30国内陆地棉育种

中文摘要棉花是世界重要的经济作物，也是最大的天然纤维作物。随着纺织工业的发展和人民生活水平的不断提高，对棉花的产量提出了更高的要求。本研究以16个亲本构建的综合群体为材料，借助SSR分子标记技术，利用分子标记和纤维品质数据通过方差分析和回归分析两种方法分别进行关联分析，旨在找到与农艺性状有关联的标记。取得的实验结果如下：1主要农艺性状的遗传变异及世代间相关分析表明：衣分的广义遗传力是最高的，达到64.52%，世代间相关系数最大，为0.672，而株行变异系数、遗传变异系数和5%遗传进度较小，均在5%左右；皮棉产量、子棉产量和单株成铃数的株行变异系数、遗传变异系数和5%遗传进度较中等，广义遗传力和世代间相关系数较小。可以看出：衣分受环境影响最小，在世代间的遗传也最稳定，但在群体中的变异程度和选择效果是很差的；皮棉产量、子棉产量和单株成铃数受环境影响较大，在世代间遗传不稳定，但在群体中的变异程度和选择效果较好。2主要农艺性状间的相关分析显示：子棉产量与单株成铃数的表型相关系数和遗传相关系数最大，分别为0.929和0.904，皮棉产量与单株成铃数之间的相关系数次之；子棉产量、皮棉产量与单铃重的相关系数稍小；皮棉产量与衣分有一定的相关关系，子棉产量与衣分之间基本没有关系；衣分、单铃重与单株成铃数之间的相关关系非常弱。可以看出：产量构成因素中，单株成铃数所起的作用最大，单铃重多产量也有很大的影响，衣分对皮棉产量有一定的影响，而对子棉产量基本没有影响，单株成铃数、单铃重和衣分三者之间的相互影响非常小。对比表型相关与遗传相关分析表明：棉花的农艺性状之间的相关受环境影响较大。3分子标记与农艺性状关联分析表明：对衣分正效应最大的标记是BNL1065-B，相对效应为4.043%；对单铃重正效应最大的标记是TMG21-B，相对效应为4.770%；对单株成铃数正效应最大的标记是BNL3261-A，相对效应为9.534%；对子棉产量正效应最大的标记是BNL3261-A，相对效应为11.654%；对皮棉产量正效应最大的标记是BNL3261-A，相对效应为12.382%；有大量效应值为负值的分子标记被检验出来，对于每一个性状，绝对值最大的效应值都是负值。性状在群体中的变异程度越大，t-检验与方差分析两种方法检验结果的一致性越高，在分子标记与表型性状的关联分析中，方差分析优于t-检验。4分子标记间相互作用分析表明：分子标记之间存在着明显的相互作用，相互作用的效果是不确定的，运用双分子标记进行辅助选择，需要先检验所选择的2个标记能否实现预期的效果，比较简单有效的方式是直接按标记的有无分组，比较各组的效应大小，选择最优的组合。5同一标记与不同农艺性状的关联分析表明：20个与多个性状相关联的分子标记，同一标记对于不同性状的效应值的符号都是相同的，这与性状间表形相关系数均为正值的结果相一致；性状间的表形相关关系与性状间在分子水平通过分子标记建立的相互关系具有一致性；3个农艺性状在产量构成中的权重，单株成铃数最大，单铃重和衣分较低；没有任何标记是与衣分、单铃重、单株成铃数等3个产量构成因素同时相关联的，与其中2个性状相关联的标记仅有8个，而效应值为正值的标记仅有4个。关键词：棉花，综合群体，农艺性状，SSR缩略语表简称全称MAS:Marker assistant selectionEDTA:Ethylenediaminetera acetic acidSSR:Simple Sequence RepeatsPCR:Polymerase chain reactionCTAB:Cetyl-Trimethyl-Ammonium BromidePAGE:polyacmide gel electrophoresis1 前言1.1 引言1.1.1 综合群体的概念综合群体是育种家按照一定的育种目标，选用优良的品系，根据一定的遗传交配方案有计划地人工合成的群体。综合群体具有丰富的遗传变异，群体内包含有育种目标所希望的优良基因，综合性状优良，平均数高，是进行遗传改良的理想群体。目前国内外育种学家大都利用这类材料作为遗传改良的基础群体。构建综合群体的理论基础是基因平衡定律，推动群体进化的主要动力是选择和重组（张天真，2003）。1.1.2 QTL的概念表型变异呈连续状态的的性状称为数量性状。对数量性状有较大影响的位点称为数量遗传基因位点（quantitative trait locus ,QTL）（石春海，2007）。QTL是影响数量性状的一个染色体片段，而不是一个单基因位点（杨业华，2000）。利用遗传分离群体中标记与相应性状的数据观察值，建立标记与性状之间的关联关系。若某一标记与性状存在关联，则可以认定该标记附近有1个或几个QTL（杨业华，2006）。利用分子标记和QTL作图技术可以在分子标记连锁图上标出单个QTL的位置，并确定其效应（石春海，2007）。1.2 文献综述1.2.1 国内陆地棉育种概况陆地棉是世界上最主要的栽培棉种，野生和原始类型分布在中美洲、南美洲北部、西印度群岛、美国佛罗里达南端以及太平洋岛屿波利尼西亚。陆地棉可分为7个或8个地理种系，目前世界各棉花栽培区的栽培品种基本都属于阔叶种系。