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分子生物学读书笔记第1篇 化学和遗传学第1章 孟德尔学派的世界观知识点：1. 孟德尔定律是什么？答：显性和隐性基因都是独立传递的，并且在性细胞形成过程中能够独立分离。这个独立分离规律（principle of independent segregation）经常被称为孟德尔第一定律。 基因存在，并且每一对基因在性细胞发育过程中，都可以独立地传递到配子中。这一独立分配律（principle of independent assortment）经常被称为孟德尔第二定律。第2章 核酸承载遗传信息知识点：1. 中心法则：答：1956年，Crick提出将遗传信息的传递途径称为中心法则（central dogma）。 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 其中，箭头表示遗传信息的传递方向。环绕DNA的箭头代表DNA是自我复制的模板。DNA与RNA之间的箭头表示RNA的合成（转录，transcription）是以DNA为模板的。相应地，蛋白质的合成（翻译，translation）是以RNA为模板的。更为重要的是，最后两个箭头表示的过程，只能单方向存在，也就是说，不能由蛋白质模板合成RNA。也难以想象由RNA模板合成DNA。蛋白质不能作为RNA的模板已经经受了时间的验证，然而，正如我们将在第11章中要提到的，有时RNA链确实可以作为互补的DNA的模板。这种与正常信息流的方向相反的事例，与大量的以DNA为模板合成的RNA分子相比，是非常少见的。所以，大约50年前提出的中心法则在今天看来仍然是基本正确的。第3章 弱化学作用的重要性知识点：1. 弱化学键主要有4种:答：范德华力, 疏水键, 氢键及离子键。2. 弱化学键的作用：答：介导了到分子内/间的相互作用，决定了分子的形状及功能。第4章 高能键的重要性知识点：1 蛋白质与核酸的形成：答：蛋白质是氨基酸间通过肽键连接, 核苷酸间通过磷酸二脂键连接而形成核酸。以上2种重要生物大分子的形成都是由高能的 pp水解提供能量, 对反应前体进行活化。2 ATP的作用：答：ATP被称为生物的能量货币, 其上储存的高能磷酸键可以直接为生物反应供能。第5章 弱、强化学键决定大分子的结构知识点：1. 强化学键的作用：答：核酸（DNA/RNA）和蛋白质都是由简单的小分子通过共价键组成的高分子。这些小分子的排列顺序决定了其遗传学和生物化学的功能。2. 弱化学键的作用：答：核酸（DNA/RNA）和蛋白质的三维空间构型及它们间的相互作用是由弱的相互作用来决定和维持。除少数特例外，对这种弱的相互作用的破坏（如加热或去污剂），即使不破坏共价键，都将会破坏其所有的生物活性。3. 蛋白质的四级结构：答：1级结构（primary structure）：多肽链中氨基酸的线性顺序。 级结构（secondary structure）：邻近的氨基酸通过弱的相互作用形成二级结构。最基本的二级结构是螺旋和折叠。二级结构可通过计算机做准确预测。 级结构（tertiary structure）：多肽链在二级结构基础上形成的空间结构。可用x射线晶体衍射和核磁共振术进行测定。级结构（quaternary structure）：多亚基蛋白所形成的结构。第2篇 基因组的维持第6章 DNA和RNA的结构知识点：1. DNA由多核苷酸链构成：答：通常DNA最重要的结构特征是两条多核苷酸链（polynucleotide chain）以双螺旋的形式相互缠绕。双螺旋两条单链的骨架是由糖和磷酸基团交替构成的；碱基朝向骨架的内侧，通过大沟和小沟可以接近碱基。DNA通常是右手双螺旋。大沟中有丰富的化学信息。 多核苷酸链以磷酸二酯键为基础构成了规则的不断重复的糖-磷酸骨架，这是DNA结构的一个特点。与此相反，多核苷酸链中碱基的排列顺序却是无规律的，碱基排列顺序的不规则性加上其长度是DNA储存大量信息的基础。 习惯上，DNA序列由5端（在左边）向3端书写，一般5端是磷酸基而3端是羟基。2. 双螺旋的两条链序列互补：答：腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）配对的结果是使两条相互缠绕的链上的碱基序列呈互补关系并赋予DNA自我编码的特性。3. 碱基会从双螺旋中翻转出来：答：有时单个的碱基会从双螺旋中突出，这种值得注意的现象叫做碱基翻出（base flipping）。4. DNA双链可以分开（变性）和复性：答：当DNA溶液温度高于生理温度（接近100）或者pH较高时，互补的两条链就可分开，这个过程称为变性（denaturation）。DNA双链完全分开的变性过程是可逆的，当变性DNA的热溶液缓慢降温，DNA的互补链又可重新聚合，形成规则的双螺旋。由于变性的DNA分子具有复性的能力，因此来源不同的两条DNA分子链通过缓慢降温也可形成人工杂交分子。在第20章里，两条单链核酸形成杂交分子的能力被称为杂交（hybridiztion）。这是分子生物学中几项不可缺少的技术的基础。例如，Southern印迹杂交（第20章）和DNA芯片分析（第18章，框18-1）。