACSCalibur FACSort型号 其特点是仪器的光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 易学易操作 大型机 MoFloXDP 可快速分选细胞 并将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔 培养板 上 同时可选配多种波长和类型的激光器 适用于更广泛更灵活的科学研究应用 FCM工作原理 FCM是一种同时测定单一颗粒 常为细胞 的多重物理特征的技术 细胞的大小 形状 颗粒性 内部结构以及发射的荧光强度 记录散射光 荧光性质 FCM的结构 流动室和液流驱动系统 FluidSystem 光学系统 OpticalSystem Laser FilterSet 信号检测 ElectronicSystem 存贮 显示 分析系统 ComputerSystem 细胞分选系统 SortingSystem FluidSystem 使细胞排成单列与激光垂直相交 且保证每个细胞通过此相交点 samplecore 的时间相等 FlowCell InjectorTip Fluorescence signals Focusedlaser beam Sheathfluid FCM的结构 流动室和液流驱动系统 FluidSystem 光学系统 OpticalSystem Laser FilterSet 信号检测 ElectronicSystem 存贮 显示 分析系统 ComputerSystem 细胞分选系统 SortingSystem OpticalSystem Laser 提供单色性好 功率高 有较高的稳定性的光源 并保证samplecore与激光束正交于激光能量分布的峰值处 Focusingthelaserbeam IlluminationSources LampsXenon 氙 Mercury 汞 LasersArgonIon Ar 氩 488nm HeliumNeon He Ne 氦 氖 633nmHeliumCadmium He Cd 氦 镉 325nm EliteCytometerwith4Lasers EliteCytometerwith4Lasers Watercooledargonlaser He Cdlaser Air cooledargonlaser He Nelaser FCM的结构 流动室和液流驱动系统 FluidSystem 光学系统 OpticalSystem Laser FilterSet 信号检测 ElectronicSystem 存贮 显示 分析系统 ComputerSystem 细胞分选系统 SortingSystem OpticalDesign Filterstransmission Bandpassfilters characterizedbythereTmaxand theFullWidthatHalfMaximum FWHMNotchfiltersarebandpassfiltersintheupsidedownpositionLongpassandShortpassfilters characterizedbytheirTmaxandcuton cutoffwavelength TransmittedLight WhiteLightSource 630nmBandPassFilter 620 640nmLight StandardBandPassFilters TransmittedLight LightSource 520nmLongPassFilter 520nmLight TransmittedLight LightSource 575nmShortPassFilter StandardLongPassFilters 575nmLight Dichroics Theyusedtodirectlightindifferentspectralregiontodifferentdetectors Theyareinterferencefilters longpassorshortpass dichroic Di isGreekfortwo and chroicisGreekforcolor fromGreekdikhroos bicolored Reflectedlight TransmittedLight LightSource DichroicFilter Mirrorat45deg OpticalFilters CoulterOpticalSystem Elite TheEliteopticalsystemuses5sidewindowPMTsandanumberoffilterslotsintowhichanyfiltercanbeinserted CoulterOpticalSystem Elite Dichroicfilterslot PMTs LightScatterDetector EmptyPMTslot FCM的结构 流动室和液流驱动系统 FluidSystem 光学系统 OpticalSystem Laser FilterSet 信号检测 ElectronicSystem 存贮 显示 分析系统 ComputerSystem 细胞分选系统 