阔叶品系陆地棉来源于靠近墨西哥边境和危地马拉（孙济中，1999），19世纪末引入美国，最初引入美国的材料为数极少，仅2-3个，用这些引入材料经过选择、杂交等育种途径，形成目前广泛栽培的形形色色品种，因此，就其种质来源看陆地棉遗传基础是十分狭窄的（刘后利，2001）。我国是世界主要产棉国之一。中国非棉花源产地，棉花都是由国外引进的。陆地棉引进中国较晚，1865年英国商人最早引进陆地棉，1892年清代湖广总督张之洞从美国引进陆地棉在湖北省种植（孙济中，1999）。直至新中国成立初期，引种仍在棉花品种工作中占重要地位，除50年代至70年代从前苏联引进的108夫、克克1543、司3173等品种在西北内陆棉区种植外，引进品种基本全部来自美国。早在20世纪20年代，中国就开始采用单株选择法选育新品种（孙济中，1999）。新中国成立以来，我国主要棉区进行了7次大的棉花品种更换：第一次是1950-1955年，主要用斯字棉、岱子棉和柯字棉等品种更换中棉和退化陆地棉；第二次是1956-1960年，主要用岱子棉15号更换斯字棉和德字棉等品种；第三次是1964 -1968年，以岱子棉15号为原种进行更新，并推广洞庭1号和光叶岱子棉等；第四次是1974-1979年，主要是推广我国自育品种，如沪棉204、南通5号、徐州142、泗棉1号、江苏棉1号、鄂棉6号、86-1、岱红岱、邢台6871、冀邯3号、中棉所3号、中棉所7号和陕401等；第五次是1980-1984年，主要是推广鲁棉1号、中棉所10号、鄂沙28等（刘后利，2001；何旭平等，2007）；第六次是1986-1994年，主要是以抗病品种替换感病品种，以中等纤维品质品种更换品质较差的品种，推广适于两熟早熟栽培的短季棉品种（孙济中，1999；何旭平等，2007）。90年代，高新技术应用于育种，基础研究得到加强，育种水品不断提高（孙济中，1999）。1995年至今，我国主要棉区又在进行第七次品种更换和更新，其特点是转基因抗虫棉迅速推广，高产品种和杂交种发展快速，体现了现代生物技术在棉花育种中发挥里作用，同时继续推广抗病、品质中上等以及短季棉品种（何旭平等，2007）。我国在陆地棉育种上取得了令人瞩目的成绩，尤其是新中国成立以来，培育出了大量的符合生产需要的新品种，但是我国陆地棉的遗传基础仍然十分狭窄。我国以往培养的棉花品种，无论系统选育或杂交育种，追溯其系谱来源，不外乎由美国引进的岱字棉、斯字棉、德字棉、福字棉、金字棉等品种，而这些棉花品种最早都来自于墨西哥的一个家系12个棉株（潘家驹，1998）。1.2.2 常用遗传标记常用的遗传标记主要分为四类：形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。其中细胞学标记主要包括核型分析中的各种描述染色体特征的标记；生化标记主要包括酶蛋白和同工酶等蛋白质标记（杨业华，2006）。其中用于遗传作图的常用标记有如下几种：形态学表型，用于符合孟德尔遗传的形态学变异的作图，受显性关系复杂性、非等位基因相互作用和环境效应的影响；蛋白多态性，蛋白迁移率在电泳和等电聚焦时的差异，共显性和中等的多态性在数量上有限，很多蛋白的多态性不能通过电泳检验，基因编码的多态性蛋白本身可能不能做图；分子标记，符合孟德尔分离定律，广泛分布、易于检测、高度多态性和共显性，大多数个体是杂合基因型，不相关的个体很少携带相同的等位基因（贺竹梅，2002）。1.2.3 常用分子标记常用的分子标记有以下几种：1）限制性片段长度多态性（RFLP）。1980年Biostein等首次用RFLP作为一种遗传标记。同一物种不同材料的DNA当用同一种限制性酶消化时，由于DNA顺序中出现的碱基置换、插入、缺失、倒位造成片段大小的差异，在电泳谱上片段之间的差异可分辨出来。RFLP是一种孟德尔性状，按孟德尔式遗传；其最突出的特点是重复性好，可靠性高；大多数RFLP的等位基因为共显性，在任何分离群体中能区别所有的基因型；RFLP大多数是由于不编码蛋白质的区域和没有调节功能的区域发生了中性突变，对生物本身通常无害（杨业华，2006；张自立等，2007）。2）随机扩增多态性DNA（RAPD）。RAPD是由Williams和Welsh在1990年分别建立的遗传标记技术。根据PCR技术，由人工随机合成DNA引物，在PCR仪中随机扩增，某一引物在真核基因组中可能有很多结合位点，但是只有在大约2000bp内存在反向平行的与该引物互补的双链DNA分子，才能将合成的新链做为下一次合成的模版，经35-40次循环，即得到大量的DNA扩增片段。RAPD技术简单，标记数目多，无需预先知道基因组DNA的序列，分析所用的DNA样品用量少；但是RAPD扩增结果易受外界因素的影响，重复性差，且大部分为显性标记，不能区分纯合体和杂合体。3）扩增片段长度多态性（AFLP）。AFLP是1993年由荷兰Keygene公司科学家Marc和Pieter创建的分子标记技术。