由于双螺旋DNA的光吸收比单链DNA少40%。当DNA溶液温度升高到接近水的沸点时，光吸收值（absorbance）在260nm处明显增加，这种现象称为增色效应（hyperchromicity）；而减色效应则是因为双螺旋DNA中的碱基堆积降低了对紫外线的吸收能力。吸光度增加到最大值一半时的温度叫做DNA的熔点（melting point）。5. 连环数由扭转数和缠绕数共同决定：答：连环数（linking number）是指要使两条链完全分开时，一条链必须穿过另一条链的次数（用Lk表示）。 连环数是扭转数（twist number，用Tw）和缠绕数（writhe number，用Wr表示）这两个几何数的总和。扭转数仅仅是一条链旋绕另一条链的螺旋数，即一条链完全缠绕另一条链的次数。在三维空间里双螺旋的长轴经常重复地自我交叉，这称为缠绕数。6. 细胞中DNA呈负超螺旋的意义：答：负超螺旋含有自由能，可以为打开双链提供能量，使DNA复制和转录这样的解离双链的过程得以顺利完成。因为Lk=Tw+Wr，负超螺旋可以让双螺旋扭转数减少，负超螺旋区域因而有局部解旋倾向。因此，与松弛态DNA相比负超螺旋DNA更易于解链。7. 拓扑异构酶有2种基本类型：答：拓扑异构酶（topoisomerase）可以催化DNA产生瞬时单链或双链的断裂而改变连环数。 拓扑异构酶通过两步改变DNA连环数。它们在DNA上产生一瞬时的双链缺口，并在缺口闭合以前使一小段未被切割的双螺旋DNA穿过这一缺口。拓扑异构酶依靠ATP水解提供的能量来催化这一反应。相反，拓扑异构酶一步就可以改变DNA的连环数，其作用是使DNA暂时产生单链切口，让未被切割的另一单链在切口接合之前穿过这一切口。与拓扑异构酶相比，拓扑异构酶不需要ATP。 原核生物还拥有一种特殊的拓扑异构酶，通称为促旋酶，它引入而不是去除负超螺旋。8. RNA的结构与功能：答：RNA与DNA的3个不同之处：第一，RNA骨架含有核糖，而不是2-脱氧核糖，也就是说在核糖的C2的位置上带有一个羟基。第二，RNA中尿嘧啶（uracil）取代了胸腺嘧啶，尿嘧啶有着和胸腺嘧啶相同的单环结构，但是缺乏5甲基基团。胸腺嘧啶实际上是5甲基-尿嘧啶。第三，RNA通常是单多聚核酸链。从功能上讲，mRNA是从基因到蛋白质合成的媒介，tRNA作为mRNA上密码子与氨基酸的“适配器”，同时，RNA也是核糖体的组成部分；另外，RNA还是一种调节分子，通过和mRNA互补序列的结合对翻译过程进行调控；最后，还有一些RNA（包括组成核糖体的一种结构RNA）是在细胞中催化一些重要反应的酶。9. 碱基对也可以发生在不相邻的序列中，形成称为“假结”（pseudoknot）的复杂结构。10. RNA具有额外的非Watson-Crick配对的碱基，如G：U碱基对，这个特征使RNA更易于形成双螺旋结构。11. 一些RNA可以是酶类：答：RNA酶被称为核酶（ribozyme），具有典型酶的许多特性：催化位点、底物结合位点和辅助因子（如金属离子）结合位点。最早被发现的核酶是RNaseP，一种核糖核酸酶，参与从大的RNA前体生成tRNA。mRNA前体、tRNA前体和rRNA前体间插序列即内含子（intron）的切除过程称为RNA的剪接（RNA splicing）。12. RNA的功能有哪些?答：（1）有些RNA本身就是一种酶,具有调节功能； （2）RNA是一种遗传物质（主要为病毒的遗传物质）； （3）RNA可以作为基因和蛋白质合成的中间体； （4）RNA可作识别子（如:mRNA）； （5）RNA可以作为一种调节分子主要通过序列互补结合阻止蛋白质的翻译。第7章 染色体、染色质和核小体知识点：1. 一些概念：答：（1）染色体（chromosome）：在细胞中DNA是和蛋白质结合存在的，每条DNA及其结合的蛋白质构成一条染色体（chromosome）。 （2）核小体（nucleosome）：DNA与组蛋白结合所形成的结构称为核小体（nucleosome）。 （3）染色体是环状或线状的。 （4）基因组密度的简单衡量方法是每Mb基因组DNA上基因的平均数目。 （5）突变基因和基因片段是由于简单的随机突变或在DNA重组过程中的错误所造成的。假基因则是因反转录酶（reverse transcriptase）的作用而形成。2. 每个细胞都有特定的染色体数目：答：大多数真核细胞是二倍体（diploid），也就是说，细胞中每条染色体有两个拷贝。同一个染色体的两个拷贝叫做同源染色体（homolog），分别来自父本和母本。但是，一个真核生物中的所有细胞并非都是二倍体，某些细胞是单倍体或多倍体。单倍体（haploid）细胞每条染色体只有一个拷贝，并且参与有性生殖（例如，精子和卵子都是单倍体细胞）。多倍体（polyploid）细胞中每条染色体都超过两个拷贝。3. 基因组大小与生物体的复杂性相关：答：基因组的大小（单倍染色体中DNA的长度）在不同的生物种有相当大的变化。由于生物的复杂性越高所需的基因也就越多。因此基因组的大小与生物体的复杂性相关也就不足为奇。4. 