食品安全中微生物的快速检测.doc

腐败变质食品不仅降低食品的营养价值、使人产生厌恶感，而且因产生的有毒物质能引起急性中毒，或者因长期食用造成慢性中毒，甚至可以表现为致癌、致畸、致突变的作用。 .&利用新型细菌快速检测技术有效监控食品细菌性污染食品安全是一个直接关系到人民群众生命、健康和社会稳定的重大公共安全问题，而微生物污染问题又是其中极为重要的因素。我国从案例数或人数统计角度对食物中毒案例的分析资料显示，微生物性食品中毒所占的比例高达67%，而且细菌性食物中毒也是最常见的微生物性食物中毒。2002年，我国正式启动了“食品放心工程”。国家工商总局在制定流通领域商品质量监管的工作思路时，也将食品安全监管列为重中之重。因此，如何有效监控流通领域中的食品细菌性污染，已成为“关口前移”所面临的重要课题之一。一、细菌与食品安全尽管已有很多书籍和文献对食品细菌性污染作了全面、深入的分析，为了便于在本文中对食品细菌性污染的监控进行探讨，还是先对有关概念作一些简要的介绍。（一）细菌及其主要类别微生物是一类生物，由于体形小，必须用显微镜才能看清，故称微生物。它们广泛存在于人类赖以生存的食物链，即：“土壤植物动物人”的每一环节，分布极广，种类极多，与人类关系密切，起着有益或有害的作用。微生物可分为非细胞型微生物（如真病毒、亚病毒）、原核细胞型微生物（如细菌、衣原体、支原体）和真核细胞型微生物（如真菌、藻类）等三大类型。细菌是一类有细胞壁的单细胞原核微生物，行二分裂法繁殖。细菌按基本形态可分为球菌、杆菌和螺形菌（分弧菌和螺菌）；经革兰染色法染色后，可分为革兰阳性（G）细菌和革兰阴性（G）细菌；按是否具有能引起机体产生疾病的性能可分为致病菌（病原菌）和非致病菌。（二）细菌与食品安全自然界中各种生物适应各自的环境条件而公共生活。因为食品中含有丰富的营养，细菌在食品环境中易于生长，使食品发生了改变，反过来也会影响细菌本身。虽然正常植物和动物内部组织是无菌的，但由于获取和操作处理等过程中的污染，食品表面上常会被污染并滋生多种细菌。鉴于食品本身和微生物生态学的独特性与复杂性，细菌与食品的相互作用比在空气和水中表现得更加激烈和迅速。细菌污染程度直接影响着食品安全，对人体健康和人身安全的危害（危胁）主要表现在两个方面。一是致病菌的食品污染细菌性食物中毒。食物中毒是指摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后出现的非传染性（不同于传染病）急性和亚急性疾病，其中细菌性食物中毒在国内外都是最常见的食物中毒。常见细菌性食物中毒的发病特点为发病潜伏期短，来势急剧，病人临床表现基本相似，人与人之间无直接传染；流行病学的特点为病程短、恢复快、预后好、病死率低、发病季节性明显，但李斯特菌和肉毒梭菌等食物中毒病程长、病情重、恢复慢、病死率相对较高。二是非致病菌的食品污染食品的腐败变质。狭义的食品腐败指食品中的蛋白质受腐败细菌产生的蛋白质分解酶的作用而被分解，依次向低分子化合物降解下去，生成各种有毒物质和不愉快气味物质的过程。而食品的腐败变质一般是指：食品在一定的环境因素影响下，由微生物为主的多种因素作用下所发生的食品失去或降低食用价值的一切变化。腐败变质食品不仅降低食品的营养价值、使人产生厌恶感，而且因产生的有毒物质能引起急性中毒，或者因长期食用造成慢性中毒，甚至可以表现为致癌、致畸、致突变的作用。尽管能引起食品腐败变质的微生物种类很多，但由于一般细菌都有分解蛋白质的能力，因而成为导致食品腐败变质的主要因素之一。 （三）食源性健康危害与国家相关标准食品法典委员会（CAC）将微生物性健康危害列为食源性健康危害的三大原因之一。2000年，世界卫生大会通过了食品安全决议，将食品安全列为公共卫生的优先领域，制定了全球食品安全战略并要求成员国制定相应的行动计划，最大程度地减少食源性疾病对公共健康的威胁。我国确定的食品安全总目标为：控制食品污染，减少食源性疾病，保障消费者健康，促进经济发展。制定的食品安全行动计划内容之一涉及开展食品中生物污染监测与评价。在我国建立致病菌及真菌毒素的监测网络，对重点食品实施主要食源性致病菌和真菌毒素污染状况的监测，及时发现潜在的和正在发生的食品中生物性污染问题，进行危险性评价，用于制定相关的政策法规，指导食品安全监管工作，引导食品生产和消费。菌落总数、大肠菌群和致病菌是各国食品国家标准及卫生学评价的重要指标。