维生素B6测定(精).ppt

维生素B6测定 1 适用范围本标准适用于所添加维生素B6的测定 测定范围为0 08 3 5 g mL 2 原理用水提取 在pH7条件下 用荧光法测定维生素B6 维生素B6测定 3 试剂和溶液3 1pH7缓冲液称取29 3023g磷酸氢二钠 GB1263 和3 8115g柠檬酸 于100mL容量瓶中 用煮沸后冷却的水 溶解并定容至刻度 混匀备用 3 2维生素B6标准贮备溶液称取40mg 中国药典参照标准 维生素B6 或复合维生素 中国药典参照标准 B640mg B1100mg B250mg 精确至0 0001g 于100mL容量瓶中 加水溶解定容至刻度 此液1mL含400 g的维生素B6 3 3维生素B6标准工作溶液吸取 3 2 贮备液1mL于100mL容量瓶中加水稀释至刻度 混匀 此液1mL含4 g的维生素B6 维生素B6测定 4仪器设备4 1荧光分光光度计 4 2分析天平 感量0 0001g 4 3实验室用器皿容量瓶1000mL 100mL 50mL 25mL 刻度移液管10mL 5mL 1mL 维生素B6测定 5 分析步骤5 1试样的选取和制备选取有代表性的试样 粉碎通过0 28mm孔筛 用四分法缩减至100g 密封保存 以防试样维生素B6变化或变质 5 2测定步骤5 2 1维生素B6的提取称取试样0 5 2g 精确至0 0001g 于100mL容量瓶中 加水溶解后 定容至刻度 振荡1 2min 静置待沉清 或离心 400r min 10min 维生素B6测定 5 2 2试样的测定移取试样的上清液1mL 40 gVB6 于25mL容量瓶中 加入 3 1 pH7缓冲液至刻度 混匀 用1cm石英比色杯 置入荧光分光光度计内 于激发波长326nm 发射波长395nm测定其荧光强度 同时做空白试验 维生素B6测定 5 2 3工作曲线的绘制取0 00 0 50 1 00 1 50 2 00 2 50mL维生素B6标准工作液 3 3 分别于25mL容量瓶中 加入pH7缓冲液 3 1 至刻度 混匀 用1cm石英比色杯 置入荧光分光光度计内 于激发波长326nm 发射波长395nm测定其荧光强度 以荧光强度为纵坐标 维生素B6量为横坐标 绘制工作曲线 维生素B6测定 6分析结果计算和表述维生素B6的含量 mg kg 按下式计算 VB6 mg kg M D W 1000 1000 M D W式中 M 工作曲线上查得维生素B6含量 g mL W 试样的质量 g D 试样的总体积 mL 维生素B6测定 7 允许差7 1每个试样称取两份平行测定 取算术平均值为测定结果并保留两位小数 7 2维生素B6含量少于40mg kg以下 平行测定结果相对差值不大于10 维生素B6含量大于40mg kg的平行测定结果相对差值不大于5 维生素B2测定 1 适用范围本标准规定了饲料中维生素B2测定方法 本标准适用于维生素B2的测定 待测液中维生素B2检测浓度为0 05 0 2 g mL 维生素B2测定 2 方法原理维生素B2 即核黄素C17H20N1O6 在440nm紫外光激发下产生绿色荧光 在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比 用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质 由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值 计算样品核黄素的含量 维生素B2测定 3 试剂和溶液3 1盐酸溶液 0 1mol L 将8 5mL盐酸 GB622 用水稀释至1000mL 3 2盐酸溶液 1mol L 3 3氢氧化钠 GB629 溶液 1mol L 3 4冰乙酸 GB676 3 5冰乙酸溶液 0 02mol L 将1 8mL冰乙酸用水稀释至1000mL 3 6高锰酸钾 GB643 溶液 40g L 3 7过氧化氢 HG3 1082 溶液 100mL L 现用现配 维生素B2测定 3 8核酸素标准溶液3 8 1核黄素贮备液 核黄素 中国药典参照标准 于五氧化二磷干燥器中干燥24h 称取0 0500g 溶解于0 02mol L乙酸溶液 4 5 中 在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解 