导致真核细胞中基因密度降低的因素：答：首先，当生物体的复杂性增加时，负责指导和调控转录的DNA区段调控序列（regulatory sequence）的长度显著增长；其次，在真核生物种编码蛋白质的基因通常是不连续的。这些分散的非蛋白质编码区段称为内含子（intron）。内含子转录后通过RNA剪接（RNA splicing）的过程从RNA中删除。5. 人的基因间隔区序列主要由重复DNA构成：答：几乎一半的人类基因组由在基因组中重复多次的DNA序列组成。重复DNA一般有两种：微卫星DNA和基因组范围的重复序列。微卫星DNA（microsatellite DNA）由非常短的（小于13bp）串联重复序列构成。基因范围的重复序列（genemo-wide repeat）要比微卫星大得多，尽管这些重复有许多种类，但是它们有着共同的特点，即都是转座元件（transposable element）。 转座元件是指能从基因组的一个位置移动到另一个位置的序列，这个过程称为转座（transposition）。6. 真核染色体在细胞分裂过程中需要着丝粒、端粒和复制起始位点：答：（1）复制起始位点（origins of replication）是DNA复制机制集合并起始复制的位点。 （2）着丝粒（centromere）是DNA复制后染色体正确分离所必需的。与复制起始位点相似，着丝粒指导一个精细的蛋白质复合体的形成，此结构也称为动粒（kinetochore）。 （3）端粒（telomere）位于线性染色体的两端。端粒通过一种特殊的DNA聚合酶端粒酶（telomerase）来完成线性染色体末端的复制。7. 细胞周期及有丝分裂：答：细胞完成一轮分裂所需要的过程称为细胞周期（cell cycle）。大多数真核细胞的分裂会使子代细胞维持与父本细胞一致的染色体数目。这种分裂类型称为细胞的有丝分裂（mitotic cell division）。有丝分裂的细胞周期可以分为4期：G1、S、G2和M。DNA合成发生在细胞周期的合成期或S期（synthesis或S phase），导致每条染色体的复制。复制后配对的每条染色体叫做一条染色单体（chromatid），配对的两条染色单体称为姐妹染色单体（sister chromatid）。复制后的姐妹染色单体通过一个叫做黏粒（cohesin）的分子聚在一起，这一过程称为姐妹染色单体的聚集（sister chromatid cohesion），这种状态一直维持到染色体的相互分离。染色体分离发生在细胞周期的有丝分裂期或M期（mitosis，M phase）。8. 有丝分裂及减数分裂的具体过程：答：见书P151图7-15和P153图7-16。9. 核小体是染色体的结构单位：答：在真核细胞中大多数DNA被包装进核小体。核小体由8个组蛋白所形成的核组成，DNA缠绕在组蛋白核上。每个核小体之间的DNA（“念珠”上的“线”）叫做连接DNA（linker DNA）。 与核小体结合最紧密的DNA叫做核心DNA（core DNA），它像缠绕线轴一样盘绕组蛋白八聚体约1.65圈。10. 组蛋白是带正电荷的小分子蛋白质：答：组蛋白是目前所知的与真核DNA相关的丰度最高的蛋白质。真核细胞一般包括5种组蛋白：H1、H2A、H2B、H3和H4。在每种核心组蛋白中都存在一个保守区域，称为组蛋白折叠域（histone-fold domain），调节这些组蛋白中间体的组装。一个核小体的组装涉及这些结构单位与DNA有序地结合。首先，H3H4四聚体与DNA结合；然后两个H2AH2B二聚体结合到H3H4-DNA复合体，形成最后的核小体。每个核心组蛋白有一个N端延伸，称为“尾巴”，这是因为它没有一个确定的结构，而且是完整的核小体中易接近的部分。11. 许多不依赖于DNA序列的接触介导核心组蛋白与DNA间的相互作用。12. 组蛋白的N端尾可稳定盘绕在八聚体上的DNA。13. 染色质的高级结构：答：组蛋白H1与核小体间的连接DNA结合。核小体束能形成更复杂的结构：30nm的纤丝。DNA的进一步压缩涉及到核小体DNA的大环。组蛋白的变构体影响核小体功能。14. DNA与组蛋白八聚体的相互作用是一动态的过程。15. 核小体重塑复合体有助于核小体的移动：答：组蛋白八聚体与DNA相互作用的稳定性受到大的蛋白复合体核小体重塑复合体（nucleosome remodeling complex）的影响。这些多蛋白复合体利用ATP水解释放的能量，便于核小体改变位置或与DNA相互作用。这些变化有3中方式：组蛋白八聚体沿DNA“滑动”（sliding）；组蛋白八聚体从一个DNA分子到另一DNA分子的完全“转移”（transfer）；核小体“重塑”（remodeling），增加DNA的易接近性。16. 某些核小体在体内处于特定的位置：核小体的定位：答：由于核小体与DNA的动态相互作用，大多数核小体的位置是不固定的。但在有些情况，对核小体的位置，或称为核小体的定位（positioning），进行限制是有利的。17. 组蛋白N端尾的修饰可改变染色质的易接近性：答：当组蛋白从细胞中分离出来，其N端尾通常被许多种小分子修饰。在尾部的赖氨酸经常被乙酰基或甲基修饰，而丝氨酸主要受磷酸化修饰。一般来说，乙酰化的核小体与染色体上转录活跃的区域结合，而脱乙酰化的核小体与染色质上转录受抑制的区域结合。