对这三项指标的控制也是降低微生物性食源健康危害风险的重要手段。菌落总数能反映食品细菌性污染的总体状况，在我国国家标准中对不同的食品有着不同的数量化规定，最大不得超过106cfu/ml(g)（菌落形成单位/每毫升或每克）。大肠菌群是作为粪便污染指标菌，其菌群数高低表明粪便污染程度，也反映对人体健康危害性大小，在我国国家标准中大多数限值为40MPN/100ml(g)（最大近似值/每百毫升或每百克）。致病菌是对人体危害最大的细菌，我国国家标准中规定在25毫升（或克）样品中不得检出。需要说明的是，要想全面判断食品的卫生质量状况，就应进行食品卫生质量鉴定，即：查明食品中是否存在威胁人体健康的有害因素及其来源、性质、作用和含量的技术程序规范，包括生物、化学、物理的检验方法，以及食品污染、食品中毒等卫生学和流行病学调查处理的内容和程序等。通过鉴定作为对食品做出食用或条件食用或不作食用等处理决定的依据。二、细菌的常见检测方法选择何种快速、有效的食品细菌检测方法，是当今食品安全必然涉及的技术课题。由于细菌和其他微生物的检测、分析方法众多，难以在此一一说明。现仅就部分常见的检测方法作一些简要的介绍。（一）传统培养检测方法就以有害微生物的检验方法而言，目前测定菌落总数的标准方法是将待测样品在无菌的情况下，稀释成种适宜的稀释度，取每个稀释度待测样品1ml放入有15ml培养基的灭菌平皿中在361温箱中培养482h，取出计算平皿中菌落数，再乘以稀释倍数，即得每克或每毫升样品中所含的菌落总数。实验中还要做平行样品，同时作空白对照。国际上传统的标准培养法，对每个步骤均要求很严格。目前国内外测定菌落总数的标准方法基本一致。从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养时，对吸管内液体的流速，稀释液的震荡幅度，时间和次数及放置时间等均作了比较具体的规定。需要说明的是，用传统培养法检测食品中菌落总数虽被称为“金标方法”，但其培养时间长且对检测条件以及检测人员的专业水平和工作经验要求较高。而且，培养法所测得的菌落总数的含义并不表示实际中的所有细菌菌落总数，而是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）食品检样所生长出来的细菌菌落总数。（二）生物化学发光检测方法（ATP）利用细胞的特征来测定细菌数，是快速检测菌落总数的一个发展方向。三磷酸腺苷（ATP）是所有生物细胞中一种活性物质。它的三个磷酸根是靠高能量接在腺苷分子上的，分解出磷酸根时就释放出能量，这是生物生存所需的能量来源。一般说来，一个细菌细胞中平均含有10-15g（1fg）ATP。使细菌释放出ATP，即可利用生物化学方法测定ATP含量。在测定过程中，ATP自细菌细胞放出来后，即使用荧光虫素和荧光虫素酶使磷酸根从腺苷分子上分解下来，从而释放出能量。这些能量产生像萤火虫发出的光，化学上称为磷光（又称冷光）。光的强度大小代表细菌所含的ATP的量，光的强度可用光度计测出，从而推算出菌落总数。这种方法可以在几分钟内得出结果，大大缩短了检测时间。当然，测定食品中的菌落总数时问题要复杂得多。因为食品其他体细胞中也含有ATP，而且中还会有一些干扰ATP反应的物质，所以，ATP方法自二十世纪80年代问世后，在很长一段时间内只能用于对食品加工环境、器具或包装进行检测，不能检测食品成品本身。（三）其他检测方法除了上述两种检测方法外，还有许多检测方法正在迅速发展。其中包括免疫学检测方法，如酶标抗体法（ELISA）、荧光抗体染色法（免疫荧光法）、同位素标记抗体法（放射免疫法）、乳胶凝集法、免疫传感器法；分子生物学方法，如基因探针法、比色DNA杂交检测法、聚合酶链反应法（PCR）；其他生物化学方法，如阻抗法等。这些检测方法虽然各有千秋，但许多检测方法或因设备和试剂比较昂贵、或因操作过程较为复杂、或因实验条件较为严格，并非适用于所有的机构和单位。三、新型细菌快速检测技术在食品安全中的应用实行食品卫生质量监管不仅需要选择适当的食品细菌快速检测技术，而且还要根据部门职责、工作特点和政府财力等因素实现可行配备。同时，立足科学管理思想制定合理监控目标和监控层级，也是需要考虑的重要问题。（一）现场监测与食品细菌快速检测技术在一定意义上，实施现场检测对食品细菌性污染的监控工作至少具有三个特点。