使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板，通过接头序列和PCR引物3端的识别进行选择性扩增，特异性片段经变性、退火和延伸循环36个周期而得到扩增。AFLP具有其它分子标记具有的多态性丰富、不受环境影响、无复等位效应等特点，还具有带纹丰富、用样量少、灵敏度高、快速高效等特殊优点（张自立等，2007）。4）微卫星多态性（SSR）。1989年Litt和Luly发现微卫星序列，同年，Weber和May发现简单重复序列，两者是同一类序列，很适用于遗传作图。1992年Weissenbach等用微卫星多态性标记构建了人遗传连锁图。1993年Wu和Tanksley对此技术进行了改进，用微卫星侧翼序列作引物的一部分，进行PCR扩增微卫星序列。SSR的多态性丰富，简便快捷，带型简单，所需样品量少，结果稳定可靠，重复性好，按孟德尔遗传方式稳定地遗传。由于引物需要带有与SSR侧翼序列互补的碱基，研究者必须知道供试材料基因组中SSR序列。 SSR标记的产生是基于克隆出足够数量的SSR并测序，然后设计合成引物，因此SSR标记的前期投入很大，但一旦被开发出来，应用十分简便（杨业华，2006；张自立等，2007）。5）单链构象多态性（SSCP）。1993年日本学者Takao Sekiya建立了PCR-SSCP技术。CCSP的原理是DNA单链核苷酸的改变会影响它的构象，单链构象的改变会影响它在凝胶中的迁移率，因此能通过电泳区分不同的单链。DNA单链片段如果发生了点突变，则能通过非变性凝胶电泳把突变单链与原有单链分离出来（张自立等，2007）。PCR-SSCP可以检测所有的点突变，是DNA已知突变的检测未知变异分析中十分实用的技术（贺竹梅，2002）。此外，还有单核苷酸多态性（SNP），序列标签标记（STS），表达序列标签（EST）（张自立等，2007），序列特征扩增片段（SCAR），酶切扩增多态性（CAPs）（周仲华等2005）和相关序列扩增多态性（SRAP）（邱文武等，2007），目标区域扩增多态性（TRAP）（苗陪明等，2007）等分子标记。1.2.4 QTL定位方法目前QTLs定位的方法主要包括如下三种方法：1）单一标记定位法。其原理是根据分离群体中标记基因型间的数量性状平均值的差异来分析确定该标记所在区域有无QTL（贺竹梅，2002）。该方法是判断一个标记与控制性状的基因是否连锁，并估计两者的重组率（杨业华，2006）。但该法不能确定某标记究竟与一个还是多个QTL连锁，不能确定QTL的可靠位置以及不能分辨QTL效应和重组等，致使其检测效率不高（贺竹梅，2002；杨业华，2006；石春海，2007）。2）区间作图法。该方法于1989年由E. S. Lander和S. Bostein提出，通过利用相邻的一对遗传标记连锁区间与数量性状观测值之间的相关是否显著（贺竹梅，2002）。该方法是利用染色体上一个QTL两侧的一对标记，建立个体数量性状测量值对双侧标记基因型指示变量的线性回归关系（杨业华，2006）。该方法支持区间推断QTL的可能位置，但由于该方法假定一条染色体上只存在一个效应较大的QTL，而当一条染色体上存在两个或多个效应近似的QTL时，区间作图法难以逐一分辨QTL的效应，致使QTL的定位不准确甚至有误（贺竹梅，2002；杨业华，2006；石春海，2007）。3）复合区间作图法。F. Rodolphe等于1993年提出了一种利用整个基因组上的标记进行全局检测的多标记模型。该方法提高了多个连锁QTL的辨别能力及其相应位置和效应估计的准确性。其遗传基础为当不存在连锁干扰和基因互作时，一个标记基因型值的偏回归系数只受与其相邻区间内的基因的影响，与其他区域内的基因无关，而连锁干扰和基因互作可能存在的对作图产生的影响较小。在此基础上，将多元回归分析引入了区间作图法，即可实现同时利用多个遗传标记的信息对基因组的多个区间进行多个QTLs的同步检验（贺竹梅，2002；杨业华，2006；石春海，2007）。1.2.5 分子标记辅助选择方法分子标记目前在育种的应用主要是分子标记辅助选择。对数量性状而言，目前分子标记辅助选择还主要局限在理论上，理论研究的结果提供了一些数量性状分子标记辅助选择的方法，以下将介绍其中主要的三种方法和传统的选择方法：1）表型值选择：这是传统的育种方法，其理论依据是表型值是基因型值的一个近似值，根据表型值进行选择，但是在基因型值中只有加性效应成分才可以真实地从上代遗传给下代，所以只有对基因型值中加性成分的选择才是有效的。也就是说，表型值与加性效应值的近似程度越高，选择的效率越高。而表型值对加性效应值的近似程度取决于狭义遗传力的大小（郭世华，2006）。2）标记值选择：从理论上来说，如果能够根据个体的加性效应值进行选择，必然能提高选择的效率。而利用完整的分子标记连锁图进行QTL定位，原则上应该能够估计出个体的加性效应值。但是初级定位通常无法检测出全部的QTL并准确估计出它们的效应，因而估计的个体的加性效应值也只是近似的，可能存在较大的误差。要得到个体加性效应值的精确估计值，必须进行QTL的精细定位，这将是一个庞大的系统工程。目前利用分子标记还只能做到近似的依据加性效应值的选择（郭世华，2006）。