布氏杆菌病的检测.doc

牛布氏杆菌病的检测1 传统的检测方法1.1 细菌学检测布氏杆菌需在实验室里进行。初步分离时, 须在5%10%二氧化碳环境中方能生长, 而且标本中必须存在大量活菌才能分离到该菌, 培养细菌的周期长,需要花费大量的时间才能得出结果。因此在布病的检测中已经逐渐被淘汰。1.2 血清学检测该法同样要在实验室才能操作, 虽然凝集试验(agglutination test)操作简便, 且所需时间短, 但由于IgM 在pH 为中性或弱酸性时凝集最活跃, 所以凝集试验会因为抗体交叉反应而易出现假阳性反应。判断结果有很大的误差, 在2000 年被OIE 取消了其作为布氏杆菌病的检测方法2。沉淀试验(Precipitationtests)是可溶性抗原与相应抗体结合, 在适量电解质存在下, 形成肉眼可见的白色沉淀, 由于是人为的观察结果, 因此存在很大的主观性, 有时会因出现交叉反应而误判结果, 且有很大的局限性, 不是一种理想的检测布病的方法。补体结合试验( complement fixation test,CFT) 主要用于检测牛、绵羊、山羊和猪的布氏杆菌病,在操作过程中对温度和滴加试剂的量有很高的要求,需要很多控制条件, 结果也无法避免假阳性的影响。放射免疫试验是1977 年Parratt3建立起来的, 由于在该实验中要用大量的放射性元素会对人体和环境造成很大的威胁, 因此该法一直没有得到广泛运用。1.3 变态反应检测临床上可用布氏杆菌水解素0.2ml 注射于动物根皱褶处, 24h 及48h 各观察一次, 若注射部位发红肿胀即判为阳性反应。此法对慢性病例检出率较高, 并且注射水解素后无抗体产生, 不妨碍以后的血清学检查。此法主要用于山羊和绵羊检疫, 但山羊的变态反应试验不如绵羊变态反应试验那样易读取结果, 对中、后期病山羊的诊断意义较大, 适用于山羊布氏杆菌病的筛检, 不作个体山羊的诊断依据。2 酶联免疫吸附试验ELISA 是免疫技术中应用最广的一种, 在适合的载体上, 酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原- 抗体免疫复合物, 在一定的底物参与下, 复合物上的酶催化底物, 使其水解、氧化或还原成另外一种带色物质。由于在一定条件下, 酶的降解底物和呈现色泽是成正比的, 因此, 可以应用酶测定仪进行测定, 从而计算出参与反应的抗原和抗体的种类和含量。自从1971 年Engvall 等和Van Weemen 等分别报道酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunoassayassay, ELISA) 以来, ELISA 得到了很大的发展, 到目前其类型也很多, 在此对常用的两种介绍如下。2.1 间接酶联免疫吸附试验_1976 年Carlsson 第一次建立间接ELISA( indirectenzyme linked immunoassay assay, IELISA) 法检测人布氏杆菌病, 之后在多种动物上用该法检测布氏杆菌病。1995 年F.Bianciflori 等用间接ELISA 从羊奶中检测布氏杆菌病, 其特异性和敏感性都特别高; 1996 年F.A.Uza 等人用抗IgG1 的单克隆酶轭合物间接ELISA诊断牛布氏杆菌病, 检测了三组血清, 第一组是没有注射疫苗的阴性血清, 第二组是注射了疫苗的阴性血清,第三组是来自阳性牛的血清。间接ELISA 检测的特异性前两组分别是99.2%和99.6%, 间接ELISA 检测阳性血清的敏感性是99.5%; 得出IELISA 的敏感性和特异性都很高; 1998 年V.R. Vanzini 等评价了间接ELISA 在阿根廷奶牛中用奶和血清检测诊断布氏杆菌病的效果, 在来自相同奶牛的奶和血清中间接ELISA 检测的特异性和敏感性分别为: 奶样敏感性为99.6%特异性为99.1%; 血清的敏感性为99.6%特异性98.6%。奶和血清的敏感性相同而奶的特异性比血清的高3。说明可以在检测奶牛布氏杆菌病的时候可以用奶代替血样, 排除了采血带来的麻烦, 大大地提高了检测效率。2004 赵云玲等人分别通过琥红凝集试验( RBPT) 、试管凝集试验( SAT) 、和酶联吸附( ELISA)试验检测某牛厂送检202 份血清和129 份乳清, 所得的实验结果说明乳清完全可以代替血清用于牛布氏杆菌病的血清学检测; 2001 年V.R. Vanzini4等人比较了在大量奶样中用间接ELISA 和用乳汁环状试验检测流产性布氏杆菌抗体的差异, 最后得出间接ELISA的敏感性( 98.1%) 高于乳汁环状试验( 72.2%) , 而间接ELISA 的特异性( 88.1%) 低于乳汁环状试验( 90.5%) ,间接ELISA 的敏感性比乳汁环状试验的高出很多, 特异性和乳汁环状试验的差不多。2004 年C.Saegerman5等人评价了用单克隆抗体和蛋白G 作为过氧化轭合物的三种血清间接ELISA 诊断牛布氏杆菌病的效果,得出间接ELISA 的敏感性和特异性都非常的高。2004年刘耀兴等人对牛布氏杆菌病间接ELISA 与血清试管凝集试验( SAT) 、琥红平板凝集试验( RBPT) 、缓冲平板凝集试验( BPAT) 进行了临床运用比较。