基因工程工具酶和载体.doc

第一章 基因工程工具酶和载体课程基因工程原理与技术班级生物科学05生物技术05教师詹亚光范桂枝学期第二学期课时4学时上课日期课的类型理论授课章节第二章 基因工程工具酶第一节 常用工具酶1. 限制性内切酶2. 连接酶3. DNA聚合酶4. 基因工程中所用的其他酶类第二节 基因工程的载体1. 载体的基本条件2. 质粒载体3. 噬菌体载体4. 植物基因工程载体教学目的和要求掌握基因工程常用工具酶的种类、特性和用途；基因载体的条件、类型、特点和用途教材分析重点工具酶的功能和反应条件、载体的功能难点工具酶和载体的用途关键点限制性内切酶和质粒载体的功能主要教具和设备材料投影仪、电脑、常规教学设备 教法板书与多媒体授课相结合思考题1. 为什么大数内切酶被称为“限制”酶？2. 何为限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？3. 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？4. 如何利用T4DNA聚合酶制备3隐含末端或双链平末端？5. 按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶？心得第一节 基因工程工具酶的概念基因工程的工具酶（instrumemtal enzyme of gene engineering）是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取、重组体DNA制备等程序中所需的酶类。基因工程常用的工具酶，主要是限制性核酸内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶等（表1）。表1 基因工程常用的工具酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，DNA聚合酶I或其大片段（1）缺口平移制作标记DNA探针（2）合成cDNA第二链（3）填补双链DNA3凹端（4）DNA序列分析耐热DNA聚合酶聚合酶链反应DNA连接酶连接两个DNA分子或片段多核苷酸激酶催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶在3末端加入同质多聚物尾SI核酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端DNA端酶I降解DNA，在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解去除RNA磷酸酶切除核酸末端一、 限制性内切核酸酶（一）限制性内切酶（Endonucleosase）的发现与分类限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。1） 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： hsd R-限制性内切酶 hsd M-限制性甲基化酶 hsd S-控制两个系统的表达1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有一百种，而实验室常用的有二十种。2）限制性核酸内切酶可分为三大类： I类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。II类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断 III类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。（二）限制性核酸内切酶的命名由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统一的命名体系。Smith和Nathans(1973)提出了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。其主要特征是：1. 宿主生物的种名由其属名的首字母和其种加词的头两个字母形成的三字母缩写来注明。该缩写向来用斜体。2. 如果来自于某个特定的菌株，则需注明。3. 当某个特定的宿主菌株具有几个不同的RM系统时，它们要用罗马数字注明。在表32中列举一些例子。表2 限制性内切酶命名法举例酶酶来源识别序列Sma IHae Hind Hind BamH I黏质沙雷氏菌，第一个酶流感嗜血菌埃及生物群，第三个酶流感嗜血菌菌株d，第二个酶流感嗜血菌菌株d，第三个酶 解淀粉芽孢杆菌，菌株H，第一个酶CCCGGGGGCC GTPyPuACAAGCTT CCATCC 自引导的内切酶的命名法与此类似，但是内含子编码的内切酶要加上前缀“I”(例如I(I)，而内含肽内切酶要加上PI-”的前缀(例如PI-Psp I)。当需要区分限制和修饰活性时，分别在它们前面加上“R”和“M”的前缀，如RSma工和MSma l 。（三） II型限制性核酸内切酶的基本特性1、限制酶识别序列的长度限制酶识别序列的长度一般为48个碱基，最常见的为6个碱基。当识别序列为4个和6个碱基时，它们识别的序列在完全随机的情况下，平均每256和4 096个碱基中会出现一个识别位点（44=156，46=4 096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置：4个碱基识别位点：Sau3A I GATC5个碱基识别位点：Eco R II CCWGG (W=A或T)6个碱基识别位点：Eco R I G AATTC7个碱基识别位点：BbvC I CC TCAGC8个碱基识别位点：Not I GC GGCCGC2、识别序列的结构 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构（如Eco R I）。但是有一些酶的识别序列是不对称的，如AccBS I CCGCTC（-3/-3）和BssS I CTCGTG（-5/-1）。识别序列后面的数字表示在两条链上的切割位置。3、切割的位置 限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也有外部的（如Sau3A）。与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来（如Eco R I）。平末端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构，如Eco R V（GAT ATC）。产生的末端的DNA可任意连接，但连接较粘性末端低。 同裂酶：isoschizomers 是来源于不同物种的识别序列和切割为位点均相同的酶。如Hpa II与 Msp I 5- C CGG-3。同尾酶：isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。同位酶：具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶。如Sma I 5- C CCGGG-3, Xma I 5- CCC GGG-3。注意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。（四）限制性核酸内切酶的消化反应一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的纯度 DNA的甲基化程度酶切反应的温度（通常为37 ）DNA的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液 在“非最适的”反应条件下，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性（Star 活性）。