分子生物学常用技术PCR

分子生物学常用技术,凝胶电泳,分子杂交技术,PCR 技术,DNA 物理图谱 DNA序列测定 生物芯片,“基因靶向”技术,RNA干扰技术,PCR 内容包括: PCR 技术的发明 PCR 扩增产物的分析 PCR 技术基本原理 PCR 条件优化 PCR 反应体系 PCR 技术的发展史 PCR 反应条件 PCR 技术的应用 (请自学),PCR 技术,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 体外核酸扩增技术将目的基因或某一DNA片段于数小时内体外扩增至百万倍,千万倍。 PCR技术是生物医学领域: 革命性创举和里程碑。 迅速渗透到各个领域: 分子克隆、 目的基础检测、基因诊断、基因表达调控,、 法医学鉴定、食品卫生,、环境监测考古学等。,简便、特异、快速、灵敏、产率高、 重复性好、易自动化等 可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定，用PCR几小时便可完成。 DNA克隆重组, PCR, DNA序列分析构成了整个分子生物学实验工作的基础。,PCR 特点:,RT-PCRRAPD-PCRRandom Amplification of Polymorphic DNA.DDRT-PCR差异显示反转录PCRLAM-PCRLM-PCRInverse PCRNested PCRReal-time PCRRACE,Multiplex PCRAnchored PCRImmuno PCRAsymmetric PCRLP-PCRRecombinant PCR SSCPIn situ PCRFlow chip PCR,PCR相关技术层出不穷请自学,(一): PCR技术的发明,1971年: Korana 设想 本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想： “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。,1983年: Kary B. Mullis (1944 -) 在Cetus公司工作期间， 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 常为没有足够多的模板DNA而烦恼。一天晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物去扩增模板DNA 的想法.,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合DNA， ,1985年: Mullis PCR设想的实现 原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供: 摸板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系、DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 Mullis使用是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段. 缺点是： 1): Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都要重新加。 2): 特异性差: 引物链延伸反应在37下进行，模板和引物之间的碱基错配，合成的DNA片段不均一。,1988年: Keohanog 改用T4 DNA聚合酶进行PCR，扩增的DNA片段均一，特异性高。但不耐高温, 每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等: 从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶: 耐高温，93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在952h后残留活性: 40%. 1):不必在每次扩增反应后再加新酶; 2):大大提高了特异性, 扩增效率和灵敏性，增加了扩增长度(2.0Kb)。 此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 Taq DNA多聚酶的发现使PCR得以广泛应用。,1993年: Mulis 众望所归地获得了诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了PCR技术。,1998-1999年: BillClinton 唯一一个在全美国人面前就自己的性丑闻事件道歉的美国总统, 因为 1): 有了 PCR技术, 2):不懂PCR技术。 1998年，美国总统比尔克林顿曾当众宣称，他与白宫实习生莱温斯基“没有发生任何性关系”，但莱温斯基随后出示了一条沾有克林顿精液的蓝裙子。8个月后，克林顿不得不被迫承认错误,一样的PCR、一样的美国人,(二): PCR技术基本原理,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1): 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右后，双链DNA变性为单链DNA ； 2): 模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3): 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。,PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。最终的DNA 扩增量可用下列公式计算 Y(1X)n Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。,产物持续增加直到平台期,Theoretical increase,Log Target DNA,Cycle #,Y(1X)n,反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期(Plateau). (引物、 dNTP反应原料消耗、 PCR 扩增效率及DNA聚合酶种类和活性及非特异性产物的竟争等因素)。 大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,PCR扩增产物 长片段产物 短片段产物 长片段产物和短片段产物是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是向3端开始延伸， 其5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。,“短产物片段”按指数倍数增加 “长产物片段”以算术倍数增加（原始模板拷贝X 循环次数， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。,Y(1X)n,PCR 原理 演示 :,(三): PCR反应体系,标准的PCR反应体系： Total volume 100ul(20-100ul) 10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul,PCR反应五要素： 引物、Taq酶、dNTP、模板、 Mg2+,1: 引物： 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增. 引物量： 每条引物的浓度10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配, 非特异性扩增和二聚体的机会。,设计引物应遵循以下原则： 1): 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。