与乙酰化不同，N端尾不同部位上的甲基化使核小体可以与抑制的和活化的染色质都能结合，这取决于组蛋白尾上被修饰的特定的氨基酸。18. DNA复制后核小体立即被组装：答：当复制叉经过时，核小体解体为亚组装部件。H3H4四聚体似乎仍随机地与两个子代双螺旋之一结合，并不从DNA上释放而成为游离的成分。相反，H2AH2B二聚体被释放且进入局部的环境，参与新的核小体的组装。19. 核小体的组装需要组蛋白“伴侣”：答：在生理盐浓度下对核小体组装的研究鉴定出一些能指导组蛋白在DNA上组装的因子。这些因子是带负电荷的蛋白质，与H3H4四聚体或H2AH2B二聚体形成复合体，并护送它们到核小体组装的位点。由于这些因子可以避免组蛋白与DNA发生无效的相互作用，因此被称为组蛋白伴侣（histone chaperone）。 PCNA形成一个环绕着DNA双螺旋的环，在DNA合成过程中将DNA聚合酶固定在DNA上。当聚合酶作用完成后，PCNA由DNA聚合酶上释放，但仍与DNA相连。在这种情况下，PCNA能与其他蛋白质发生作用。CAF-1与释放的PCNA结合，优先将H3H4四聚体组装到与PCNA结合的DNA上。20. 简述染色体的组装过程。答：在DNA的复制过程中，核小体暂时解体，组蛋白H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体被随机分配到任一子代分子中，在DNA复制后，核小体立即被组装，这涉及到特定的组蛋白伴侣的功能，这些组蛋白伴侣护送H3-H4四聚体和H2A-H2B二聚体到达复制叉。随后，在旧蛋白的“种子”作用下，发生相似修饰，一旦DNA包装成核小体，它有能力借助组蛋白的H1来进行进一步压缩DNA，开成染色质形式（30nm纤丝），在细胞分裂间期，染色质进一步浓缩成染色体。第8章 DNA的复制知识点：1. DNA合成的化学基础：答：DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物-模板接头。DNA通过引物3端的延伸进行合成。焦磷酸水解是DNA合成的驱动力。2. DNA聚合酶的作用机制：答：（1）DNA聚合酶用一个活性位点催化DNA的合成：DNA聚合酶催化核苷酸添加需要正确配对的碱基，空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP。 （2）DNA聚合酶像手一样握住引物：模板接头。聚合酶的3个结构域被称为拇指、手指和手掌。手掌域由一个折叠片构成，含有催化位点的基本元件，尤其是DNA聚合酶的这一区域结合2个二价金属离子（镁离子和锌离子），可以改变正确剪辑配对的dNTP和引物3-OH周围的化学环境。除了催化作用外，手掌域还负责检查最新加入的核苷酸碱基配对的准确性。功能：1）有两个催化位点，一个延长链，别一个是把错误的dNTP排除掉，起校对功能； 2）聚合位点有两个金属离子，它们有利于催化的进行； 3）检测配对的准确性。手指域中的几个残基可与引入的dNTP结合。一旦引入的dNTP与模板之间形成正确的碱基配对，手指域即发生移动，包围住dNTP。功能：1）结合运进来的dNTP，并带到正确的位子； 2）弯曲模板，让模板碱基与dNTP正确配对； 3）稳定PPi的功能。拇指域与催化的关联不紧密，而是与最新近合成的DNA相互作用。还有两个目的：第一，维持引物以及活性部位的正确位置；第二，帮助维持DNA聚合酶与其底物之间的紧密连接。功能：不直接参与催化，但是可保持引物和活性位点处在正确的位置，还可帮助维持DNA聚合酶与其底物紧密连接，有助于添加许多dNTP的能力。 （3）DNA聚合酶是一种延伸酶：DNA聚合酶的催化是快速的。DNA聚合酶能在引物链上每秒添加1000个核苷酸。DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力。延伸能力（processivity）是酶处理多聚体底物时的一种特性。对于DNA聚合酶，其延伸能力定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平均数。 （4）外切核酸酶校正新合成出的DNA： DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸实现的。最初这种类型的酶被认作是DNA聚合酶的同一类多肽，现在则称为校正外切核酸酶（proofreading exonuclease）。这类酶可以从DNA的3端，即从新DNA链的生长端开始降解DNA。3. 复制叉上DNA的两条链同时合成：答：刚分开的模板链与未复制的双链DNA之间的连接区称为复制叉（replication fork），复制叉向着未复制的DNA双链区域连续运动，其身后留下指导两个子代DNA双链形成的两条单链DNA模板。在此条模板链上，DNA聚合酶简单地尾随着复制叉。此模板指导下新合成的DNA链称为前导链（leading strand）。另一条单链DNA模板指导下的新DNA链合成遇到的问题较多，此模板指导DNA聚合酶在与复制叉相反的方向上运动。此模板指导的新DNA链称为后随链（lagging strand）。