3）指数选择：标记值和表型值都是加性效应的近似值，两者都含有加性效应的部分信息，若将两者的信息综合起来，作为选择的依据，则可能获得更高的选择效率。1990年Lande，Thompson构建了一个选择指数：I=bzz+bmm其中，I为选择指数，z为表型值，m为标记值，bz和bm为权重系数（bz+bm=1）。1998年Knapp提出了权重系数的算式：bz =(1-p)h2/(1-ph2)bm=(1-h2)/(1-ph2)其中，p为基因频率，h2为狭义遗传力。用选择指数作为选择的依据的选择方法称为指数选择。选择指数也是加性效应值的近似值，其近似程度取决于它的遗传力hI2。hI2=(1-p)h2/(1-ph2)+p(1-h2)/(h2-2ph2+p) （郭世华，2006）4）基因型选择：标记值选择和指数选择所依据的遗传信息都是个体的基因型值，而不是个体的基因型，因此，都是对基因型的间接选择。从这一点上说，这两种选择方法与传统的表型值选择并没有本质区别，并不符合最初提出的标记辅助选择的概念。基因型值是基因型表达的产物，不同的基因型可能产生相同的基因型值。依据基因型值进行选择，会降低选择效率，造成有利等位基因的丢失，所以，更有效的选择方法是直接依据个体的基因型进行选择，就是对每个目标QTL利用其两侧相邻标记或单个紧密连锁的标记进行选择。目前对数量性状进行基因型选择的主要困难在于，对每种性状都只定位了部分效应较大的QTL，而且基本上都是初步定位，定位的精度不够（郭世华，2006）。1.2.6 分子标记在棉花育种中的应用目前，我国在棉花遗传图谱的构建、种质资源的遗传评价与品种的指纹图谱、分子标记辅助选择等方面取得了具有科学意义的研究成果。1996年Ahappley等构建了第一张陆地棉种内棉花的图谱。2000年左开井等构建了我国第一张整合RFLP、RAPD和SSR的陆地棉图谱，共67个标记，9个连锁群。1999年，宋国立等利用RAPD技术对6个澳洲棉种的亲缘关系进行了研究。1997年王心宇等对25个我国主要的短季棉品种做了RAPD多态性分析，结果表明大部分短季棉品种与其系谱吻合。1997年郭旺珍等对我国长江、黄河流域两大棉区的9个主栽品种的RAPD指纹图谱进行了分析，在18个随机引物中有13个可以扩增出多态性DNA片段，其中一个引物可以使每一品种都具有自己的特征谱带。1994年Meredith较早地报到了分子标记与棉花产量与品质性状的关系。1998年Guo等筛选到1个与Rf1有关的RAPD标记，这是RAPD成功用于陆地棉重要经济性状分子标记的首例报道。2001年张天真等利用异常棉基因渐渗而育成的高强纤维种质7235为材料，通过对213对SSR引物筛选，鉴定出与高强纤维QTL连锁的SSR标记3个，这是我国通过分子标记技术首次鉴定出的一个控制高强纤维表现的主效位点（何旭平等，2007）。1.2.7 分子标记辅助选择存在的问题分子标记辅助选择也存在一定的问题。同表型选择相比，标记辅助选择效率对于狭义遗传力低的性状选择的有效性高，具有相对较高的遗传力的性状（h2=0.3-0.5）的标记辅助选择的效率很少超过50%，这取决于被标记所解释的加性方差的比例。基本研究群体具有较高的平均数和较小的遗传变异，而用于理论研究目的合成的群体具有较低的起点，都不适宜与育种工作接轨。环境因素的影响使研究很难重演，同时缺乏十分完善的分析方法和应用软件，构建精确的饱和分子连锁图谱极其困难。此外，还要考虑基因型、细胞质遗传和环境因素等对QTL表达的影响等等（顾万春，2004）。分子标记辅助选择大范围的实际应用还有大量的工作需要完成。1.3 研究的目的和意义随着生物学基础研究的飞速发展，生物技术在棉花遗传育种的理论研究和实践应用中都取得了巨大的成就。棉花育种正在从传统的根据表型值进行间接选择逐步向通过基因进行直接选择转变，分子标记在其中发挥着及其重要的作用。分子标记不仅能够直接应用于育种，其对目标加以较准确的定位和追踪能力也是理论研究和育种实践所需要的，而目前分子标记的发展还不能满足试验工作的需要，其试验群体的构建方式和分析方法都有待改善。目前，分子标记试验构建的群体往往是海陆杂交后代或是含有特殊的亲本材料，所检验出的分子标记无法很好的应用于其它群体，缺少育种价值，而且所构建的群体通常只有两个亲本，绝大多数分析方法也是针对两个亲本构建的群体设计的，这样所得出的结果，即使两个亲本都是普通的陆地棉材料，也很难用于其它群体。例如，选择某一陆地棉材料作为杂交育种中单交的亲本材料之一，希望在系谱法选育中应用分子标记辅助选择，这一过程将至少需要4个陆地棉材料，目标亲本作为公共的亲本材料，与另外3个材料分别杂交，构建3个F2群体，从第一个群体中筛选有价值的分子标记，然后在第二个群体中检验第一个群体中筛选出的分子标记，最后，在第三个群体中应用通过检验的分子标记进行辅助选择。这一方法是建立在在三个群体可以检验出具有相似效应的有价值的分子标记的基础上的，而这一假设并不一定成立。因此，在分子标记应用方向的研究上，需要探索其它建立群体的模式以及与之相适应的分析方法，以图增强分子标记在陆地棉育种中直接应用的可行性。