蛋白与核酸作用检测4-RNA结合蛋白免疫沉淀.docx

编号：3-4主题：RNA结合蛋白免疫沉淀概述：RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等）。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。目的：研究细胞内RNA与蛋白结合情况。步骤： 1. 细胞裂解液获取：A. 单层细胞或者贴壁细胞处理1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次；2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至eppendorf管；3. 1500rpm，4离心5min，弃上清，收集细胞；4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min；5. 每管分装200 l细胞裂解液，贮存于-80；B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解；C. 组织样品处理：1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次；2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数；3. 1500rpm，4离心5min，弃上清，收集细胞；4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min；5. 每管分装200 l细胞裂解液，贮存于-80；2. 磁珠的准备：1. 重悬磁珠；2. 标记实验所需的eppendorf管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照3. 吸取50 l 重悬后的磁珠悬液于每个eppendorf管；4. 每管加入500 l RIP Wash Buffer，涡旋震荡；5.将eppendorf管置于磁力架上，左右转动15使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复1次；6.用100 l的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中；7. 室温孵育30min；8. 将eppendorf管置于磁力架上，弃上清；9. 加入500 l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次；10. 加入500 l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上；3. RNA结合蛋白免疫沉淀：1.准备RIP Immunoprecipitation Buffer；2.将前上步的eppendorf管放磁力架上，去上清，每管加入900 l RIP Immunoprecipitation Buffer；3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4离心10min。吸取100 l上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml；4. 4孵育3h至过夜；5. 短暂离心，将eppendorf管放在磁力架上，弃上清；6. 加入500 l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将eppendorf管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次。4.RNA纯化1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150 l；2.用150 l Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物；3. 55孵育30min；4. 孵育完之后，将eppendorf管置于磁力架上，将上清液吸入一新的eppendorf管中；5. 于每管上清液中加入250 l RIP Wash Buffer；6. 于每管加入400 l苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min；7. 小心的吸取350 l上层水相，吸入另一新的eppendorf管；8. 于每管加入400 l氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min；9. 小心的吸取300 l上层水相，吸入另一新的eppendorf管；10. 每管加入50 l Salt Solution，15 l Salt Solution，5 l Precipitate Enhancer ，850 l 无水乙醇(无RNase)，混合，-80保持1h至过夜；11. 14,000rp