用*表示。Star 活性出现的频率因采用的限制性内切酶、底物DNA和反应条件的不同而不同，几乎所有的限制酶都会出现Star 活性。因此，为了避免产生Star 活性，即使降低酶的切割效率，也要尽可能排除产生Star 活性的条件。如降低反应系统中甘油含量，控制在pH中性和高盐浓度下进行反应。（五）限制性核酸内切酶的应用1、在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶片段2、建立DNA分子的限制酶图谱3、构建基因文库4、用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。几种最常用的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点BamH Cla EooR Hind HindKpnNot Pst Sal Sau3A Sfi Sma DXba Xho GGATCC ATCGATGAATTCAAGCTTGTPyPuACGGTACCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACGATCGGCCNNNNNGGCCCCCGGGTCTAGACTCGAG 二、DNA连接酶（一）DNA连接酶的发现环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。首个DNA连接酶(ligase)大肠杆菌NA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因组中lig基因编码的。1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。（二） DNA连接酶作用特点1. 连接的两条链必须分别具有自由3OH和5P，而且这两个基团彼此相邻；2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coli DNA连接酶 连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。（三） DNA连接酶的反应条件影响连接效率的因素有：1. 温度（通常在4-15 ）2. ATP的浓度(10ML - 1mML )3. 连接酶浓度（一般平末端大约需12U，黏性末端仅需0.1U）4. 反应时间（通常连接过夜）5. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1151） （四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。210l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1151），补足ddH2O 至8l。3轻轻混匀，稍加离心，56水浴5min后，迅速转入冰浴。4加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10l，稍加离心，在适当温度（一般14-16）连接8-14hr。三、DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerase）最早在大肠杆菌中发现，以后在其他原核生物及微生物中陆续发现。DNA聚合酶作用的条件和共同性质是：（1）要有底物4种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA，产物的性质与模版编码相同；（2）必须有模版；（3）需有引物（3羟基）指示合成起点，不能自行其起始合成新的DNA链；（4）催化dNTP加到生长中的DNA链的3OH末端，DNA的合成方向是5 3。常用的DNA聚合酶及特性：聚合酶名称来源3 5外切活性5 3外切活性聚合反应速率持续合成能力E.Coli DNA聚合酶大肠杆菌低有中低Klenow大片段酶大肠杆菌低无中低T4 DNA聚合酶T4噬菌体高无中低T7 DNA聚合酶T7噬菌体高无快高反转录酶肿瘤病毒无无低中Tag DNA聚合酶栖热水生菌无有快高 （一）大肠杆菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E.Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：A. 5 3聚合酶活性（模板， 带3OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。B. 双链特异性的53核酸外切酶活性。C. 35核酸外切酶活性。从游离的双链或单链DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。主要是校正作用。大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针 利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。2.用于DNA连接前的大缺口填充 利用5-3的聚合酶活性。3.用于DNA的序列分析 利用5-3的聚合酶活性。（二）Klenow片段酶Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。酶催活性：5 3 的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途（利用5 3 的聚合酶活性）：修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端标记DNA片段的末端 底物用32PdNTPs cDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定（三）T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，1.酶催活性：53的聚合酶活性3 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强1001,000倍。 因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 5 外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。2.T4DNA聚合酶的用途(1)利用取代合成反应制备探针(2)标记具有平末端的或具有3隐蔽末端的DNA片段利用较强的3 5 外切酶活性和 53聚合活性(3)用于DNA序列分析（四）T7 DNA聚合酶T7噬菌体感染大肠杆菌诱生的DNA聚合酶，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基：有53聚合酶和35外切酶活性； 大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。1. T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强 35外切酶活性高 单链和双链都能降解。 不受DNA二级结构的影响 其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍2. T7 DNA聚合酶的用途 以大分子量DNA为模板的合成 进行末端标记 补平隐蔽末端（五）逆转录酶（反转录酶）逆转录酶 是一种依赖RNA的DNA聚合酶。此酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的Nature杂志上。最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）分离出来的。活性：一种可以有效地将mRNA反转录成DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。四、修饰性工具酶（一）末端转移酶（terminal transferase）l 末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。l 特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。l 最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。（二） SI核酸酶（SI nuclease）这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离的高度单链特异的外切酶。活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。其主要用途有：在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端；载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴， 形成平末端结构。（三）碱性磷酸酶从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphatase）简称BAP。 从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（ Calf Intestinal Alkaline Phosphatase） ，简称CIP，用的广泛。酶催功能： 脱磷酸作用，将单链或双链DNA或RNA5P转化成5OH。其主要用途有：在用32P标记DNA 5端之前，去除5端的磷；在DNA重组技术中，去除DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。第二节 基因工程的载体载体的概念：通过不同的途径将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因克隆载体。 克隆载体应具备的条件：（1） 在宿主细胞内能独立复制。（2） 有选择克隆子的标记基因。（3） 有一段多克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体。（4） 分子量小，拷贝数多。（5） 容易从宿主细胞中分离纯化。（6） 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除 受体细胞以外的其它生物的细胞，尤其是人的细胞。载体的功能(1) 运送外源基因高效转入受体细胞(2) 为外源基因提供复制能力或整合能力(3) 为外源基因的扩增或表达提供条件 载体的分类：根据其特征：（1） 质粒（plasmid） （2） 单链DNA噬菌体M13 （3） l噬菌体的衍生物 （4） 柯斯质粒（cosmid） （5） 动物病毒（virus） 根据其工程：克隆载体、表达载体和穿梭载体质粒载体一、质粒载体（一）质粒的性质1、质粒的组成与构型质粒的概念：一种寓于宿主细胞染色体裸露的双链DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。质粒的一般生物学特性：（1） 分子量：1200kb,，多数为10 kb左右。即使是最大的质粒也比最小的大肠杆菌（4700 kb）小得多。（2） 编码的基因少：23蛋白质，如抗菌素和一些代谢物。（3） 形状：环状DNA（4） 质粒的空间结构： a: 超螺旋共价闭环DNA分子（Covalent close circular DNA）呈超螺旋（SC） b: 开环DNA（ open circular， ocDNA）：c: 线形DNA （ linear ，lDNA）(5) 质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同2、质粒的类型可分为接合型和非接合型两类。接合型质粒：部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞移到另一细胞。含有tra基因的质粒称为接合质粒。这类质粒分子量大，拷贝数少，宿主广，比较不安全。质粒F、TI、ColV2.非接合型质粒：不含有tra基因的质粒。分子量小，拷贝数多，不会自行接合比较安全。 如：ColE1 和 pPbS3、质粒的复制类型a: 严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少，只有13份拷贝。b: 松弛型质粒（relaxed plasmid） 拷贝数多，有1060份拷贝。（二）质粒载体的构建1、天然载体的局限性：分子量大，拷贝数低；筛选标志不理想2、质粒载体必备条件：（1） 必须含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori)，最好是松弛性的。（2） 含有允许外源DNA片段克隆的位点，位点应尽可能的多。为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，在质粒克隆载体上组装一个含有多种限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点（MCS）连杆。（3） 含有供选择克隆子的标记基因。最好有两种标记基因，并且在选择标记基因区内含有合适的克隆位点，当外源DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。标记基因有：Ampr Cmp r Kan r（4） 质粒克隆载体的DNA分子应尽可能的小。由于质粒转化受体细菌的效率同质粒DNA分子的大小相关，大于15 kb的转化效率明显降低。3、质粒载体选择标记的工作原理二、标记基因（一） 选择标记抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。1氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 -内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。2四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。（二）筛选标记筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。1-互补（-complementation）-互补是基于在两个不同的缺陷 -半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 （称为 lacZ） ，其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 -半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。在 lacZ 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，lacZM15 放在 F 质粒上, 随宿主传代； lacZ 放在载体上, 作为筛选标记。