本试验的目的是研究陆地棉综合群体在构建陆地棉分子标记体系中的应用，利用陆地棉综合群体初步定位与陆地棉主要经济性状相关的QTL，通过对与QTL相连锁的分子标记初步分析QTL的效、贡献率以及QTL之间的相互作用，比较单标记法的不同分析方法，为陆地棉经济性状相关QTL的精确定位提供研究基础，为陆地棉分子标记体系的建立提供新的思路。2 材料与方法2.1 供试材料本试验共选用16个亲本材料，构建综合群体，从群体中随机选取部分种子，进行单株试验，根据单株试验的结果，选择部分单株材料，和亲本材料一起进行株行试验。2.1.1 亲本材料试验选用亲本材料详见表1。表1 亲本材料Table1 The parents materials亲本编号Parents No.材料Materials亲本编号Parents No.材料Materials1鄂抗棉9号9澳棉3号2鄂抗棉7号10贝尔斯诺3Jzz-03-1308611Upland4Jzz-03-33721272355Jzz-03-2321513ZA656Acala308014早熟长绒77渝棉1号1510018DH16616HM192.1.2 群体构建方法第一次杂交，以1-8号亲本材料为母本，9-16号亲本材料为父本。父本取等量花粉混合，以混合花粉给母本材料授粉。按母本材料分别收取杂交铃，将其种子依次重新编号为a1-a8号，作为第二次杂交的亲本材料。第二次杂交，将第一次杂交所得的a1-a8号材料的种子各自充分混合后，各取一部分种子，按材料编号种植。将所有材料去雄，每个材料取等量花粉混合，以混合花粉给所有材料授粉。按材料收取杂交铃，将其种子依次编号为b1-b8号，作为第三次杂交实验的亲本材料。第三次杂交，材料种植及杂交授粉方式与第二次杂交相同，所用材料为第二次杂交所得的b1-b8号材料。将杂交铃单独收获，等量混合，构成综合群体。本试验取等量花粉的方法为：每个材料取相同数量的花朵，且尽量取大小相近的花，取其所有花药混合，自然干燥散粉后再将花粉进一步充分混合。2.2 综合群体单株的变异性试验2.2.1 田间试验设计综合群体单株变异性试验的材料为随机选取的综合群体的种子，试验2006年在华中农业大学棉花育种试验田进行。棉花采用营养钵育苗移栽，4月8日播种，4月25日移栽，等行种植，行距0.9m，株距0.35m，密度约为31750株/km2。田间管理与一般大田棉花生产基本相同。2.2.2 试验方法收花从8月14日开始，至9月26日结束，按单株收花，每次记录所收吐絮铃数，并于9月30日调查各单株未收取或未开裂的直径大于2cm的棉铃的数量，计算单株铃数；按单株轧花，室内考种项目有衣分、单铃重。计算实收子棉产量和皮棉产量等。2.3 综合群体后代株行试验2.3.1 实验材料选取176株单株材料和16个亲本材料参加株行试验。2.3.2 田间试验设计株行试验2007年在湖北省汉川市华严农场的农田中进行，种植户黄建国。试验材料为16个亲本和单株试验选取的176个单株材料。试验采用随机区组设计，单行区两次重复，小区长7.0m，宽0.9m，小区面积6.3m2。棉花采用营养钵育苗移栽，4月6日播种，4月26日下午至27日移栽，行距0.9m，株距0.5m，密度约为22200株/km2。田间管理由种植户按照正常棉花生产的管理完成。2.3.3 试验方法9月7日至8日，每个小区收取20朵考种花，未能收足20朵考种花的材料于9月12和9月21日各补收了1次，每个材料共收不超过2次，每次记录所收铃数。小区产量通过田间调查获得，9月10日至12日，按小区调查每株材料的成铃数，包括已收取的棉铃、已成熟的棉铃和未开裂的直径大于2cm的棉铃。将考种花按小区称重、轧花，记录子棉重量和皮棉重量。2.3.4 数据整理根据田间调查结果计算单株成铃数，每个小区去除每株材料成铃数的一大一小两个极端值，以减小环境因素的影响，其余计算其均值作为小区的单株成铃数。根据考种结果计算小区的衣分和单铃重。再根据以上三个参数计算小区的理论子棉产量和皮棉产量。合并两个重复的结果，计算每个材料的农艺性状。去除株数少于10株的小区和所收考种花数少于10朵的小区，共得到数据完整的170个株行和16个亲本材料数据。2.4 分子标记筛选2.4.1 分子标记的筛选 首先进行亲本材料的筛选，并记录具有多态性标记的引物，再用经过筛选具有多态性的引物对综合群体单株材料进行筛选，并逐一记录具有多态性的标记及每个单株材料相应的带型。2.4.2 棉花总DNA提取亲本材料和群体单株材料DNA采用CTAB小量法提取，方法参照Paterson etal.（1993）以及本实验室Lin and He（2003-2006）改良的方法。总DNA的具体提取和纯化方法见附录。2.4.3 SSR分析SSR引物为本实验室合成的引物，PCR扩增体系和扩增程序参照Lin Z. X and He D. H (2006)。PCR体系组成及扩增程序见附录。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物进行分离。电泳所用试剂及操作方法见附录。