SortingSystem ComputerSystem 由光电二极管 PMT将光信号按比例转变为电子电压脉冲信号 高度 宽度和面积 以数码信号储存在计算机里 FCM的结构 流动室和液流驱动系统 FluidSystem 光学系统 OpticalSystem Laser FilterSet 信号检测 ElectronicSystem 存贮 显示 分析系统 ComputerSystem 细胞分选系统 SortingSystem SortingSystem 将指定的细胞从细胞群中分离出来 FCM技术指标 一 测量的灵敏度 荧光测量灵敏度 600个荧光分子 散射光测量灵敏度颗粒直径0 2 0 5 m 仪器的分别率 CV 3 0 CV 3 0 CVDefinition MEAN FCM技术指标 二 分析速度 FACSCalibur1000个 秒分选指标 用于细胞分选条件设定FACSCalibur 分选速度 300个 秒分选纯度 singlecell exclusion recovery分选收获率 与分选纯度相对应 MoFloXDP 分选速度 70000个 秒分选纯度 exclusion 分选收获率 99 single exclusion recovery Summary IntroductiontocourseReadingandSupportMaterialsHistoryTechnicalHighlights Attheconclusionofthislectureyoushould KnowwhattherequirementsofthiscourseareKnowwheretotrackdowninformationofimportanceUnderstandabriefhistoryofthedevelopmentofflowtechnologyBeintroducedintosomeoftheprinciples 散射光信号和荧光信号 散射光信号 细胞在鞘流中通过测量区时 经激光照射产生散射光线 流式细胞仪检测前向角散射 ForwardScatterchannel FSC 和侧向角散射 SideScatterchannel SSC 荧光信号 FluorescenceSignals 由对细胞染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的 SomeDefinitions Absorption吸收作用Whenlightpassesthroughanobjecttheintensityisreduceddependinguponthecolorabsorbed Thustheselectiveabsorptionofwhitelightproducescoloredlight Refraction折射作用Directionchangeofarayoflightpassingfromonetransparentmediumtoanotherwithdifferentopticaldensity Arayfromlesstomoredensemediumisbentperpendiculartothesurface withgreaterdeviationforshorterwavelengthsDiffraction衍射作用Lightraysbendaroundedges newwavefrontsaregeneratedatsharpedges thesmallertheaperturethelowerthedefinitionDispersion散射作用Separationoflightintoitsconstituentwavelengthswhenenteringatransparentmedium thechangeofrefractiveindexwithwavelength suchasthespectrumproducedbyaprismorarainbow Lightabsorption Absorption Control Noblue greenlight redfilter Optics ForwardScatterChannel Whenalaserlightsourceisused theamountoflightscatteredintheforwarddirection alongthesameaxisthatthelaserlightistraveling isdetectedintheForwardScatterChannelTheintensityofFSCisproportionaltothesize shapeandopticalhomogeneityofcells Optics SideScatterChannel Whenalaserlightsourceisused theamountoflightscatteredtotheside perpendiculartotheaxisthatthelaserlightistraveling isdetectedinthesidescatterchannelTheintensityofSSCisproportionaltothecellgranularity