SSR实验操作流程.doc

SSR实验操作流程比较功能基因组学实验室一、试剂配制0.2%亲水binding silence（现配现用）1500L95%乙醇，7L冰醋酸，再加入3L binding silence，混匀后使用。注：硅烷可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。特别易燃，要远离热、火花和明火。其挥发的气雾对粘膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有刺激作用。戴合适的手套和安全眼镜、始终在化学通风橱里使用。0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）TBE母液（5TBE）Tris Base 54g硼酸 27.5gEDTA(0.5M pH8.0) 20ml搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。注：如果用得比较多，可以配成10倍或者20倍的备用。UreaTBE(一块胶板用量)： 5TBE 12ml尿素 27g加双蒸水溶解后定容至51ml，使用滤纸过滤。注：冬天配制时可以用微波炉加热使之迅速溶解，最好立即趁热过滤，使用时间不宜过长，尽量在3周内用完。尿素可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康，戴合适的手套和安全眼镜。40丙稀酰胺丙稀酰胺 380g甲叉双丙稀酰胺 20g加热至37使之溶解，加水定容至1000ml，用滤纸过滤，棕色瓶避光保存于室温。注：丙烯酰胺（未聚合的）是一种强的神经毒素并可通过皮肤吸收（其效应是累加的）。当称量粉末状丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺时，要佩戴合适的手套和防护面具，在通风橱内操作。人们多数认为多聚丙烯酰胺是无毒的，但亦应小心操作，因为可能含有少量未聚合的丙烯酰胺。10APS（过硫酸铵）超纯过硫酸铵 2g超纯水 18ml溶解后，4保存，一个月之内用可以不放4保存。注：过硫酸铵对粘膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大的危害性。操作时戴合适的手套、安全眼镜和防护服。始终在通风橱内操作，操作完后彻底洗手。TEMED（购买后可直接使用）电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。注：TEMED对粘膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大的危害性，吸入和致命。长时间接触可引起严重的刺激或灼伤，操作时戴合适的手套、安全眼镜和防护服。始终在通风橱内操作，操作完成后彻底洗手。TEMED挥发的气体能传到相当远的火源并引起花光四闪。切勿靠近热、火花和明火。Loading buffer：去离子甲酰胺 100ml0.5M EDTA(pH8.0) 2ml二甲苯腈蓝cyanol 0.05g溴酚蓝 0.05g混匀后置于4保存。注：购买蒸馏的去离子化甲酰胺，分装成小份充氮贮存于-20，或购买去离子化试剂级的甲酰胺。许多批号的试剂级甲酰胺已足够的纯，无须进一步处理即可使用。但是，如果呈现黄色，则必须进行去离子化处理。处理方法见分子克隆实验指南。甲酰胺是一种致畸剂，其挥发的气雾对粘膜、上呼吸道组织、眼睛和皮肤有刺激作用。可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。戴合适的手套和安全眼镜。当用浓的甲酰胺工作时，要始终在化学通风橱内进行，工作液尽可能的遮盖。固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。注：染色液配置用双蒸水。AgNO3是一种很强的氧化剂，要谨慎操作。它可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康，避免接触皮肤、戴合适的手套和安全眼镜。与其他物质接触可引起爆炸。显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3NaOH，0.1%甲醛。注：显影液可以用自来水配置，每次用时重新加甲醛，甲醛有很大的毒性并挥发，也是一种致癌剂。很容易通过皮肤吸收，对粘膜和上呼吸道组织、眼镜和皮肤有刺激损伤作用。避免吸入其挥发的气雾。戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱内使用，远离热、火花和明火。二：实验步骤1、玻璃板清洗准备：1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，沥干备用。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500L的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放过夜。