2): PCR产物： 200-500bp，可扩增长至30kb的片段。3): 引物碱基：G+C含量以40-60%，G+C太少扩增效果不佳， G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免4个 单一碱基的连续出现。4): 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别 是3端的互补，否则会形成引物二聚体。,Stable Interaction,Amplification,Primer Dimers,5): 引物3端的碱基应严格要求配对，以避免因末端碱基 不配对而导致PCR失败。6): 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无 明显同源性. 7): 引物5端加上合适的酶切位点，这对被扩增的靶序列 的酶切分析或分子克隆很有好处。在算Tm值时不算, 但 在检测互补和二级结构是要加上它们 8): 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的 偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用 较高的引物 浓度(1uM-3uM) 9): 最好学会使用一种design software. PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.,设计引物应遵循以下原则续：,2: 酶及其浓度 两种Taq DNA聚合酶: 1):一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 2): 基因工程酶 催化一典型的PCR反应约需酶量: 2.5U(总反应体积为100ul) 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,3: dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。用1M Tris.HCL的缓冲液7.07.5配成高浓度后，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度偏高或偏低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,4: 模板核酸 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。 RNA模板提取一般采用Kit提取，要防止RNase降解RNA，。,5: Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增。 Mg2+浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,(四): PCR反应条件: 温度 (变性-退火-延伸)时间 (变性-退火-延伸)循环次数,1: 变性温度与时间： 94 30-60 sec 变性温度低，解链不完全。 一般情况下，93941min足以使模板DNA变性 温度过高，高温环境对酶的活性有影响。 不完全变性，就会导致PCR失败。,2: 退火温度与时间： 4060 3060sec 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,3: 延伸温度与时间：常用温度为72 Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子PCR反应的延伸常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。 低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,4: 循环次数:2540次 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。模板DNA少 ,酶质量活性差, 适当 增加循环次数. 一般的循环次数选在2540次之间， 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,(五): PCR扩增产物的分析 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定。 1. 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观 察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预 计的一致。2. 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应 的酶切、获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴 定，还能进行变异性研究。3. 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据， 也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。4. 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。,(六): PCR 条件优化,1: 理想的primers: 特异地与目的序列两侧的单一 DNA序列而非其他DNA序列退火的引物,2: 优化反应试剂浓度: a): Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相 互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的 情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，调整了 dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度;,b): NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的 严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用; c): polymerase ：不同公司的酶质量活性有所不同,需要自己摸索适合的酶的浓度; d): template 50ul PCR SYSTEM = human DNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng LamadaDNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng =,3: 温度: a. denaturation 常规是先94度变性5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟 ;然后94度30-60S. b. annealing 重点：一般情况下, 是从Tm - 5C度根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有一些活性. 所以在annealing的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增，如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.,4: touchdown PCR 原理很简单,连续降低annealing temp从Tm+5 - Tm-10度C 。