complexityandopticalhomogeneity 散射光信号 FSC 收集与激光照射方向平行的细胞散射光 反映细胞对光的衍射能力 与被测细胞的大小有关 细胞大 FSC强 通过光电二级管收集前向光强 SSC 与激光束正交90 方向的散射光信号 反映细胞对光的折射 反射能力 与细胞形状 内在结构有关 细胞内结构越复杂 SSC就越强 通过光电倍增管收集侧向光强 散射光信号的检测 用直线坐标将所有细胞呈现在FSC SSC散点图上 通过调节光电二极管和PMT的电压大小来实现 散射光信号的检测 常常选取FSC作阈值 Threshold 来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒 以避免对被测细胞的干扰 阈值是一个电子控制阀 它触发细胞仪收集信号 根据需要也可在其它参数上设定阈值 荧光信号 由对细胞染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的 自发荧光 标记非特异性结合荧光 背景标记特异性结合荧光 Stainingcells Indirect 1 Incubatewithunlabelledprimaryantibody Wash 2 Incubatewithlabelledsecondaryantibody Wash Direct 1 Incubatewithmouseserum Blocksanyunreactedsitesonthesecondaryantibody 2 Incubatewithlabelledprimaryantibodies Wash Selectingthecorrectconcentrationofanantibody Multi colorFACSAnalysis EveryflluorochromeDyehasaCharacteristicExcitation Absorption SpectraandFluorescenceEmissionSpectra CulterFluorescence BDFluorescence Excitation488nm 荧光信号的检测 由光学滤光片将各种荧光信号送到所对应的检测器 FL1 FL2 FL3 FL4 上进行检测 荧光信号的检测 一般情况下荧光信号常用FL High来表示荧光强弱 采用DNA含量检测细胞周期时采用荧光信号的面积 FL A 和宽度 FL W 荧光信号的检测 荧光信号线性测量和对数测量 线性测量是指放大器的输出与输入呈线性关系 适用于细胞的DNA含量 RNA含量 总蛋白含量等的测量 细胞膜表面抗原等的荧光检测 通常使用对数放大器 荧光信号的高度 荧光信号的面积和宽度 荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量 对DNA倍体测量时采用面积 如FL2 A 而不能用FL2 H 因为对形状差异较大 DNA含量相等的两个细胞 得到的荧光脉冲的高度是不等的 而荧光信号的面积是相等的 由于二联体的FL2 A是单细胞的两倍 而两者的荧光信号的宽度 FL2 W 则相等 荧光信号宽度常用来区分双联体细胞 多重荧光染色分析 荧光发射光谱的部分重叠荧光染料的选择 荧光信号的重叠 光谱重叠的校正 两种荧光素的发射光谱有部分重叠 利用补偿光路去除重叠部分 compensation FL1 FL1 Compensation Compensateinstrumentusingstainedcells1 AdjustPMTvoltagesusingunstainedcells2 Adjustcompensationforeachfluorochrome 荧光补偿 compensation 多重荧光染色标记 不同荧光染料发射的荧光强度不同 选择荧光染料的原则 被测物质的含量较低 标记荧光染料的荧光强度较高 考虑荧光标记物的价格 Summaryforlastlecture TheprincipleofFlowCytometryThebasicbuildingblocksofaflowcytometerThesignalofscatterandfluorescenceStainingcellsCompensation 数据的采集 存贮 LinData LogDataDiscriminatororThresholdColorCompensationListModeDataGatingandAnalysis 数据的采集 存贮 采集 acquisition 多参数指标 荧光标记物参数可达4个 采集的数据以列队方式 ListMode 储存在计算机内 当一个细胞被检测4个参数时 若获取10000个细胞 所占容量为4 10000个字节 当只检测细胞的一个参数 如DNA 时 可灵活地关闭其它三个参数 节约四分之三的空间 Categoriesofdataplot SingleparameterhistogramDualparameterhistogram Dotplot Contourplot Densityplot Isometricplot Count Threeparameterhistogram Tomogram Datadisplay 单参数直方图 singleparameterhistogram 