冷却后稀释至500mL 盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖 低温 4 保存 该溶液每毫升含0 1mg核黄素 3 8 2核黄素贮备液 取核黄素贮备液 4 8 1 10mL用0 02mol L乙酸溶液稀释至100mL 盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖 低温 4 保存 该溶液每毫升中含10 g核黄素 3 8 3核黄素标准工作液 取核黄素贮备液 4 8 2 10mL 用水稀释至100mL 现用现配 该溶液每毫升中含1 g核黄素 维生素B2测定 3 9荧光素标准溶液3 9 1荧光素贮备液 称取荧光素 Q HG22 786 0 0500g 用水稀释至1000mL 盛于棕色瓶中 低温 4 保存 该溶液每毫升中含50 g荧光素 3 9 2荧光素标准工作液 取荧光素贮备液 4 9 1 1mL 用水定容至1000mL 盛入棕色瓶中 低温保存 该溶液每毫升中含0 05 g荧光素 3 10溴钾酚绿pH指示剂 取溴钾酚绿 HGB3386 0 1g 加氢氧化钠溶液 0 05mol L 2 8mL使之溶解 再加水稀释至200mL 变色范围ph4 6 5 2 3 11连二亚硫酸钠 Na2S2O4 Q HG2 001 防止吸潮 维生素B2测定 4 仪器 设备4 1荧光分光光度计 4 2分析天平 感量0 0001g 4 3电热恒温水浴 4 4具塞玻璃刻度试管 15mL 5 试样的制备采集具有代表性的样品至少500g 四分法缩减至100g 磨碎 通过0 28mm孔筛 混匀 装入密闭容器中 避光低温保存备用 维生素B2测定 6 分析步骤6 1称样 称取1 2g 精确至0 001g 精确至0 0001g 将试样置于100mL容量瓶中 维生素B2测定 6 2样液的制备 向盛样品的容量瓶中加65mL盐酸溶液 3 1 于沸水浴中加热30min 开始加热5 10min时常摇动容量瓶 以防样品结块 或于121 123 15磅高压釜中加热30min 冷却至室温后 用氢氧化钠溶液 3 3 调节pH至6 0 6 5 然后立即加稀盐酸溶液 3 2 使pH值约为4 5 溴甲酚绿指示剂变为草绿色 用水稀释至刻度 通过中速无灰滤纸过滤 弃去最初5 10mL溶液 收集滤液于100mL锥形瓶中 取整份清液 滴加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成 继续加氢氧化钠溶液 剧烈振摇 使之沉淀完全稀释到测量体积 对高含量样品 取整分的澄清液 用水稀释至一定体积使含核黄素约为0 1 g mL 以下操作避免紫外光照射 维生素B2测定 6 3杂质氧化 于a b c三支15mL刻度试管 4 4 中各吸入样液 6 2 10mL 同时做平行 向试管a b c中各加入1mL蒸馏水 向试管b中加入1mL核黄素工作液 3 8 3 然后各加入冰乙酸 3 4 1mL 旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液 3 6 0 5mL 旋摇混匀 静置2min 再逐个加入过氧化氢溶液 3 7 0 5mL旋摇 使高锰酸钾颜色在10s内消退 加盖摇动 使试管中的气体逸尽 维生素B2测定 6 4测定 用荧光素溶液 3 9 2 调整荧光仪 使其稳定于一定数值 作为仪器工作的固定条件 调整激发波长440nm 发射波长525nm 测定试管a b的荥光强度 样液在仪器中受激发光照射不超过10s 在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠 摇动溶解 并使试管中的气体逸出 迅速测定卒荧光强度作为空白 若溶液出现浑浊 不能读数 维生素B2测定 7 计算方法和公式核黄素 维生素B2 含量以mg kg 或g kg 表示 按下式计算 核黄素 VB2mg kg A C B A M m V V1 R式中 A 试管a 样液加水 的荧光强度 B 试管b 样液加标样 的荧光强度 z 试管c 样液加连二亚硫酸钠 的荧光强度 m 加入核黄素标样的量 g V 样液的初始体积 mL V1 测定时分取样液的体积 mL m 试样质量 g R 稀释倍数 A C B A值应在0 6