标记采用“引物名称-字母”表示，字母根据泳带长度从大到小依次排序，泳带无带记为0和有带记为1。2.5 数据处理方法2.5.1 株行试验遗传参数计算方法株行各农艺性状的平均数和标准差直接用Excel中的AVERAGE和STDEV函数计算。株行变异系数的计算公式为：CV=s/100%其中，s为样本标准差，为样本均值（盖钧镒，2000）。广义遗传力、遗传变异系数和遗传进度的计算采用单因素试验设计方差分析法。MSt =2e +r2gMSe =2e2g =( MSt - MSe)/r其中，2g为遗传方差，2e为环境方差，r为重复次数，本试验中r=2。根据以上公式求得遗传方差与环境方差。广义遗传力的计算公式为：H2b=2g /(2g +2e) （马育华，1982；崔秀珍等，2005；崔世友等，2007）遗传变异系数的计算公式为：GCV=2g /（马育华，1982）遗传进度的计算公式为：GS=k(GCV)Hb其中，Hb为广义遗传力的算术平方根，k为选择强度，选择百分数为5时，k=2.06（马育华，1982）。根据株行试验的结果计算以上参数，计算在Excel中完成。2.5.2 世代间相关分析算法世代间相关系数直接用Excel中的CORREL函数计算。根据单株试验和株行试验的结果计算世代间相关系数，计算在Excel中完成。2.5.3 株行试验表型相关分析算法株行试验中不同农艺性状间的表型相关系数即简单相关（潘家驹，1998），用Excel中的CORREL函数计算。根据株行试验的结果计算表型相关系数，计算在Excel中完成。2.5.4 遗传相关分析算法各农艺性状间在不同世代的遗传相关系数采用亲子相关法计算，算法如下：遗传相关系数的计算公式为：rg(xy)=(SPx1y2SPx2y1/SPx1x2SPy1y2)1/2其中，x1、x2分别代表x性状的亲代和子代，y1、y2分别代表y性状的亲代和子代。SPx1y2和SPx2y1有时一正一负，rg(xy)的结果将包含虚数。为了避免这种结果，在SPx1y2和SPx2y1为一正一负时，以上公式可修改为：rg(xy)=(SPx1y2+SPx2y1)/(2(SPx1x2SPy1y2)1/2)而当SPx1y2和SPx2y1均为负值时，表明两个性状成负相关，开平方的结果应取负值（杨业华，2000）。SPXY代表X、Y两个参数的乘积和，其计算方法如下：SPXY=xy-xy/n（盖钧镒，2000）根据单株试验和株行试验的结果计算遗传相关系数，计算在Excel中完成。2.5.5 分子标记与产量性状的关联分析算法进行关联分析的基本统计分析方法有方差分析（Igartua等，1999；李力等，2006）、t-检验（Beer等，1997；苏晓华等，2000）和回归分析（Virk等，1996；Remington等，2001；Kraakman等，2004；Gebhardt等，2004）等。在本研究中选用了方差分析法和t-检验法，具体方法如下：数据分组：根据标记电泳带型的不同将株行材料分为两个组：有标记的组1和无标记的组0。方差分析法：根据表2计算两组数据之间的差异是否达到显著水平（=0.05），对达到显著水平的标记，用组间平方和与总平方和的比值求得这一标记性状产生的变异占总变异的百分率，即标记对该性状变异的贡献率（李力等，2006）。t-检验法：使用Excel中的TTEST函数计算两组数据t-检验的双尾概率值，检验其是否达到显著水平（=0.05）（苏晓华等，2000）。标记的效应：计算两组数据均值，以组1与组0均值的差值表示标记的效应。标记的相对效应：计算标记的效应相对于该性状株行试验的平均数的百分比，以比较各标记的相对效应和不同性状相关联的标记的效应的大小。如与同一形状相关联的标记中属于同一引物的标记有2个且效应为1正1负，计算其绝对值的差值相对于与该性状相关联的标记中效应最大值的绝对值的比例，超过20%则认为2个标记的效应的差异较大，反之则认为效应比较接近。以上计算在Excel中完成。表2 不同标记基因型之间数量性状的单向分组方差分析Table2 One - way analysis of variance of quantitative traits between different marker genotypes变异来源Source自由度DF平方和SS均方MS期望均方EMS基因型之间Between genotypesk-1SStMSt2e+k2g误差Errorni-1SSeMSe2e总变异Totalni-kSST2.5.6 交互作用效应算法交互作用根据讨论的因素数目的不同可以进一步细分，两个因素间的互作称为一级互作，三个因素间的互作称为二级互作，依次类推。本试验计算的是一级互作，算法如下：根据两个标记电泳带型的不同将株行材料分为四个组：组00，按A标记分组属于组0，按B标记分组属于组0；组01，按A标记分组属于组0，按B标记分组属于组1；组10，按A标记分组属于组1，按B标记分组属于组0；组11，按A标记分组属于组1，按B标记分组属于组1。四个组的均值依次用N00、N01、N10、N11表示。均值用EXCEL中的AVERAGE函数计算。