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微生物平时作业一、产黄青霉生产青霉素的具体生产流程，并阐述每一个步骤的生产原理。1928年英国细菌学家Fleming首先发现了世界上第一种抗生素青霉素，1941年前后英国牛津大学病理学家霍华德弗洛里与生物化学家钱恩实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，弗莱明、弗洛里、钱恩三人共同获得1945年诺贝尔奖。目前所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的，有些抗生素已能人工合成。由于不同种类的抗生素的化学成分不一，因此它们对微生物的作用机理也很不相同，有些抑制蛋白质的合成，有些抑制核酸的合成，有些则抑制细胞壁的合成。（一）青霉素的生产工艺图培养基配置原料孢子制备产黄青霉菌过滤器空气灭菌种子罐分过滤器发酵罐预处理罐过滤器液体菌丝第一萃取器动物饲料活肥料洗涤精制柱第二第三萃取器蒸发器过滤器结晶洗涤过滤器蒸发器结晶青霉素钾盐（二）菌种 青霉素生产菌株一般为产黄青霉，根据深沉培养中及菌丝体的形态，分为球状菌和丝状菌。在发酵的过程中，产黄青霉的生长发育可分为6个阶段。 1、分生孢子的I期； 2、菌丝繁殖，原生质体嗜碱性很强，有类脂肪小颗粒产生为期；3、原生质体嗜碱性仍很强，形成脂肪粒，积累贮藏物为期；4、原生质体嗜碱性很弱，脂肪粒减少，形成中、小空泡为期；5、脂肪粒消失，形成大空泡为期；6、细胞内看不到颗粒，并有个别自溶细胞出现为期。 其中，I期称为菌丝生长期，菌丝的浓度增加很多，但产生的青霉素较少，处于该时期的菌丝体适用于做发酵的种子。期是青霉素的分泌期，此时菌丝体生长缓慢，并大量产生青霉素，是菌丝体自溶期。（三）发酵设备灭菌1、实罐灭菌：（1）预热（8090）（2）直热（蒸汽）（120、30min）（全进全出原则）（3）待空气压力高于罐内压力时，通入空气。 2、空罐灭菌：130，4560min，直接蒸汽法3、连续灭菌：配料（预热）。冷却系统水应排净（夹套与盘管）连消塔维持罐冷却管无菌培养基。 4、空气过滤除菌（四）孢子制备和种子罐1、丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管（25，孢子培养，7天）斜面母瓶（25，孢子培养，7天）大米孢子（26，种子培养56h,1:1.5vvm）一级种子培养液（27，种子培养，24h,1:1.5vvm）二级种子培养液（2726,发酵,7天,1:0.95vvm）种子发酵罐（25，6h）发酵罐。2、球状菌二级发酵工艺流程冷冻管（25，孢子培养，68天）亲米（25，孢子培养，810天）生产米（28，孢子培养，5660h,1:1.5vvm）种子培养液（2625-24，发酵，7天，1：0.8vvm）种子发酵罐（25，6h）发酵罐。（五）培养基配置1、碳源 青霉素可以利用多种碳源，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、乙醇、植物油等。其中大约65%碳源用于维持细胞代谢，25%用于生长，10%用于生产青霉素。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。2、氮源 氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。玉米浆除做为氮源外，还提供附加营养和侧脸前体。3、无机盐无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。（六）发酵条件控制1、温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。2、PH值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。3、溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。4、菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。5、菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。6、菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。7、菌丝形态 在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触, 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 (即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。（七）青霉素的分离与提纯1、放罐 冷至15 发酵液 鼓式真空过滤1/21/3发酵液 过滤 次滤液另加剩余发酵液 板框过滤PH4.4PH4.6，10下，水损洗28% 二次过滤 一次BA提取（10%硫酸，调PH2.02.2，加5%PPB逆流萃取） 一次BA提取液 缓冲液提取（1.6%碳酸氢钠，PH6.87.1）缓冲提取液 二次BA提取（10%硫酸，调PH2.02.2，低效价BA逆流萃取） 二次BA提取液 脱水脱色（活性炭100300g/10亿零下10冷冻脱水） 脱色后二次BA提取液 无菌过滤（石棉过滤版，绸布微孔薄膜，过滤除菌。） 结晶液 结晶（醋酸钠溶液，2