在后随链上形成的新链DNA短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment），其在细菌中的长度变化为10002000个核苷酸，在真核生物中为100400个核苷酸。4. DNA新链的起始需要一条RNA引物：答：引物酶（primase）是一种能在单链DNA模板上制造短RNA引物（510个核苷酸长度）的特殊的RNA聚合酶。5. 完成DNA复制必须除去RNA引物：答：为了用DNA取代RNA引物，RNA酶H（RNase H）识别并除去各条RNA引物的大部分。最后一个核糖核苷酸是由从5端降解RNA或DNA的外切核酸酶除去的。DNA上的“切口”被称为DNA连接酶（DNA ligase）的酶修复。6. DNA解旋酶在复制叉之前解开双螺旋：答：DNA聚合酶解离双链DNA的两条碱基配对链的能力很差。因此，在复制叉上，由称为DNA解旋酶（DNA helicase）的另一组酶催化双链DNA两条链的分离。每个DNA解旋酶在单链DNA上都沿着一定的方向运动。这是所有DNA解旋酶都具有的特性，称作极性（polarity）。7. 复制前单链结合蛋白使单链DNA稳定：答：一个SSB的结合会促进另一个SSB与其紧邻的单链DNA结合。这称为协同结合（cooperative binding），其发生是因为与紧邻的单链DNA区域结合SSB分子之间也能够结合。8. 拓扑异构酶除去DNA解螺旋时在复制叉上产生的超螺旋。9. 复制叉酶扩大了DNA聚合酶底物的范围。10. 细胞中DNA聚合酶为行使不同的功能而被特化：答：E. coli中至少有5种DNA聚合酶，这些酶依据其酶学特性、亚基组成和丰度而划分。DNA聚合酶（DNA Pol ）是染色体复制中所涉及的最主要的酶。DNA聚合酶（DNA Pol ）专门用于除去起始DNA合成所需的RNA引物。E. coli中的另外3种DNA聚合酶特别用于DNA的修复，它们无校正活性。真核细胞中也有多种DNA聚合酶，通常细胞中有15种以上。其中，对于基因组的复制至关重要的有3种：DNA聚合酶、DNA聚合酶以及DNA聚合酶/引物酶。引物酶合成RNA引物后，所产生的RNA引物-模板接头立即与DNA聚合酶结合以启动DNA的合成。因为DNA Pol /引物酶的延伸能力相对较低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶或聚合酶取代。聚合酶或聚合酶取代DNA Pol /引物酶的过程称作聚合酶的切换（polymerase switching），这导致在真核细胞复制叉上有3种不同的DNA聚合酶在工作。如同在细菌细胞中那样，真核细胞中其他的DNA聚合酶大多参与DNA的修复。11. 滑动夹极大地增加了DNA聚合酶的延伸能力：答：DNA聚合酶在复制叉上具有高延伸能力的关键原因在于它们与被称为滑动DNA夹（sliding DNA clamp）的蛋白质间的结合。12. 滑动夹通过滑动夹装载器打开并安置在DNA上：答：一类称为滑动夹装载器（sliding clamp loader）的特殊的蛋白复合体催化滑动夹的打开并将其安放在DNA上。这些酶通过结合ATP并将其水解而将滑动夹置于DNA的引物-模板接头上。13. 复制叉上的DNA合成：答：E. coli中，这些聚合酶的协同作用是通过它们连接成一个巨大的多蛋白复合体而实现的。此复合体被称为DNA聚合酶全酶。全酶是对一个具有核心酶并结合有增强其功能的其他元件的多蛋白复合体的总称。 当解旋酶在复制叉处解开DNA螺旋时，前导链被迅速地复制，同时后随链以单链DNA的形式伸出，并被SSB迅速地结合。新RNA引物在后随链模板上进行不连续的合成。当后随链上的DNA聚合酶完成前面的冈崎片段时，即从模板上释放出来。因为这个聚合酶与前导链上的DNA聚合酶保持着连接，所以它将与距复制叉最近的并且由后随链上最新合成出的RNA引物所形成的引物-模板接头结合。通过与此RNA引物的结合，后随链上的聚合酶形成一个新的环并启动下一轮冈崎片段的合成。这个模型被称作“长号模型”，以比喻由后随链模板所形成的DNA环状结构大小的变化。14. 复制叉蛋白之间的相互作用形成E. coli的复制体:答：DNA解旋酶与DNA聚合酶全酶之间的相互作用。这个由全酶的夹子装载器元件介导的相互作用将解旋酶和DNA聚合酶全酶连到一起。DNA解旋酶与引物酶之间，在约1秒一次的间隔中，引物酶与解旋酶以及SSB覆盖的单链DNA结合并合成新的RNA引物。复制叉上作用的全部蛋白质的总和称为复制体（replisome）。15. DNA解旋和复制起始发生的特殊位点称作复制起始位点（origin of replication）。16. 复制起始的复制子模型：答：定义所有的DNA均从称为复制子（replicon）的特定的起始位点开始复制。复制子模型提出了控制复制起始的两个元件：复制器和起始子。复制器（replicator）是指足够指导DNA复制起始的整套顺式作用的DNA序列。复制子模型的第二个元件是起始子（initiator）蛋白。此蛋白质特异性地识别复制器中的一个DNA元件并激活复制的起始。17. 复制器序列包括起始子结合位点和容易解旋的DNA：答：复制器的DNA序列有2个共同的特性。