ANNEALING TEMP. 55度 94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s 72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s 51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s 72 1min 20cycles 72 5min,5: hot start PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。,hot start polymerase 激活：94度 10-15min,限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是: a): 在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性. b): 在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。 c): 其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时， 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。 d): hot start polymerase 94度 10-15min,6: Booster PCR (热心的拥护者, 后推的人, 支持者, 后援者, 调压器)开始几个cycles保持primer的低浓度 1ug human genomic DNA 大约在3X100,000个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molar ratio在10, 000,000 10 0,000,000:1. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平,7: 循环数和长度 确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数. 产物的量不够, 优化的方法有: 1): 增加TEMPLATE 2): 增加循环数 如何确定循环数：做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数 另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高 越好.,8: thermal cycler PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度. 现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).,9: PCR增强剂 enhancer实在是多种多样.基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量: dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%, formamide at 5%, trimethylammonium chloride 10-100uM, detergents such as Tween 20 0.1-2.5% , polyethylene glycol (PEG)6000 5-15% ，glycerol 10-15% , single stranded DNA binding proteins ，Gene 32 protein 1nM , E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM ，7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP , Taq Extender (stratagene) ，Perfect Match PCR Enhancer(stratagene) , Q-solution(Qiagen),10: Template DNA preparation 提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase. 11: Nested PCR 简单点说 设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况.,Laboratory Technique,Use Clean Bench (Hood)Use Nuclease free tubes Use Aerosol Resistant TipsUse Calibrated MicropipettorUse Large Volumes (5uL and up)Pipette Into Each Reaction Vessel Only Once,(七): PCR仪技术的发展史,聚合酶链式反应自从1993年到现在很快经历了四代产品： 第一代：手动/机械手式水浴基因扩增 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94）低温复性温度（如58），适温延伸温度（如72）。用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴，标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。特点是：劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，它无须升降温过程，实验时间短，液体污染等。 机械手装置，替代上述手工移动标本过程，形成了机械手水浴式基因扩增仪，该改进解决了实验人员的高强度劳动问题，但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。,第二代：自动化控制型定性基因扩增仪 也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。第二代的定性PCR只能判断阴性阳性，而无法评价特定核酸的浓度及定量分析 第三代：终点定量/半定量 自从1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪以来，PCR技术和应用从定性向定量快速发展.终点定量PCR的优点是设备投资少。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品.,第三代：终点定量/半定量(Terminal detection） 终点检测法就是PCR扩增反应结束后，对其产物进行分析和定量检测的一种方法。为了实现对PCR终产物的定量检测，必须对PCR产物进行预先标志。 目前标志物有：放射性同位素和非放射性标志物。后者包括螺旋结构染料（如溴化乙锭等）、地高辛、生物素以及荧光素（包括普通荧光素如Fam、TRAMA和镧系螯合物等），地高辛、生物素以及荧光素可以通过标志dNTP或引物的5端从而掺入PCR扩增产物中，除荧光素标志产物可直接发光外，其余可与HRP或AKP标志的抗地高辛抗体或亲和素反应，加入底物后产生颜色、发光或荧光信号，从而进行检测。这些标志物进行标志的是检测时的捕获剂或是作为定量检测的指示剂. 终点法检测要特别注意“平台效应”对实验结果的影响,第四代：实时定量PCR (real-time PCR) 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量检测系统： PCR仪实时荧光定量试剂+电脑+自动分析软件，。,常规PCR,常规PCR基于产物扩增终点分析,凝胶电泳分析,对目的基因的有无进行定性分析,普通PCR和定量PCR的区别,适用定性分析，不适合定量分析；PCR 产物的长度从100bp 数kb,实时检测:每个循环都产出荧光信号绝对定量，灵敏度更高 PCR产物的长度一般在 60-150 bps,产物持续增加直到平台期 Real-time PCR 在指数期线性范围内进行荧光检测.,Theoretical increase,Log Target DNA,Cycle #,没有任何仪器可以检测到初始循环中非常低的产物荧光，只能检测到背景荧光水平。