一是现场取得证据，即：通过现场定性初筛以取得食品细菌性污染的“违法涉嫌”证据；二是快速实施控制，即：对涉嫌的食品的流向和环节迅速布控，以防止或遏止食物中毒的爆发性蔓延；三是仪器操作简便，即：选取智能化和自动化程度较高的现代化分析仪器，以降低检测人员的操作难度。基于上述特点，监察机构需要选择适用于各个领域中质量监管工作的食品细菌快速检测技术。（二）食品细菌快速检测技术的最新发展随着“仪器革命”的不断深入，细菌快速检测技术也得到了迅速发展。值得特别注意的是，ATP检测技术和其他快速检测技术近年来出现了新的发展动向。1、ATP检测技术的最新成果。为了克服ATP方法不能直接检测食品成品的缺陷，美国NHD公司的科学家们进行了长期的艰苦研究，最近推出一种能使非细菌细胞和细菌细胞分离的ATP食品细菌快速检测系统（Profile-1 3560）。运用这套系统，将待测样品放入底部有筛孔的比色杯中，这种比色杯细菌细胞过不去，当溶液中加入非细菌细胞释放剂，将非细菌细胞裂解，再用一定的压力压出比色杯底部，样品溶液中的干扰物质也随之洗掉，比色杯中仅剩下细菌细胞；之后用细菌细胞释放液裂解细菌细胞，释放出ATP所测得的量则为细菌的ATP量，使结果可靠性提高很多。美国农业部、加拿大农业部、美国密西根大学，均对这套检测系统进行了数百个肉类、禽类和水的样品试验，与国际标准培养法进行比对，相关系数在90%以上。我国科研人员以中国传统食品为样品，用该系统和方法与我国国标法做比对试验，所得结果也具有很高的相关性。说明经分离和过滤后，测定ATP的量可以很好表达细菌的菌落总数，科学家们以这两种方法比对结果做回归曲线，根据回归曲线可将ATP亮度单位（RLU）折算成菌落形成单位/毫升（克）cfu/ml（g）。由于Profile-1 3560检测系统具有可以随身携带、操作十分简易、测定时间很短（只需5分钟）、结果相当精确等突出特点，被美军用于海外战争中防止士兵食物中毒及防御生物细菌战。2、其他快速检测技术的最新发展美国BioSys公司的BS32和128系统是基于传统的培养基理论和染色技术，结合光电计数（OptoElectronic Counting Technology）和计算机技术进行微生物检测。样品放入专门的培养基检测瓶中后，微生物的新陈代谢作用使培养液的颜色发生变化，再反射到位于检测瓶底部的琼脂感应层上，同时光敏二极管对感应层的颜色不断的进行实时扫描，得到的光信号转换成电信号由计算机进行监测，可以随时监测了解微生物的生长繁殖情况。BS系列大大简化了繁琐的传统微生物检测方法。用户不需要制备试剂，可同时观测32-128个样品，操作只需：1、将样品直接（固态样品简单稀释后）放入已预装培养试剂的“即装即用”型培养检测瓶中。2、将检测瓶插入检测器/培养箱中并键入样品编号。过5-11小时后，既可得出菌落总数、大肠菌群（Coliforms）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、大肠杆菌（E.coli）、酵母菌（Yeast）的量化结果。并且可随时放入打捞的检测瓶，而不影响其他正在进行的检测样品。结果还可进行存储、处理和打印。英国DWS公司的RABIT快速自动细菌阻抗系统包括直接的和间接的两种技术。前者主要利用代谢产生的微生物体引起的培养基电导的增加，通过测量电导的变化进而快速检测为细菌的数量。后者组主要是检测生长的器官中二氧化碳的含量，这种方法特别适用于检测那些不产生很多电荷代谢物的生物体。该系统操作简便、集成度高、适用范围广，可用传统增菌液和培养基在6-14小时之间检测各种细菌。（三）块促检测中应用新型细菌快速检测技术的要点根据食品安全质量监管工作的职责，并结合现场或快速检测中对食品细菌性污染监控工作的特点，采取循序渐进、层级配置、部门合作、提升能力等策略，也许是在食品安全工作中应用新型细菌快速检测技术时需要把握的要点。第一，确定监控目标的层级和实施阶段。即：根据对食品安全影响的概率和检测技术难度，按照菌落总数特定菌群致病菌种的次序，逐步开展食品细菌性污染的监控工作。第二，采取层级、数量的差别配置，以达到既能提高监控能力，又可降低行政成本的目的。以一个城市为例：可以考虑在现场监察部门普遍配备如Profile-1 3560类型的检测系统，以实现对食品中菌落总数的有效监控能力；必要时在移动实验室或检测车上配备适量如BS系列快速检测系统，以实现对特定菌群（如大肠菌群）的重点监控能力；条件成熟时也可配备少