第一，它们含有起始子蛋白质结合位点，此位点是组装复制起始机器的核心；第二，它们含有一段富含AT的DNA，此段DNA容易解旋但并不自发进行。18. 结合和解旋：起始子蛋白对复制起始位点的选择和激活：答：起始子蛋白在复制起始过程中一般执行3种不同的功能。第一，这些蛋白质与复制器中的特异DNA序列结合；第二，一旦与DNA结合，它们就扭曲或解旋其结合位点附近的DNA区域；第三，起始子蛋白与复制起始所需的其他因子相互作用，使它们聚集到复制器上。以E. coli起始子蛋白DnaA为例。DnaA与oriC中重复的9核苷酸单位元件结合并受ATP的调控。DnaA还会在复制器所形成的单链DNA上聚集其他的包括DNA解旋酶的复制蛋白。真核细胞中，起始子时一个被称为起始位点识别复合体（origin recognition complex，ORC）的六蛋白复合体。ORC可识别酵母复制器上称为A元件的保守序列，以及次保守的B1元件。ORC可将其他复制蛋白全部召集到复制器上。所以，ORC具有起始子三项常见功能中的两项：与复制子结合并将其他复制蛋白召集到复制器上。19. 蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用指导起始过程：答：起始子（DnaA）结合到oriC并使13核苷酸单位的DNA解旋后，单链DNA和DnaA共同召集双蛋白复合体：DNA解旋酶、DnaB以及解旋酶装载器DnaC。 解旋酶与上面所说的复制叉其他元件之间的蛋白质相互作用指导复制机器其他部分的组装。20. 前复制复合体的形成指导真核细胞中的复制起始：答：复制器选择是对指导复制起始的序列进行识别的过程，发生于G1期（早于S期）。此过程导致基因组中每个复制器上都组装一个多蛋白复合体。起始位点激活只在细胞进入S期后发生，使复制器结合的蛋白复合体启动DNA的解旋和DNA聚合酶的募集。复制器选择是由前复制复合体（pre-RC）的形成介导的。pre-RC被两种蛋白激酶（Cdk和Ddk）激活，使复制得以启动。所有的激酶都在G1期失活，只有在细胞进入S期以后才能被激活。21. 对pre-RC形成和激活的调控使每个细胞周期中仅有一轮复制发生：答：Cdk对于pre-RC功能的调控有两个似乎矛盾的作用：第一，它们是激活pre-RC以启动DNA复制所必需的；第二，Cdk的活性会抑制新pre-RC的形成。 在G1期内没有有活性的Cdk，但是细胞周期的其他期内（S、G2和M期）一直存在高水平的Cdk。因此，在每个细胞周期内，pre-RC仅仅有一次形成的机会（G1期内），而且这些pre-RC被激活的机会也仅有一次（在S、G2和M期虽然实际上所有的pre-RC都被S期的复制叉激活或破坏）。22. 子代DNA分子的分离需要拓扑异构酶。23. 后随链的合成不能复制线性染色体的最末端：答：所有新的DNA合成启动都需要一条RNA引物，这使线性染色体末端的复制成为难题。这种情况被称为末端复制问题（end replication problem）。细胞解决末端复制问题有各种各样的方法。一种解决方法是用蛋白质代替RNA作为每个染色体末端最后一个冈崎片段的引物。多数真核细胞使用完全不同的方法来复制其染色体末端。真核生物染色体的末端称为端粒，它们通常由首尾相连的富含TG的重复DNA序列构成。这种独特的结构可作为新的复制起始位点以弥补末端复制问题。24. 端粒酶是一种新型的DNA聚合酶，它不需要外源模板：答：端粒酶是一种特殊的酶，它既含有蛋白质成分也含有RNA成分（所以这是一个核糖核蛋白的例子）。与其他所有DNA聚合酶相同的是，端粒酶用于延伸其DNA底物的3端。但与大多数DNA聚合酶不同的是，端粒酶不需要外源性DNA模板来指导新dNTP的添加，而是利用其RNA成分作为模板，将端粒序列添加到染色体末端的3端。端粒酶利用其自身的RNA作为模板，特异性地延伸特定单链DNA序列的3-OH。新合成的DNA为单链DNA。25. 为什么真核生物染色体在一个周期中只能复制一次？答：真核细胞分裂所需的事件发生在细胞周期的不同时期。染色体DNA复制仅发生在细胞周期的S期。在此期间，细胞中的所有DNA都必须精确地复制一次。染色体任何部分复制的不完整都可造成染色体之间不适当的连接。互联染色体的分离会引起染色体的断裂或缺失。DNA的重复制也会造成严重后果，使基因组中特殊区域的拷贝数增加。重要调控基因的拷贝数即使增加一个或两个也会导致基因表达、细胞分裂或对环境信号应答的灾难性缺陷。所以，真核细胞每分裂一次，每条染色体中每个碱基对复制且只能复制一次，使极其重要的。26. 端粒酶如何实现端粒的复制？答：端粒酶用其RNA成分与端粒单链DNA区域的3端退火，随后用其反转录活性合成DNA至RNA模板末端。这时端粒酶将RNA从DNA产物上移去，并重新结合到端粒的末端，重复上面的过程。第9章 DNA的突变和修复知识点：1. 突变的本质：答：最简单的突变是一种碱基变成另一种碱基，有两种类型，转换（transition），即嘧啶到嘧啶和嘌呤到嘌呤的替换，如T到C和A到G；颠换（transversion），即嘧啶到嘌呤和嘌呤到嘧啶的替换，如T到G或A以及A到C或T。另一种简单的突变是一个核苷酸或少量核苷酸的插入或缺失。