2插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。（三）人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体（2）低拷贝数的质粒载体（3）失控的质粒载体（4） 插入失活型质粒载体（5）正选择的质粒载体（6） 表达型质粒载体（四）经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101：第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。它有6个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I，其中主要使用EcoR I。（如下图） 2. ColE1：天然质粒，属高拷贝型。特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多。分子大小：6.3 kb选择标记：大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）3. pBR322该质粒具有以下优点：1） 分子大小4363bp，容易纯化。2） 含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。3） 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以产生大量的重组pBR322分子。 pBR322的结构4. pUC系列pUC8也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。pUC8的优点：1）突变位点位于复制起点，复制前可以使细胞中质粒的拷贝数达到500-700个，可以提高载体的产量。2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）pUC8的多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。图pUC8的结构图（五）质粒载体的不稳定性 分离的不稳定：在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。结构的不稳定：寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。影响质粒稳定性的主要因素：i. 新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应质粒载体不仅会加重寄主细胞内的新陈代谢（即复制、转录和翻译）负荷，而且有的还会使其时代时间延长15%左右。从细胞生理学角度讲，为维持质粒载体基因的表达活性，包括RNA的转录与蛋白质的合成，寄主细胞必须承担额外的负担；此外，克隆基因的超表达产物，以及因多拷贝质粒载体引起的染色体基因的超表达产物，都可能对寄主细胞产生毒害作用，严重的会导致细胞死亡。这样那些无质粒的载体乘势就可以大量复制，占优势地位。ii. 拷贝差度对质粒载体稳定性的效应差度：不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，称为差度。低差度的质粒载体相当稳定；高差度的质粒载体稳定性较差。iii. 寄主菌的重组体系对质粒载体稳定性的效应野生型E.coli中，质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。噬菌体载体噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，加入噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的噬菌体改造成的载体应用最为广泛。一、 噬菌体的生物学特性：（一） 噬菌体的基本功能：l 利用寄主细胞的核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及产能体系进行生长和增殖。l 保护自己的核酸分子免受环境化学物质的破坏。l 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞。l 将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。l 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒。（二）噬菌体的生活周期：1、溶菌生命周期：感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。其基本过程为：吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。转变：被感染细菌的细胞的功能发生变化，成为制造噬菌体颗粒的场所。合成：功能发生了改变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体的颗粒，即噬菌体的形态建成。释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。2、溶源生命周期感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中，成为它的一个组成部分。二、噬菌体载体（一） 噬菌体l噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。l 噬菌体基因组为长度约为 50kb 的双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp （GenBank 注册号为：J02459 或 M17233）。在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5 末端带有 12 个碱基的互补单链粘性末端，叫COS位点。12 个碱基的序列为 5-GGGCGGCGACCT-3。当 l 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，COS位点两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。同时COS位点也是噬菌体包装蛋白的识别位点，包装范围在35kb51kb。l噬菌体的基因组可分为3个区域：右侧的DNA复制与调控及裂解相关区域，左侧是头部蛋白和尾部蛋白基因区域，中间为非必需区，可被外源基因取代。野生型 噬菌体基因组 DNA 为 48kb ，若用外源 DNA 片段完全替换可取代区，外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内。噬菌体的选择标记：lacZ 基因lacZ 基因也可用于 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的 -半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。基因 c 失活基因 c 是 噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达，与操纵区 o R 和 o L 结合。 c 基因的表达促进 噬菌体进入溶源状态，基因 c 产物活性受到影响会促进 噬菌体进入裂解循环。在带有 hfl（ 高频溶源化， high frequency of lysogenization）的 E.coli 中，噬菌体可高效率地进入溶源状态。