2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，可以用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板置于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。以上是进口一起的操作，国产六一操作差不多，在玻璃板组装上熟练了可以不用封透明胶条，夹紧两边并边控制平衡边灌胶，最后迅速插上平衡胶面的梳子，自己摸索注意事项：1） 用洗涤剂及无水乙醇清洗玻璃板后要保证玻璃板上无油渍，以避免凝胶中产生气泡。2） 涂布疏水剂时最好在上一次电泳完成后进行，因为这时候疏水板还是热的，尤其是在冬天，疏水剂特别容易凝固。若疏水剂已凝固，可用电吹风边吹边抹。3） 涂布亲水剂时要保证玻璃板的每个部位都涂上，并且要等其晾干，晾干时间至少为3-5min，这样能保证玻璃板与凝胶充分粘连。4） 操作过程中，要防止亲水玻璃和疏水玻璃板的相互污染。5） 带有胶的亲水板提前泡好，加上一定量的NaOH，浓度不定，多加水，泡的时间越长越容易洗。2、聚丙烯酰胺凝胶的制备1）每一块胶的用量配制如下：（大胶）UreaTBE 51ml40%丙稀酰胺 9ml10%APS 200lTEMED 30l共计 约60ml2）加完APS轻轻摇匀，然后再加TEMED，再摇匀，这样在夏天可以有效防止由于局部地方APS过高在未灌胶之前就凝固了。注意不要用力搅拌，会使胶里产生气泡，混匀后立即灌胶。3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。4）灌胶完成后，聚合时间约1小时。注意事项：1） 由于丙烯酰胺有毒性，配置时应戴手套。2） 灌制凝胶前大注射器的导管中挤出气泡，以防止气泡产生。3） 凝胶中丙烯酰胺的浓度根据所要分离的DNA片段大小来确定，具体见分子克隆实验指南，其中，含5%丙烯酰胺的凝胶的分离范围为80-500bp。4） 若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头铺上湿报纸或湿抹布以防止凝胶变干。如果时间很紧可以通过多加APS或者TEMED加速凝固，但是两者最好不要同时多加，尤其是夏天，凝固速度会特别快。3、凝胶电泳1）将凝固的板子梳子拔掉并彻底清洗上面多余的凝胶，组装到电泳仪上，正极槽（底下）中加入600ml的1TBE缓冲液，负极槽上加入800ml的0.5TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。3）预电泳10-20min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。5）加入3l已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至第一条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5TBE缓冲液，剩余的0.5TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。注意事项：1） 插入梳子时可根据实验需求调整柱子的插入深度，一般只需要插入1-2mm即可（太深条带会很弯，太浅点样时会往旁边渗），满足点样量为3l的需求。2） 预电泳的作用包括：使气泡升至凝胶上方，使电泳系统预热，因而预电泳很重要。3） 样品DNA上样前加入等体积的Loading buffer，95变性3-5min。4） 在6-8%的变性聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝迁移速率约与125bp的单链DNA相同（自己可以试验，根据预计的片段大小选择合适的电泳时间，一般使目标条带跑到板子的上1/3处条带比较好读，但是如果条带分子量特别大，跑到1/2处），在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与长300bp的线状双链DNA相同，而二甲苯青FF约与长4000bp的DNA相同。在含5.0%丙烯酰胺的凝胶的有效分离范围为80-500bp，溴酚蓝迁移速率约与65bp的双链DNA相同，而二甲苯青FF约与长260bp的双链DNA相同。5） 根据需要点marker，一般多态性较高就多点几个marker，而且最好不要点到最边上的两个孔。6） 电泳时产热过多可导致DNA条带的“微笑”现象和其他问题的出现。7） 有时凝胶会吸附在硅化的玻璃板上，这时，将玻璃板翻转，从上取下未硅化的玻璃板。4、银染1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方，如果能够立即读取数据或者拍照可以不用固定这一步。2）将玻璃板取出，染色液中染色8-15min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方，并用硬条垫着使胶充分接触染色液。3）用自来水短时间快速冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，冲洗干净，否则凝胶容易变黑。4）将凝胶浸在显影液（3NaOH，0.1%甲醛）中，直至带纹出现，一般15-30分钟，凝胶朝上放置。5）用自来水冲洗干净。6）室温下自然干燥，干燥后的胶板覆