交互作用效应的计算公式为：IE=(N11-N10)-(N01-N00)/2=(N11+N00-N10-N01)/2=(-1)(i+j)Nij/2 i,j=0,1（盖钧镒，2000）部分标记组合分组后缺少四个组中的一组或几组，无法按以上公式计算，用“”加以表示。以上计算在Excel中完成。2.5.7 双标记效应算法计算同时具有两个标记的材料的实际效应和理论效应，算法如下：根据两个标记电泳带型的不同将株行材料分为四个组：组00，按A标记分组属于组0，按B标记分组属于组0；组01，按A标记分组属于组0，按B标记分组属于组1；组10，按A标记分组属于组1，按B标记分组属于组0；组11，按A标记分组属于组1，按B标记分组属于组1。实际效应：计算组11和组00的均值，以组11与组01均值的差值表示两个标记所产生的实际效应。理论效应：A标记与B标记效应值之和。相对效应：计算实际效应和理论效应相对于该性状株行试验的平均数的百分比，以比较相对效应与不同性状相关联标记的效应大小。以上计算在Excel中完成。3 结果与分析3.1 主要农艺性状的遗传变异及世代间相关分析3.1.1 综合群体株行世代主要农艺性状的遗传变异综合群体株行世代棉花农艺性状指标主要遗传变异分析结果见表3。平均数、标准差和株行变异系数只能表示群体当代的数量性状特征和变异范围，难以为育种工作提高选择的预见性提供科学依据。表3中的结果显示，衣分的广义遗传力是最高的，达到64.52%，其它性状的广义遗传力较低，在30%。广义遗传力是一个性状的遗传方差在表型方差中的比率，遗传方差包括加性方差、显性方差和互作方差。可以认为广义遗传力研究的是对于一个性状，遗传因素和环境因素的相对重要性。加性方差是育种值的方差。亲代传递给子代的是其基因，而不是基因型，决定子代平均基因型值的是其亲代基因（刘英欣等，1999）。因而，加性方差的稳定性较高，而显性方差和互作方差的变化幅度较大，这导致广义遗传力的变化幅度较大。而在前人的研究中，衣分的广义遗传力变化范围也相当大（0.649-0.913）（李卫华等，2000；刘英欣等，1999）。虽然在不同的研究中，广义遗传力的差异较大，一般情况下，衣分的广义遗传力还是要高于其它性状的（孙济中，1999；刘英欣等，1999；李卫华等，2000；刘芦苇等，2007）。表3中的结果显示，皮棉产量和子棉产量的遗传变异系数较大，分别为14.33%和13.22%，单株成铃数次之，单铃重和衣分的遗传变异系数较小，不足10%。遗传变异系数代表遗传变异度的丰富程度。一个群体的某一性状的遗传变异系数，最大的很大程度上决定了对其进行选择的效果（马育华，1982）。通常，对遗传变异系数较大的性状才进一步计算遗传进度（马育华，1982）。根据马育华（1982）对遗传变异系数的分类标准，即从0-10%、10%-20%、20%-30%分别表示遗传变异系数较小、中等和较大，单株成铃数、子棉产量和皮棉产量的遗传变异系数中等，有较高的遗传潜力，而衣分和单铃重的遗传变异系数较小，遗传潜力较低。表3中的结果显示，皮棉产量和子棉产量的5%遗传进度较大，分别为16.88%和15.02%，单株成铃数次之，单铃重和衣分的5%遗传进度较小，不足10%。遗传进度代表了根据某一性状，从群体中选择最优的一部分（本试验为5%），繁殖到下一代时，该性状的平均表现相对于原群体平均表型的相对变化。遗传进度综合考虑了群体的遗传变异系数和广义遗传力，其中遗传变异系数决定了最大的选择响应，遗传力决定了最大响应可以实现的程度（马育华，1982）。单株成铃数、皮棉产量和子棉产量的遗传进度较大，可以获得较好的选择效果。株行变异系数、遗传变异系数和5%遗传进度，这三个参数都是用于估计群体的变异程度和选择的结果的。对比这三个参数的结果不难发现，虽然这三个参数所表达的意义各不相同，但是，三者之间具有高度的一致性，变异系数与遗传变异系数、5遗传进度之间的相关系数极高，分别为0.9698和0.9684。表3 棉花农艺性状主要遗传变异Table3 The main genetic parameters of economical characters in cotton性状Traits均值Mean标准差Standard deviation株行变异系数（%）Variation coefficient (plots)广义遗传力（%）Broad sense heritability遗传变异系数（%）Genetic variation coefficient5%遗传进度（%）5% genetic advance衣分（%）Lint percentage40.071.604.0064.525.555.87单铃重（g）Single boll weight5.450.407.2924.764.594.71单株成铃数Bolls/plant28.324.5115.9430.5611.1212.67子棉产量（kg/hm2）Seed yield3441649.7118.8830.4513.2215.02皮棉产量（kg/hm2）Lint yield1381275.4419.9532.7114.3316.883.1.2 单株与株行世代主要农艺性状的世代间相关分析单株与株行世代棉花农艺性状指标的世代间相关分析结果见表4。