,PCR: Theory vs. Reality,产物量n= (初始模板量)2n (n = 循环数),Why are end point measurements so different?,All PCRs reach a plateau phase eventually.too much product, enzyme exhaustion, dNTPs run out etc,Consider the example. If you stopped after 40 cycles, you could not differentiate a 1000 fold difference in starting material!,Therefore measuring at some arbitrary end of cycling can not conclusively identify the original amount of material,实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 - Ct阈限循环 值。C代表Cycle，t代表threshold， Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图所示）。,What is Threshold Cycle (CT)?,For any quantitative measurement: establish a baseline to identify a value of no significant activity in the experimental parameters.Set threshold: is an amount over the baseline that indicates action in the experiment. It should be higher than the baseline to ensure that normal drift of the baseline is excluded. It should be close enough to the baseline to detect the first significant change in your data. The Threshold Cycle (CT) is the cycle of the amplification reaction in which the sample fluorescence signal rises above the threshold value.,2. 荧光域值（threshold）的设定 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍.,3. Ct值与起始模板的关系 研究表明：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,初始模板量相差10倍，Ct值相差3.32个循环.,1 X 106 1 X 105 1 X 104 1 X 103 1 X 102,17.09 0.04 20.10 0.06 23.41 0.0526.68 0.0530.26 0.26,(Template0)2n = (Template0)10n=3.32,Input C(t),C(t) Analysis,初始模板浓度相差2倍，Ct值相差1个循环,产物量n= (初始模板量)2n (n = 循环数),C(t) Analysis,初始模板量的对数与Ct值之间存在反比线性关系 较高的初始模板浓度有较低的C(t).,Threshold Cycle, Ct, is a reliable indicator of initial copy number,R=0.99882,核酸染料技术 代表：SYBR Green I (SGI)荧光探针技术 代表：TaqMan probe,SYBR Green I 与dsDNA结合 SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍.,Real-Time Chemistry: SYBR Green I,Real-Time Chemistry: SYBR Green I,优点 仅需要一对引物，实验设计简单。 PCR扩增后可进行产物的熔解曲线分析，以确 定特异性。 实验成本低。 不足 特异性仅由引物保证。 非特异性双链DNA也会产生荧光信号。 不能用于多重Real-Time PCR。,SYBR Green,HOW IS REAL TIME DONE?,Taqman probe From Perkin-Elmer/ABI,A hybridization probe is constructed with a fluorescent reporter at one end to a nearby quencher. The reporter is excited but its emitted fluorescence is captured by the nearby quencher. No reporter fluorescence is detected.,Fluorescent Tag,Target Sequence,Reporter,Quencher,During the extension step, the polymerase encounters the TaqMan probe and chews off the end.,ONCE FREED FROM THE QUENCHER, THE REPORTER FLUORESCENCE IS DETECTED, INDICATING TARGET AMPLIFICATION.,Taq Polymerase,探针退火温度应比引物高510一般情况下探针长度小于30bp5末端不能是G，G可能会淬灭荧光选择GC含量在3080的目标序列设探针，将探针置于G和C含量高的区域引物尽量靠近探针,Probe Design,TaqMan probe：,先合成引物，用SYBR Green I进行筛选，确定引物特性后再合成探针！,优点 特异性好 由引物和探针双重保证。 非特异性双链DNA不会产生荧光信号。 可运行用于多重Real-Time PCR。 不足 需要设计引物和探针 实验成本高。,TaqMan probe：,Real-Time PCR data analysis,绝对定量标准曲线法 预知标准样品的浓度（ng/uL & copy/uL &）. 10梯度稀释标准样品. 未知样品和标准样品同时扩增.,Real-Time PCR data analysis,相对定量,Real-Time PCR data analysis,比较 Ct 法 引入数学公式来计算相对数量 2Ct法 2Ct法 Pfaffl法 结果为相对于校正样本表达水平的比值,Real-Time PCR Theory,样品A,样品B,Efficiency=10(-1/slope) -1100,标准曲线的斜率与PCR反应效率直接相关,Primer and Amplicon Design,引物GC含量在5060引物Tm在5065引物的位置避开目标序列上的二级结构避免G或C重复3次将G或C置于引物末端,引物和扩增子：,6. 避免引物3末端互补7. 避免二级结构8. 在NCBI数据库进行比对,确保特异性9. 产物长度在75200bp之间10. 产物避免二级结构11. 产物避免有多于4个的单个碱基重复,熔解曲线分析,样品温度升高，dsDNA变性释放出SGI，使得体系中 荧光信号减弱。 温度到达产物Tm时，