可用来定性 定量分析 Singleparameterhistogram Singleoverlay Categoriesofdataplot SingleparameterhistogramDualparameterhistogram Dotplot Contourplot Densityplot Isometricplot Count Threeparameterhistogram Tomogram Datadisplay twoparametercorrelatedplots oftencalledcytograms 可将各细胞亚群分开 获得相关细胞的重要信息 Dualparameterhistogram SurfacePlot Isometric CounterPlot DensityPlot Categoriesofdataplot SingleparameterhistogramDualparameterhistogram Dotplot Contourplot Densityplot Isometricplot Count Threeparameterhistogram Tomogram Datadisplay 3 dimensionaldisplay 在二维点图的基础上 将细胞的相对数显示出来 更直观地反映细胞群的状况 FlowCytometryData SmallerRegion Livecellsmostly LargerRegionincludesallcells Dataanalysis Gating 设定分析范围 Marking 划分计算区域 Marking Statistics ExperimentalSettings Oncetheyaresetinthecourseofanexperiment voltages compensation etc theyshouldnotbeadjusted Todosowillchangethe Phenotype ofthecells BychangingthevoltagesensitivityforFL1 wecanmakemarkers disappear Itisalsounethical FlowSetting 上样前 ChoiceParameter CreateDisplayingPlot SettingDiscrimination Threshold 上检测 用non stainingcell 调整每个参数的Voltage Gain 用单染调整CompensationAllofTheSettingSaveintheProtocol 用调整好的条件正式上检测 设定一个Flow实验的必要步骤 Samplepreparation 样本为单个悬浮细胞 asuspensionofsinglecells 样本纯净 尽量减少块状 clumps 和碎片 debris 调整细胞浓度为1 106个 ml 细胞悬液应在染色前或染色后进行固定处理 Fixation Samplepreparation 实体组织 Solidtissues 单分散细胞的制备 a 酶消化法 蛋白酶 protease 释放组织中的细胞 胰酶 Trypsin 水解脂键和肽键 碱性氨基酸羰基形成的肽键 胶原酶 collagenase 降解胶原蛋白为分子量低 可溶性肽的蛋白水解酶 Solidtissues Samplepreparation b 机械法 剪碎法 将组织剪碎至匀浆状 过滤 100目 离心 1000 700rpm 5min 再过滤 网搓法 在100 300目的尼龙网上轻搓组织块 离心 700rpm 研磨法 组织剪碎至小块置研磨器中 加2mlSN用研棒研至匀浆 SN冲洗过滤 300目 离心 700rpm 2min Solidtissues Samplepreparation c 化学试剂处理法 将组织细胞间起粘连作用的钙镁离子置换出来 从而使细胞分散 Solidtissues 0 2 EDTA 0 2gEDTA溶解于Hank s液 胰酶 EDTA 0 25g胰酶溶于200mlPBS PH7 0 0 2gEDTA溶解于100mlPBS 各取40ml混合 Samplepreparation 新鲜或冰冻实体组织标本标本 含去污剂PBS漂洗 组织剪碎 吸出上清液待用 消化 含200 ml胶原酶 37 孵育30min 并在磁力搅拌器上搅拌 组织在不锈钢网上轻轻研磨 用200目筛网过滤两次 细胞液与上吸出的待用上清液合并 石蜡包埋标本 切片至少50 m厚 脱蜡 水化 80 甲酸 内含3 H2O2 在 18度处理30min 消化 pepsin或protease 终止后过滤 200目 离心 1500rpm 700rpm 重悬 Solidtissues Samplepreparation 培养细胞收集悬浮细胞于试管中 贴壁细胞先用酶消化后制成单细胞悬液 然后300 g离心5分钟 用缓冲液重悬细胞 血细胞按常规分离各亚群细胞 Cellculture Methodsofcellstaining 直接染色法 106个细胞 加入荧光标记的抗体 15 30min后洗涤两次 冷PBS 350 g 5分钟 加入适量缓冲液或固定液待测 间接染色法 106个细胞 加入特异的第一抗体 4 或冰浴放置30 60min洗涤两次 