在 hfl 突变 E.coli 中，基因 c 产物可以累积到较高水平。基因 c 产物为基因 c 的正调节物，因此 hfl 突变可增加基因 c 的产物，从而使裂解生长受到抑制，高效地进入溶源状态。如果外源 DNA 片段插入基因 c 中，将高频率地使 hfl 突变 E.coli 进入裂解生长状态。在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。Spi 筛选野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。如果 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，同时带有 chi 位点，并且宿主菌为 rec + ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，噬菌体的这种表型称作 Spi- 。因此，通过噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。噬菌体载体的类型：噬菌体载体有两种类型：插入型和置换型。插入型噬菌体是由于改建后的噬菌体较野生型短，所以可插入外源DNA。而且缺失的片段越长，插入的片段越大。置换型噬菌体基因组分三个区域：左侧区域包括外壳蛋白基因，约20kb；中间区域18kb，为不重要的替换区，可被外源基因替换；右侧区域含有复制及裂解基因，约12kb。 DNA与外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源DNA片段。（二）单链M13噬菌体：M13丝状噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，其基因组为单链环状DNA分子，全长6.5 kb。M13 感染宿主菌以后，单链DNA转变成双链复制形式的DNA，当复制200-300拷贝以后，又只合成单链DNA，最后包装成单链噬菌体粒子。M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 （GenBank 注册号为 V00604） 。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。M13单链噬菌体主要用于需要单链DNA做模板时，如DNA测序。M13噬菌体基因组中主要含有与复制有关的遗传信息，只有一段由507个核苷酸组成的序列可被替换，因此M13噬菌体载体只能插入约300-400bp的外源片段。(三) 柯斯质粒载体：1978年由Collins和 Hohn改建的一种新型的大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体的cos位点构成。一般长为4-6kb。含有Ampr和Tetr 抗性基因。其上的cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA片段的长度可大于40 kb，从而大大增加了载体的携带能力。粘粒的结构特征和用途粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。粘粒载体的工作原理 粘粒克隆的主要原理类似 l 噬菌体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于 l 噬菌体载体的左右臂， cos 位点通过粘端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。当多联体与 l 噬菌体包装蛋白混合时， l 噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能将切割两个 cos 位点，并将两个同方向 cos 位点之间的片段包装到 l 噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组 DNA 就象 l 噬菌体 DNA 一样被注入细胞并通过 cos 位点环化，这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。通过这种方式，就将外源 DNA 片段通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中了。 与 l 噬菌体载体不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。这样所得到的菌落的总和就构成了基因文库。人工染色体载体一、酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes YACs）YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。1YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。 YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。2YAC 载体的工作原理 YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图3-26是 pYAC4 的遗传结构图，当用 BamH 切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。图3-27描绘了 YAC 载体的原理性工作流程。对于 BamH切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoR或 Sma 切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落； 而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库。 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。 YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面：首先，在 YAC 载体的插入片段会出现缺失 （deletion） 和基因重排 （rearrangement） 的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%50% 。最后， YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了 YAC 载体的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。但是 YAC 的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。 二、细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs）1F 质粒大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。2细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ） 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。第一代 BAC 载体 （Shizuya et al. 1992） 不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not 识别序列，位点十分稀少。重组子通过