改变单个核苷酸的突变被称为点突变（point mutation）。 其他类型的突变引起DNA的改变较大，如大范围的插入和缺失以及染色体结构的整体重排。2. 有些复制错误能逃脱校正读码：答：有些错误插入的核苷酸逃脱检测并在新合成的链与模板链之间形成错误配对。3. 错配修复能将逃脱校正读码的错误去除：答：保证DNA复制忠实性的最后负责由错配修复系统（mismatch repair system）承担，它将DNA合成精确性又提高了23个数量级。在大肠杆菌中，错配是由错配修复蛋白MutS的二聚体来检测的。MutS扫描DNA，从错配引起DNA骨架的扭曲变形上识别出它们。E. coli的Dam甲基化酶（DAM methylase）使两条链上的5-GATC-3序列中的A残基都甲基化。当复制叉经过两条链的GATC都甲基化（全甲基化）的DNA时，产生的子代DNA双链就是半甲基化的（只有母链是甲基化的）。甲基化使在复制发生错误的时候，使E. coli修复系统能够从母链上找回正确序列的“记忆”设备。真核细胞也能修复错误配对，它们使用MutS（MutS类似物称为MSH蛋白）和MutL（MutL类似物称为MLH的PMS）的类似物完成这一功能。4. DNA的水解和脱氨基作用可自发产生损伤：答：最频繁和最重要类型的水解损伤时胞嘧啶碱基的脱氨基。胞嘧啶可自发进行脱氨基作用，从而产生非天然的（在DNA中）碱基尿嘧啶。腺嘌呤和鸟嘌呤也易于自发脱氨基，脱氨基将腺嘌呤转变成次黄嘌呤，鸟嘌呤转变为黄嘌呤。DNA还通过N-糖苷键的自发水解进行去嘌呤化（depurination），并在DNA中形成脱碱基位点（即脱氧核糖上没有碱基）。 5-甲基胞嘧啶脱氨基产生胸腺嘧啶，不能明显被识别为异常碱基。5. DNA的烷化反应、氧化反应和辐射损害：答：DNA易于受烷化反应、氧化反应和辐射损害。在烷化反应中，甲基或乙基基团被转移到碱基的反应位点以及DNA骨架的磷酸上。DNA还易受到活性氧簇的攻击（如O2-、H2O2和OH）。这些强烈的氧化剂由致电离辐射和产生自由基的化学试剂产生。另一种碱基损伤时紫外线造成的。260nm左右波长的辐射被碱基强烈吸收，其后果之一是在同一多核苷酸链相邻位置上的两个嘧啶之间发生光化学融合。辐射和X射线（电离辐射）有很高的危险性，因为它们可使DNA双链断裂，这很难被修复。某些抗癌药物，如争光霉素也能引起DNA的断裂。电离辐射和像争光霉素那样的试剂，因能导致DNA断裂，所以被认为具有诱裂性（clastogenic）。6. 突变还可由碱基类似物和嵌入剂引起：答：突变还可由可替换正常碱基的化合物（碱基类似物，base analog）或能插入碱基间的化合物（嵌入剂，intercalating agent）导致复制错误而引起。7. DNA损伤的修复：答：如我们所看到的那样，DNA的损伤有两种后果。有些类型的损伤，如胸腺嘧啶二聚体或DNA骨架的切口和断裂，使得复制或者转录受阻。其他类型的损伤产生改变了的碱基，在复制上没有立即产生结构性后果，但是引起了错配，这可在复制之后导致DNA序列上永久性的改变。DNA损伤修复的系统。这些系统最直接的方式是（指真正的修复）修复酶简单地将损伤逆转（撤销）。一个更精致的步骤涉及剪切修复系统（excision repair system），此处受损的核苷酸没有被修复，而是从DNA上被除去。有两种剪切修复，一种仅仅将受损的核苷酸去除，另一种将包含损伤的一小段单链DNA去除。但是，更精致的系统是重组修复（recombinational repair），当DNA两条链都受损（断裂）时采用这种修复。在重组修复也叫双链断裂修复（double-strand break repair）中，序列信息从染色体第二条未受损的拷贝上找回。最后，当DNA聚合酶的复制进程被受损碱基阻碍的时候，一个特殊的移损（translesion）聚合酶以一种不依靠模板和新合成DNA链之间碱基配对的方式经过受损位点进行拷贝。因为移损合成不可避免地具有很高的错误易发性（诱变性），所以细胞在迫不得已的情况下才采用此机制。8. DNA损伤的直接逆转：答：损伤简单逆转修复的一个例子是光复活作用（photoreactivation），光复活作用直接逆转紫外辐射造成的嘧啶二聚体结构。 直接逆转的另一个例子是甲基化碱基O6-甲基鸟嘌呤上的甲基被去除。9. 碱基切除修复酶通过碱基弹出机制除去受损碱基：答：DNA清除受损碱基最普遍的方法是通过修复系统将已变化的碱基除去并替换掉。两种主要的修复系统是碱基切除修复（base excision repair）和核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）。在碱基切除修复中，一种称为糖基化酶（glycosylate）的酶识别并通过水解糖苷键除去受损碱基。在随后的核酸内切步骤中，产生的脱碱基戊糖从DNA骨架上去除。在倾向于和A发生错配的oxoG例子中存在一种防故障机制。一种专门的糖基化酶可识别模板链上oxoG配对位置错误掺入A产生的oxoG：A碱基对。然而在这种情况下，糖基化酶会除去A。因此，修复酶把与oxoG配对的A认作突变，并除去虽没有受损但是却不正确的碱基A。