分离鉴定

第五章 病毒的分离鉴定,病料的采集与保存病料的处理接种（鸡胚、实验动物、细胞）组织培养细胞中病毒增殖的判定病毒感染力的滴定免疫学检测分子生物学检测病毒理化学特性的测定,病毒分离鉴定的步骤:,病料采集的基本原则,尽量无菌操作，避免细菌污染尽早采集病料，尽快送检，低温运输根据动物及病毒的种类不同采集不同的组织病料同一疾病，不同病程取不同标本检材容器贴上标签，并在相应化验单详细填写检验目的、标本种类、临床诊断及其他常规项目,采集病料后应尽快冷冻保存,病料采集后的保存,-30可保存几个月-70可保存几年,怀疑为疱疹病毒的感染材料，可置-50或4保存现场采集病料，应尽快置装有冰盐混合物的冰瓶内，送往实验室或冷藏地点。,脑、肝、肌肉等器官或组织,病料的处理,充分研磨后加入5倍量的Hanks液（内含青霉素、链霉素各200U/ml）。反复冻融3次。2000r/min离心10min。取上清（过滤后）作接种物。,鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物,用内含1000u/ml青、链霉素（P.S）的Hanks液，将其稀释3-5倍。充分混匀悬浮后，置4冰箱内感作2-4h或过夜。2000r/min 10min取上清（过滤）作接种物。,咽喉拭子或鼻拭子,仔细用棉拭子擦拭咽喉部或鼻部。迅速将其泡入盛有2-5ml Hanks液（200-500u/ml P.S）的试管内，充分涮洗棉拭子。反复冻融3-5次，收集液体部分。2000r/min 10min，收集上清（过滤）作接种物。,粪便,无菌的体液或鸡胚液,用棉拭子插入肛门沾取或扑杀病畜后由肠管采集。用含1000u/ml P.S的Hanks液作10-20倍稀释。4感作4h。2000r/min 10min取上清（过滤）作接种物。,直接作接种用,本动物：马传贫病毒、猪瘟病毒、鸡瘟病毒实验动物鸡胚：正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、脑炎病毒组织培养细胞,接种方法,病毒增殖的判定病毒感染力的滴定（TCID50或PFU及对动物的毒力）病毒的生长曲线免疫学检测 SNT、HA和HI、LAT、IHA、AGID、ELISA分子生物学方法 PCR与序列测定、核酸杂交、病毒基因组限制性内切酶图谱,原理：设药物处理组（试验组）与正常不处理组（对照组），分别测定两者的TCID50值（或PFU），以试验组的TCID50比对照组低2个对数以上判为阳性，1-2个对数之间判为可疑，1个对数以上判为阴性。 试验组 对照组 结果判定TCID50/0.1mL 10-2 10-5 阳性 10-3.5 10-5 可疑 10-4.1 10-5 阴性,病毒理化学特性的测定 主要测定病毒对不同理化因子的敏感性。,药物抑制试验 FUDR （5-氟脱氧尿苷） IUDR （5-碘脱氧尿苷） BrUDR（5-溴脱氧尿苷）原理：FUDR、IUDR、BrUDR是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无功能分子，抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。,病毒核酸型鉴定,Feulgen染色 用于鉴定细胞内的DNA病毒。原理：胞核和胞浆内的DNA包涵体呈紫红色团块状。吖啶橙染色 用于鉴定是单链病毒还是双链病毒。原理：单链核酸染成火红色，双链核酸染成黄绿色。未感染病毒的细胞的胞核呈黄绿色，核仁呈橘黄色，胞浆呈暗红色。感染双链DNA病毒的细胞的核内，出现黄色荧光样物质的微小丝块，核内包涵体也呈黄绿色。感染单股RNA病毒的细胞内，病毒复制区呈橘红色。,乙醚敏感试验 用终浓度为20%的乙醚处理病毒（ 4内作用24h），离心取病毒液；同时设对照。滴定两组病毒的TCID50。氯仿敏感性试验 用终浓度为4.8%的分析纯氯仿处理病毒（4振荡混合10min）。随后离心取病毒液。同时设对照。测定两组病毒的TCID50 。,脂溶剂敏感性试验,脊髓灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒对胰酶有较强的抵抗力痘病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒易被胰酶灭活用终浓度为0.5%的胰蛋白酶处理病毒液（37 1h），然后加入灭活犊牛血清8ml终止胰酶的作用。同时设对照。最后滴定两瓶病毒的TCID50。,胰蛋白酶敏感试验,用0.1mol/L HCl将病毒液的pH调至3.0(or 5.0)37水浴或室温中感作2h(or 1h)用5.6% NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右。对照组加入等量的培养液同样处理。测定两者的TCID50。,耐酸性试验,将病毒液分成若干瓶，留1小瓶作对照，其余的置不同温度下作用相同时间或置相同温度下作用不同时间。然后测定每瓶病毒的TCID50。 50、60、70、80水溶1h50水浴5、10、15、30、60、180min,耐热性试验,电子显微镜直接观察 磷钨酸负染后，透射电镜观察 超速离心沉淀滤过试验 取澄清的病毒液在正压下依次通过不同孔经（450nm、225nm、100nm和50nm）的滤膜，每通过一种孔径的滤膜就吸取1ml滤液作为样品。最后测定原病毒液以及各级滤液的TCID50。,病