酵母表达培养基介绍.doc

毕赤酵母表达的培养基配制52.1 LB（LuriaBertani）培养基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl lPH 7.0制作平板时加入 2琼脂粉。121高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZA原核宿主菌TOP10F时可加入Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.5PH 7.0制作平板时加入 2琼脂粉。121高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZA原核宿主菌TOP10F时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4条件下保存12周。2.3 YPD （又称YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 g/ml 液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4条件下保存12周。2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeocin 100 g/ml不管是液体 YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4条件下，有效期12周。2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的 10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4保存，保存期为2个月。2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀，4保存，保存期为2个月。2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。4保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4保存。2.9 RD及RDH平板的制备1. 将186g的山梨醇和15-20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60水浴；2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3. 迅速制备平板。4可保存数月。2.10 RD及RDH 的TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将186g的山梨醇和 7.510g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、 100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至 45后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TOP琼脂置于45水浴冷却、保温，备用。2.11 MD与MDHMinimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）1. 100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入1520g的琼脂。4可保存数月。2.12 SOC培养基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.05Glucose (1mol / L) 2%121高压灭菌 20min，冷却后，4保存 2.13 MM培养基：M9母液：64g磷酸氢二钠，15g磷酸二氢钾，2.5g氯化钠，5.0g氯化铵加1L水灭菌取M9母液200ml加水700ml,加2ml1mol/l已灭菌的硫酸镁，加100微升已灭菌的1mol/l氯化钙（可加可不加）。注意硫酸镁和M9母液要分开灭菌不然会有沉淀。在M9培养基基础上添加0.5%葡萄糖即为MM培养基。2.14 BMGY /BMMY培养基：酵母粉：1.0克，蛋白胨：2.0克，YNB：1.34克，0.1mol/L pH6.0(或者pH7.0)磷酸缓冲液，甘油：1.0毫升，加蒸馏水到100mL 2.15 BMM培养基，全称：Buffered minimal methanol 即最小缓冲甲醇培养基，常用于表达分泌型蛋白的培养基。配制：100mM pH6.0磷酸钾 1.34%YNB 410-5%生物素 0.5%甲醇1. 灭菌700ml 水，2. 冷至室温，加入下列：100ml 1M pH6.0磷酸钾缓冲液, 100ml 10YNB, 2ml 500B, 100ml 10M3. 放置于4 度，可放2 个月 10YNB （13.4%酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸）溶解134gYNB于1000ml水中，过滤除菌，加热至YNB 完全溶解，存于4 度。或者用34gYNB（不含硫酸铵不含氨基酸），100g 硫酸铵进行配制，可放1年。注意毕赤酵母在高浓度YNB下生长更好。YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his用。YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。用无机盐进行大规模发酵，更省钱。大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计34瓶氧气。关于Tryptone和Peptone的选择：1）用培养E.coli的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好2）Tryptone和Peptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在Peptone中好但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。3）如果要求不高，一般使用也还凑合尽可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌4）用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen说明书说 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。配制500BIOTIN stock solution（0.02）有这么3种方案：1）、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2）、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3）、水浴加热，温度不能高于50度。D生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。所以肯定要加的。附：无机培养基配方BSM无机培养基：85% H3PO4 26.7ml/LCaSO4 ?2H2O 0.93g/LK2SO4 18.2g/LMgSO4?2H2O 14.9g/LKOH 4.13g/L甘油 40g/LPMT1 4.0ml/L100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸铵调pH5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。诱导表达前调pH6.0。pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。BSM高压灭菌后再