另一个防故障系统的例子是除去与G配对的T的糖基化酶。10. 核苷酸切除修复酶在损伤两侧切割受损的DNA：答：与碱基切除修复不同，核苷酸切除修复酶不能区分各种不同的损伤，而是识别双螺旋形状上的扭曲。这种扭曲引发一连串的事件，导致含有损伤的一小段单链片段（或小区）被去除。去除修复在DNA上产生的单链缺口由DNA聚合酶用未受损的链为模板进行填补，从而恢复原始的核苷酸序列。 核苷酸切除修复不仅能修复整个基因组中的损伤，而且当RNA聚合酶的转录过程被某个基因中发生的转录（模板）链的损伤所终止时，它还能拯救RNA聚合酶。此现象叫做转录偶联修复（transcription-coupled repair），包括将核苷酸切除修复蛋白募集到受阻的RNA聚合酶上。11. 重组修复通过从未受损DNA中找回序列信息来修复DNA断裂：答：切除修复用未受损的DNA链作为模板来代替另一条链上已受损的DNA片段。细胞如何修复DNA中双螺旋两条链都断裂的双链断裂呢？这是由双链断裂修复（DSB）途径double-strand break（DSB） repair pathway进行的。此途径从姐妹染色体中取回序列信息。DNA重组还帮助修复DNA复制中的错误。异源末端连接（NHEJ）的防故障系统发挥作用。NHEJ不涉及同源重组。取而代之的是，通过断裂末端突出的单链之间错排配对，断裂DNA的两个末端直接相互连接。此错排配对是通过小段（可以短至一个碱基对）互补碱基之间的匹配完成的。12. 移损DNA合成使复制通过DNA损伤继续进行：答：细胞不能修复损伤，也有防故障机制使复制机器绕过受损的部位。这种机制就叫做移损合成（translesion synthesis）。移损合成时被一类特化的DNA聚合酶催化的，此酶越过损伤部位直接合成DNA。这些聚合酶一个重要的性质就是，虽然它们是模板依赖性的，但是它们掺入核苷酸的方式不依赖于碱基配对。第10章 分子水平上的同源重组知识点：1. 同源重组的“模式”都包括以下几个关键步骤：答：同源DNA分子的联会。引入DNA断裂。在两条重组DNA分子之间，形成碱基互补的短片段起始区。当来自于亲本分子的DNA分子单链区域与同源双链DNA分子互补链配对结合时，发生该配对过程，称为链侵入（strand invasion）。链侵入的结果是，两个DNA分子被相互交叉的DNA链联系在一起。这个交叉结构被称为Holliday联结体（Holliday junction）。Holliday联结体的剪切。在Holliday联结体处切断DNA重新生成两个分开的双螺旋DNA，从而完成遗传物质的交换过程。这个过程叫做拆分（resolution）。2. Holliday模型揭示了同源重组的关键步骤：答：Holliday模型很好地解释了DNA链侵入、分支移位和Holliday联结体拆分等同源重组的核心过程。3. 双链断裂修复模型更加准确地描绘了许多重组事件：答：同源重组经常因DNA双链断裂而启动。描述这种遗传交换反应的常用模型是双链断裂修复途径（double-stranded break-repair pathway）。始发事件是两条DNA分子中的一条发生了双链断裂（double-stranded break，DSB），而另外一条保持完整。 在双链断裂模式下，这种单向的遗传物质交流有时会留下一个遗传标记引发基因转换（gene conversion）事件。4. DNA双链断裂来自于多事件并启动同源重组：答：同源重组除了能修复染色体DNA双链断裂外，还能促进细菌间的遗传物质交换。 同源重组是真核细胞中修复DNA断裂和复制叉停滞的关键步骤。5. RecBCD解旋酶/核酸酶加工用于重组的DNA分子断端：答：RecBCD酶作用于断裂的DNA分子以产生单链DNA区域，RecBCD也可协助链交换蛋白质RecA结合到单链DNA末端。另外，RecBCD所拥有的多种酶活性提供给细胞一种“选择”，或是与进入细胞的DNA分子发生重组，或是降解它。RecBCD蛋白的激活受控于一段特殊的chi（cross-over hotspot instigator）DNA序列。遇到chi位点后，RecBCD的核酸酶活性发生变化。随着RecBCD移入chi位点之外的远端序列，它不再依35方向剪切DNA，而是以更高的频率剪切另一条53方向的DNA链。这种变化的结果使一条双螺旋DNA变成有一条凸出的，chi位点位于3端单链的DNA。这种结构适于RecA蛋白的组装，并引发链交换。为了让RecA而不是SSB结合到DNA上，RecBCD直接与RecA结合以利于该蛋白质的组装。6. RecA蛋白在单链DNA上组装并促进链侵入。7. 在RecA蛋白丝的基础上建立新的配对DNA：答：RecA催化链交换过程可以分为不同阶段。首先RecA蛋白丝必须组装在其中一个参与的DNA分子上，组装发生在具有单链DNA区域（如单链DNA末端）的DNA分子上。RecA可促进寻找同源序列，这是因为蛋白丝结构具有两个不同的DNA结合部位：主要位点（结合第一个DNA分子）与次要位点。当一个碱基互补的区域被定位后，RecA促进这两个DNA分子形成一个稳定的复合体。这个与RecA结合的三链结构被称为连接分子（joint molecule），通常包含杂