加入荧光标记的二抗 以下同上 Methodsofcellstaining 胞浆染色 用破膜剂破膜后 再作直标或间标 Intraprep Immunotech 破膜试剂盒 5 5 多聚甲醛和皂甙 Saponin FACSPremeabilizationsolution PS BD公司 多聚甲醛 吐温20 PT 法 2 多聚甲醛 0 5X溶血素 lysingsol BD公司 室温作用10min磷酸盐 甲醛 丙酮 FBA 法 流式细胞术的应用 内部参数 FSC SSC外部参数 外加荧光标记参数1 4荧光染料染色的两种机制 活性染料可直接与细胞的某成分结合 且各种细胞成分对染料的亲和性不同 从而造成染上荧光或不染上荧光等不同的细胞群 利用荧光染料单克隆抗体偶联物与细胞的特定物结合 使其荧光强度增加 FCM在血液学和免疫学中的应用 对细胞表面抗原 细胞内抗原的测定对淋巴细胞亚群的进行分类 分别用CD19 CD3 CD16 CD56 检测B cell T cell NK cell 它还能检测全血中血小板表面相关标志物 常用CD61 Pac 1 CD62P 来检测血小板活性 CD61为血小板表面标志物 Pac 1为早期血小板活化标志物即活化的gpIIb IIIa复合物 CD62P为后期血小板活化标志物 检测时 常用CD61 PerCP SSC点图设门找出血小板群 然后门内做Pac 1 FITC CD62P PE的点图分析 FCM在血液学和免疫学中的应用 对白血病及淋巴瘤进行免疫分型 CD45 SSC对数取样点图 可将各群细胞区分出来 若再加上一个或两个 三个荧光标记的单抗 临床上对白血病微小残留病 minimalresidualdisease MRD 的检测更加重视 可预示即将到来的临床复发 检测体内带有少量白血病细胞的病人 MRD是指在白血病经诱导化疗获完全缓解后或是骨髓移植治疗后 体内仍雍留有少量白血病细胞的状态 MRD检测是指导个体化治疗 预防复发和提高患者生存率的重要手段 MRD Weir等利用CD10 CD20 CD19 CD45和CD34 CD9 CD19 CD45两种四色抗体组合对前B细胞ALL患者白血病相关抗原表型 LAIP 的检出率达到了90 Elaine等提出CD19 CD10 CD34三色抗体组合可有效应用于B2ALL的早期MRD检测 尤其适用于资源有限 经验不足的实验室 MRD CD10 CD20 CD19 CD45 CD10 EarlyBcells hematogones CD20 Bcell butnotonearliestBprecursorsCD19 BcellsatallstagesofmaturationCD45 leukocyteCD34 CD9 CD38 CD19 CD45CD34 StemcellsandotherearlyprogenitorsCD9 CD38 Pre BcellsandactivatedBandTcells CD34 CD34 CD10 CD19 CD38 CD19 CD10 CD34 FCM在血液学和免疫学中的应用 对AIDS 可监测病程和治疗过程中患者的免疫状态 预后估计CD4细胞的百分比 对AIDS 可监测病程和治疗过程中患者的免疫状态 预后估计CD4细胞的百分比 FCM在肿瘤学中的应用 肿瘤的诊断 DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标记 细胞的增殖能力大小也反映肿瘤的生物学特征 因此 临床上可利用FCM进行细胞周期分析和DNA倍体分析 辅助肿瘤诊断 FCM在肿瘤学中的应用 肿瘤预后估计 通常异倍体肿瘤的恶性度复发率 转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高 异倍体和较高的S期百分比都是不良预后的标志 用FCM监测肿瘤的DNA倍体可更客观地预测预后 FCM在细胞凋亡研究中的应用 Apoptosis是细胞在一定的生理或病理条件下 遵循自身的程序 自己结束其生命的过程 最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体 被其它细胞吞噬 Apoptosis 经历的过程为 1 染色质浓缩前阶段 2 染色质浓缩染色质被断裂成核小体大小的片段 3 细胞器浓缩形成凋亡小体 4 凋亡小体被周围细胞或巨噬细胞吞噬 然后被溶酶体分解 NecrosisvsApoptosis ChromatinCondensationFormationofApoptoticbodies CellshrinkageEnergypreserved Surfaceblebbing CellswellingATPdepletion Nochromatincondensation MembranelysisLeakageInflammation PhagocytosisNoinflammation 细胞形态分析 凋亡早期 细胞体积缩小 形成低FSC和高SSC 凋亡后期 染色质浓集和核碎裂 FSC和SSC均减弱 优点 无需染色 真实反映细胞形态和活力缺点 参数无特异性 可变性大 Apoptosis 细胞膜结构与功能改变分析 胞膜结构完整性的改变 PI 死细胞 FDA 活细胞 胞膜表面标记的改变 AnnexinV