结果表明间接ELISA 和其他三种检测方法阳性和阴性符合率为100%, 但间接ELISA 法较SAT、RBPT、BPAT 方法先进、快速、结果客观可靠。根据使用的不同抗原、抗球蛋白酶结合物和底物或色原体产生了多种间接ELISA。有几种商用间接ELISA 在广泛的田间试验中得到验证并推广使用。虽然间接ELISA 是高度敏感的方法, 但是它不能把S19 疫苗免疫产生的抗体与致病株感染引起的抗体区别开来。因此, 更多地把间接ELISA 作为普查检测方法而不是作为免疫家畜的检测方法。2.2 竞争酶联免疫吸附试验传统的血清学检测方法和间接ELISA 方法无法鉴别疫苗免疫产生的抗体和致病株感染引起的抗体。为了把这两种抗体鉴别开来出现了竞争酶联免疫吸附试验( competitive enzyme linked immunoassay assay,CELISA) 。1995 年K.H.Nielsen 等3用脂多糖作为抗原固定在聚苯乙烯基质上和O- 型多糖( OPS) 表位特异性单克隆抗体( M84) 作为抗体, 羊抗鼠IgG 抗体酶轭合物作为检测抗体, 用这种调整的CELISA 检测注射S19 疫苗牛的抗体和感染牛布氏杆菌牛的抗体。检测了1446 个来自未感染布氏杆菌群的血清, 其特异性为99.7%; 检测了636 份来自感染布氏杆菌群的血清, 其敏感性为100%。这种方法的主要原理是疫苗免疫引起的低亲合力的抗体是由于免疫消除引起的短暂暴露抗原所引起的, 而持续抗原田间感染中, 抗体的亲合力是不断升高的。这样竞争性抗体就能有选择地抑制结合疫苗所产生的抗体而不是野毒株所产生的抗体。因为CELISA 可以消除因接种疫苗而产生的残余抗体所引起的大部分反应, CELISA 对牛布氏杆菌OPS 表位特异性单克隆抗体有很高的特异性, 所以单克隆抗体的选择及其独有的特异性和亲和力对CELISA 法的诊断有明显的影响。酶联免疫吸附试验( ELISA) 具有很强的敏感性和特异性, 它既可检测IgG 和IgM, 又可检测IgA 类抗体。CELISA 法还适用于鉴别自然感染与人工免疫病例。但目前尚无公认的诊断标准。它和平板反应法相比, 二者的特异性都很高, 识别阳性和阴性血清能力几乎为100%, 但ELISA 法的敏感性远远高出平板反应法, 研究证明一般高出34 倍。3 分子生物学检测方法3.1 PCR 法自从1978 年以来许多检测布氏杆菌的基础PCR得到了发展, 最早检测布氏杆菌的基础PCR 是针对布氏杆菌上高度保守的单个基因( 如BCSP31 和16SrRNA 基因) 而设计的。主要是用于鉴定布氏杆菌种的类型, 1990 年Fekete 第一次报道了PCR 基础诊断方法, 这种方法扩增了635bp 的编码43-KDS19 牛布氏杆菌外膜蛋白序列, 他们都能够证明这种方法对布氏杆菌的特异性, 也可以应用于所有的物种和亚种, 其敏感性特别好( 不少于100 种细菌) 。然而, 由于所有权的原因引物和靶序列没有发表, 但他们的成功很大程度上鼓舞了人们进一步用PCR 对布氏杆菌病的检测。接着被探索的基因靶子是16SSrRNA, 1992年Herman and De Ridde 根据流产性布氏杆菌16S 系列设计一对引物, 成功地扩增了从牛布氏杆菌和其他布氏杆菌种中预计的800bp 的序列, 证明了这些序列具有高度的保守性, 并且这种检测可以延伸到全基因。1992 年Baily 根据编码BCSP31 的基因建立了一种新的PCR, 这种PCR 分析法设计了专一的一对低聚核甙酸引物, 扩增了223bp 的产物。并且证明了对于牛布氏杆菌和羊布氏杆菌的敏感性和特异性都非常的高6。2002 年E.Navarro 等7用PCR 扩增了人布氏杆菌的三个不同的基因, 这三个基因分别是编码牛布氏杆菌抗原31kDa 的基因、牛布氏杆菌16SrRNA序列和编码外膜蛋白的基因。它们对检测提纯的布氏杆菌DNA 显示出不同的敏感性( 8fg20pg) 。在中国也有学者对布氏杆菌的PCR 检测方法有所研究, 1999年金红等8建立了IS6501 锚定PCR 法, 这种方法可用于鉴定布氏杆菌并区分不同毒株和生物型, 最具有意义的是可鉴别野毒株与疫苗株; 2003 年王胜昌9等根据编码31kDa 布氏杆菌蛋白的基因(BSCP31), 设计两对引物。对布氏杆菌R 型(粗糙型)抗原及S 型(光滑型)抗原、大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌分别采用两种提取、纯化DNA 的方法, 并以纯化的各细菌DNA 为摸板, 分别进行内、外引物PCR 反应及套式PCR 反应,反应时以灭菌超纯水作为空白对照。结果显示: 进行内、外引物PCR 反应和套式PCR 反应时, 布氏杆菌R型及S 型均出现预期的扩增带594bp、460bp 及460bp, 且套式扩增后条带亮度明显增强, 而作为验征PCR 特异性或对照的大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿腺杆菌、灭菌超纯水均无扩增带。验证敏感性时用外引物对布氏杆菌R 型、S 型DNA 进行扩增后, 最低可检测到1pg的布氏杆菌DNA。_4 展望布氏杆菌病是一种人畜共患疾病, 在全世界许多国家都有分布, 不论它在哪个国家暴发都会给该国带来巨大的经济损失, 甚至造成人员的死亡, 因此它在公共卫生上有很重要的意义。目前对该病的治疗没有特效药,