在棉花农艺性状的5个指标中，衣分和单铃重世代间成极显著正相关，其它三个指标世代间相关性没有达到显著水平。衣分的世代间相关系数最大，为0.672，决定系数为0.452。单铃重的世代间相关达到了极显著水平，相关系数为0.257，但是其决定系数仅为0.066，这表明由单株单铃重引起的后代株行单铃重的变异平方和仅占其总变异平方和的6.6%，即单株单铃重与后代株行单铃重之间可用线性关系说明的部分仅占总变异的6.6%（盖钧镒，2000）。表4 棉花农艺性状世代间相关分析Table4 Correlation analysis of economical characters in cotton between generation性状Traits衣分Lint percentage单铃重Single boll weight单株成铃数Bolls/plant子棉产量Seed yield皮棉产量Lint yield相关系数Correlation coefficient0.672*0.257*0.0670.1380.165决定系数Determination coefficients0.4520.0660.0040.0190.027说明：数值旁的*或*表示相关显著（0.05）或相关极显著（0.01）。Note: Asterisk of * or * indicates significant difference at 0.05 or 0.01 level.综合分析表3和表4中的结果，可以看出：衣分受环境影响最小，在世代间的遗传也最稳定，但在群体中的变异程度和选择效果是很差的；皮棉产量、子棉产量和单株成铃数受环境影响较大，在世代间遗传不稳定，但在群体中的变异程度和选择效果较好。3.2 综合群体主要农艺性状间的相关分析3.2.1 主要农艺性状的表型相关分析棉花农艺性状指标表型相关结果见表5。性状间的表型相关：皮棉产量与子棉产量、单株成铃数、单铃重、衣分都成极显著正相关；子棉产量与单株成铃数、单铃重成极显著正相关；单铃重与单株成铃数、衣分成显著正相关；其它指标间相关不显著。子棉产量与单株成铃数的相关系数最大，为0.929，皮棉产量与单株成铃数之间的相关系数次之，为0.902，二者与单铃重的相关系数接近0.6，皮棉产量与衣分之间的相关系数率高于0.3，子棉产量与衣分之间的相关没有达到显著水平。单株成铃数、单铃重与衣分三者之间的相关系数都不足0.3。考察决定系数，产量构成因素中仅单株成铃数与皮棉产量、子棉产量之间的决定系数较大，超过0.8，单铃重与子棉产量、皮棉产量之间的决定系数约为0.34，衣分与皮棉产量之间的决定系数仅为0.11，而单铃重与单株成铃数、衣分之间的决定系数不足0.06。表5 棉花农艺性状之间的表型相关分析Table5 Phenotypic correlation analysis of some traits among the economical characters in cotton 性状Traits衣分Lint percentage单铃重Single boll weight单株成铃数Bolls/plant子棉产量Seed yield皮棉产量Lint yield衣分Lint percentage0.0450.0080.0250.116单铃重Single boll weight0.213*0.0590.3400.348单株成铃数Bolls/plant0.0890.243*0.8630.814子棉产量Seed yield0.1580.583*0.929*0.964皮棉产量Lint yield0.340*0.590*0.902*0.982*说明：上三角为决定系数，下三角为表型相关系数。数值旁的*或*表示相关显著（0.05）或相关极显著（0.01）。Note：The upper triangle is the determination coefficients, the under triangle is the phenotypic correlation coefficients. Asterisk of *or*indicates significant difference at 0.05 or 0.01 level.3.2.2 主要农艺性状的遗传相关分析棉花农艺性状指标遗传相关结果见表6。性状间的遗传相关：棉花的皮棉产量与子棉产量、单株成铃数、单铃重、衣分都成极显著正相关；子棉产量与单株成铃数、单铃重成极显著正相关；单株成铃数与单铃重成极显著正相关，与衣分成显著正相关；其它指标间相关不显著。子棉产量与单株成铃数之间的遗传相关系数最大，为0.904，皮棉产量与单株成铃数之间的相关系数次之，为0.881，二者与单铃重的相关系数在0.7左右，皮棉产量与衣分之间的相关系数率高于0.5，子棉产量与衣分之间的相关没有达到显著水平。单株成铃数、单铃重与衣分三者之间的相关系数都不足0.5。表6 棉花农艺性状之间的遗传相关分析Tab