FITC PI机械性损伤细胞 AnnexinV PI 正常活细胞 AnnexinV PI 早期凋亡细胞 AnnexinV PI 晚期凋亡或继发性坏死细胞 AnnexinV PI AnnexinV Cy3 6 CFDA Apoptosis2 FCM检测细胞的凋亡率 早期凋亡时膜的对称性失去 带负电荷的磷脂如磷脂酰丝氨酸 PS 与连接素AnnexinV结合 AnnexinV是分子量为35 36kD的Ca2 依赖性的磷脂结合蛋白 对PS有高度亲和性 可与细胞膜上暴露的PS结合 AnnexinV可与荧光素 如FITC PE 偶联或与生物素偶联 鉴定早期细胞凋亡 AnnexinV PI或7 AAD 凋亡的分析技术 设立样本对照组 未染色细胞 只用AnnexinV FITC染色的细胞 单染1 只用PI染色的细胞 单染2 易被诱导凋亡的细胞株作阳性对照染色 未处理的细胞用来限定自发凋亡细胞和死亡细胞的基准 经过凋亡诱导细胞的百分率取决于处理和未处理细胞的凋亡阳性率的差值 AnnexinV封闭 封闭AnnexinV FITC结合位点 从而表明AnnexinV FITC染色的特异性 操作步骤 培养细胞用冷的PBS洗涤细胞两次 然后将细胞悬浮在结合缓冲液 0 01mol LHEPES 0 14mol LNaCl 0 0025mol LCaCl2 中并调节细胞浓度为 1 106cells ml 取上细胞悬浮液100 l到5ml试管中 加入AnnexinV FITC5 l PI2 l 轻轻混合后室温下于暗处孵育15分钟 每个试管加入400 l结合缓冲液 立即上流式细胞仪分析 一小时内 凋亡细胞的分选 利用FCM的分选功能可将特异标记的细胞如Annexin PI Annexin PI Annexin PI 各群细胞从混合细胞群中分选出来 然后分别对分选细胞进行分析 研究 如电镜观察 电泳分析等 可对特殊凋亡细胞的形态学 生物化学 免疫学等特征的研究更具体 深入 细胞内组分的改变 线粒体膜电位的改变 凋亡细胞的MMP会降低mitocapture正常细胞 发红光Rh123 JC 1凋亡细胞 发绿光DiOC6 3 正常细胞发红光或发绿光溶酶体质子泵 早期凋亡细胞的溶酶体结构基本上保持完整 活细胞 早期凋亡细胞 发红光死细胞 凋亡晚期细胞 红光降低 Apoptosis3 AO MitochondriaMembranePotential 凋亡细胞DNA断裂末端标记 TUNEL TUNEL法标记物常为FITC dUTP 通过细胞是否标记绿色荧光来鉴别凋亡细胞 用TUNEL法与PI染色结合分析 即先用FITC dUTP对凋亡细胞断裂DNA进行标记染色 然后以PI标记变性的DNA 通过FITC与PI的双染 可测知凋亡细胞发生的时相 Apoptosis3 分析细胞DNA含量 由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响 细胞染色过程中DNA碎片从细胞内逸出 故凋亡细胞的DNA荧光标记物降低 DNA直方图上显示在G0 G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰 称为凋亡细胞峰 测定DNA含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性 Apoptosis3 细胞周期分析 细胞周期DNA含量G0 G12CS2C X 4CG2 M4C DNAProbes KeyfeatureofDANprobesisthattheirStoichiometric thusnumberofmoleculesofprobeboundedequivalenttonumberofDNA DNAProbes PhenanthridiniumsPropidiumIodide PI EthidiumBromide EB IntercalatebetweenbasesinDSnucleicacidsExciteintheUVorBluewithredemissionBindstoDNA RNA must Slide4of16 DNAProbes Benzimides Hoechst33342BindstotheA TrichregionsinthesmallgrooveofDNAUVexcitationwithblueemissionRedemissionifexceedoptimalconcentrationAntibiotics Mithramycin ChromamycinA3BindtheG CrichregionsofDNA DNAProbes AcridineOrange AO IntercalatesintotheDSDNA Bindstosinglestrandednucleicacidsbystackinginthechargedphosphates BlueexcitationandgreenemissionforDSDNA RedfluorescenceemissionforSSDNAPyroninYisarelateddyetoAO UsedforRNAmeasurementafterblockingDNAwithnon fluoresceinatedDNAprobe Definiti