真菌学实验指导.doc

前言本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。本指导书适用于生物技术和生物科学专业。目录1、实验：内生真菌的分离及鉴定32、实验报告基本内容要求73、实验报告格式8实验 内生真菌的分离及鉴定实验学时：18实验类型：综合实验要求：选修一、实验目的1.了解真菌形态的基本特征。2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。二、实验内容采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。三、实验原理、方法和手段（一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。（二）实验手段和方法1、内生真菌分离纯化方法1.1样品的表面消毒及预处理分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成11cm2大小置于PDA固体培养基上。对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂（浸）洗2-3min无菌水冲洗4-6次0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）无菌水冲洗4-6次用灭菌滤纸吸干多余水分无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.50.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。1.2内生真菌的分离与纯化将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养5块组织块）于27恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。观察菌丝生长情况及污染情况。培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。纯化3-4次以保证所得菌落为纯培养。2、真菌的形态学鉴定方法对分离到的内生真菌的分类鉴定主要根据宏观的培养性状（菌落形态），微观的个体形态特征及一些生物学特性进行经典分类研究。2.1 培养性状（菌落形态）培养基：查氏培养基（Czapek agar）、沙氏培养基和PDA培养基。方法：将固体培养基制成平板，以点植法接钟，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板的中心位置，然后于25-28培养一定时间（通常为7天或14天）进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜等。观察的要点：大小：以菌落的直径（mm）表示。颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。2.2个体形态菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等分生孢子梗：分支情况-简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光滑等。产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互生或成轮生体）分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜链或聚集成头）2.3真菌制片方法粘片法胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。2.4显微摄影照片在Motic数码显微镜下，观察并选取具典型性状特征的视野拍照、直接测量相关数据和进行描述记载。2.5菌种的鉴定根据描述的菌种的特征，索引分析相关文献，综合分析对比相关特征的异同，最后确定待定菌株的分类地位。3、真菌的分子生物学鉴定方法3.1真菌菌丝的获得（1）固体培养基培养菌丝体对于气生菌丝较多的真菌可以选择PDA固体培养基在培养皿上培养，在固体培养基平板上铺一层玻璃纸，27培养5-7天。将3-4个用培养皿平行培养的新鲜菌丝小心地刮下，收集在一起，以备进行DNA提取。在刮取菌丝体时，要注意的是不要把培养基一起刮下来，以免对提取DNA造成影响。（2）液体培养基培养菌丝体培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。将液体培养基以100mL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口。121，蒸汽灭菌20min。将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27、120rpm培养5-7天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝球5次，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。40下烘干菌丝，但是不要过于干燥，然后进行DNA的提取。3.2基因组DNA的提取DNA提取采用CTAB法。CTAB（cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。CTAB法的好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到高含量的DNA。用CTAB法提取材料DNA的具体步骤如下：(1) 将CTAB buffer在65水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；(2) 取0.1g左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入5mL预热的提取液及10L-巯基乙醇，混合均匀后把混合液转入1.5mL离心管中700L/管；(3) 于65水浴保温0.5-1h，时间不能超过1.5h。保温期间要轻轻振摇几次；(4) 冷却至室温后，加入等体积(700L)的饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分混匀后静置10min。(5) 离心(12000rpm，10min，室温)，去沉淀，将上清液转入干净离心管中。 (6) 根据杂质的去除情况重复步骤4、5数次，直至无杂质；(7) 加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次以去除饱和酚，离心(12000rpm，10min，室温)；(8) 将上清液逐滴加入两倍体积的-20预冷无水乙醇，以沉淀出DNA。室温放置10-20min，可以过夜；(9) 挑取或离心去上清液(10000 rpm，5min)的方法取出DNA；用75%乙醇洗涤两次；(10) 37保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中4备用。3.3多聚酶链式反应(PCR扩增)3.3.1引物ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC3.3.2扩增条件扩增体系PCR反应体系为50L体系，包括：10PCR buffer： 1/10MgCl2 ： 1.5mM，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）： 各200M，Primer1 0.2M，Primer2 0.2M，Taq酶： 12.5U，DNA模板： 约100ng。扩增条件预变性 95 5min变性 95 1min复性 51 1min 3035个循环延伸 72 1min 延伸补齐 72 10min3.3.3扩增产物的纯化及序列的测定 送测序公司。4、保存方法将所分离的所有纯化菌株采用两种方法保存。斜面低温保藏法：将菌株接种至PDA固体斜面培养基上于27下培养，待菌落长满斜面，观察没有污染后，放于4的冰箱中保存。这种保藏方法适合本实验条件下各菌种的保藏，保藏时间为三个月到六个月，传代次数过多时容易导致菌种变异退化。无菌水保存法：在柱形Eppendorf离心管中加入2/3体积的蒸馏水，蒸汽灭菌，将带有菌丝的琼脂小块放入无菌水中，4的冰箱中保存。此法保存菌株的时间要长于斜面保存。用这种保藏方法可以保藏1-2年。比较而言这种方法是较好的菌种保藏方法。四、实验组织运行要求采用“集中授课，学生自主训练为主的开放模式组织教学。”五、实验条件 仪器设备：高压蒸汽灭菌锅，培养箱，调温电炉、摇床、磁力搅拌器、15W紫外灯、超净工作台、离心机等。1.5mL eppendorf 离心管，研钵，解剖刀，镊子，纱布，滤纸，三角瓶等；胶带，剪刀，镊子，解剖刀，纱布，滤纸，脱脂棉，三角瓶，9或10cm培养皿，玻璃棒，接种钩，接种环 药品和试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P043H2O、MgSO47H2O，马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。六、实验步骤（一） 培养基配置 1、马铃薯、葡萄糖琼脂培养基 马铃薯汁 1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g （注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。） 2、察氏琼脂培养基 蔗糖30g，NaNO3 3g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，K2HPO4 1g，琼脂13g，蒸馏水1000ml，自然pH 3、沙氏培养基蛋白胨 1g，葡萄糖或麦芽糖 4 g，琼脂 1.5克，水 100 ml。制法：1将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH即有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，高压11520分钟。趁热斜好，凝固备用。4、马丁氏培养基葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1%孟加拉红3.3mL，琼脂20g， 水 1000mL，pH值自然。抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素40U/mL，青霉素30U/mL用量加入，冷却到45左右未凝固时加入抗生素，混匀倒平板。乳酸石炭酸棉蓝染色液棉蓝（苯胺蓝或甲基蓝） 0.025g，乳酸（比重1.20）10g, 石炭酸（结晶）10g，甘油（比重1.25）20g，蒸馏水 10 mL。（二）实验步骤 1、采样 2、内生真菌分离、纯化并保存菌种 3、菌种形态鉴定（1）将4保存菌种活化2次；（2）将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复3；（3）25恒温培养箱培养7天；（4）然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带子粘片法），观察个体形态；（5）另两个平行继续培养至14天，取出；（6）重复步骤4，作为最终描述结果；（7）根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。4、分子生物学鉴定（1）菌种培养，获取菌丝体（2）提取基因组DNA（3）PCR扩增ITS序列（4）测序（5）序列分析（6）结合形态特征对菌株进行初步鉴定八、实验报告 基本内容详见附件。附件1实验报告的基本内容及要求1实验预习在实验前每位同学都需要对本次实验进行认真的预习，并写好预习报告，在预习报告中要写出实验目的、要求，需要用到的仪器设备、物品资料以及简要的实验步骤，形成一个操作提纲。对实验中的安全注意事项及可能出现的现象等做到心中有数，但这些不要求写在预习报告中。2实验记录学生开始实验时，应该将记录本放在近旁，将实验中所