免疫磁捕获实时荧光PCR快速检测鸡肉中沙门氏菌.doc

免疫磁捕获-实时荧光 PCR 快速检测鸡肉中沙门氏菌*张东方1，2 ，袁飞1 ，王娉1 ，胡玥1 ，陈颖1 ，葛毅强2，31( 中国检验检疫科学研究院，北京，100123) 2( 中国农业大学食品学院，北京，100083)3( 中国农村技术开发中心，北京，100045)摘 要 对免疫磁捕获-实时荧光 PCR 检测鸡肉中沙门氏菌进行了初步研究。主要包括免疫磁珠制备条件的选择及优化，通过实验最终确定了以 6 mg / mL EDC 和 5 mg / mL NHS 活化直径为 700 nm 的羧基聚苯乙烯磁性微 球，与浓度为 100 g / mL 的沙门氏菌抗体在 37 振荡孵育 1. 5 h，制备得到抗沙门氏菌免疫磁珠，与市售沙门氏 菌免疫磁珠试剂盒( Dynal 产品) 捕获效率相当。免疫磁捕获-实时荧光 PCR 检测方法检测限为 104 CFU / mL 左 右，能在 16 h 内检测出鸡肉中 104 CFU / mL 的沙门氏菌，可用于食品中沙门氏菌的快速检测。关键词 沙门氏菌，免疫磁捕获法，实时荧光 PCR，检测沙门氏菌属( Salmonella spp. ) 常存在于肉制品、蛋、奶类等畜禽产品中，是最常见的人畜共患的病原 菌之一，根据国际食源性病原菌所致危害的严重性， 沙门氏菌被列为首选控制的食源性致病菌1。目前 沙门氏菌的检验多采用传统的检测方法、PCR 方法 及实时荧光 PCR 法等。传统的检测方法一般需要 5 7 d，周期长，过程繁琐; PCR 方法及实时荧光 PCR 方法，虽然操作简单，但需要待检样品中菌体达到较 高浓度。免疫磁珠( Immunomagnetic Beads，IMB ) 具 有选择性好，特异性强，能起到富集浓缩细菌的作用， 有效避免或减少漏 检，且 可 去 除食品样品中抑制 PCR 扩增的成分。已有学者利用免疫磁珠结合传统 显色培养法、酶联免疫或普通 PCR 等方法进行沙门 氏菌检测，仍存在耗时长，操作复杂等问题2 3。本 研究优化了沙门氏菌免疫磁珠制备条件，建立了沙门 氏菌免疫磁捕获-实时荧光 PCR 快速检测方法，利用 该方法检测了人工污染沙门氏菌鸡肉样品，并对比了 自制免疫磁珠与免疫磁珠试剂盒的捕获效率。猪霍 乱 沙 门 氏 菌 ( IQCC10502 ) 、病 牛 沙 门 氏 菌( IQCC10510) 、肯塔基沙门氏菌( IQCC10530 ) 、布伦 登卢 普 沙 门 氏 菌 ( IQCC10542 ) 、伤 寒 沙 门 氏 菌 ( IQCC10593) 、肠炎沙门氏菌( IQCC10512 ) 、鸭沙门氏 菌 IQCC10509 ) 、 山 夫 登 堡 沙 门 氏 菌( IQCC10520) 、阿伯丁沙门氏菌( IQCC10511 ) 、旺兹沃斯沙门 氏 菌 ( IQCC10515 ) ，对 照 菌 株 ( 大 肠 杆 菌 IQCC10103) 均来源于中国检验检疫科学研究院菌种 保藏中心( IQCC) 。1. 1. 2样品鸡胸肉，购自北京市场。1. 1. 3主要仪器与设备微量移液器( 10 L，100 L，200 L，1 000 L，德国 Eppendorf 公 司) ; 实 时 荧 光 定 量 PCR 扩 增 仪( Mastercycler ep realplex，德国 Eppendorf 公司) ; 电泳 仪( DYY-6C，北京六一仪器厂) ; 凝胶成像仪 ( Gene Genius) ; 倒置生物显微镜( DMI3000B、DM6000B，德 国 LEICA 公司) ; 全波长酶标仪( Multiskan Spectrum， 美国 Thermo 公司) ; 全自动微生物分选仪( BeadRe- trieverTM ，美国 Invitrogen 公司) ; 磁力架 ( Promega 12 well magnetic seperator) 。11. 1材料与方法实验材料实验菌株1. 1. 4主要试剂1. 1. 1脑心浸液肉汤( BHI) ( 美国 Difico 公司) ; 营养琼脂( 北京陆桥公司) ; API20E( 法国生物梅里埃公司) ;沙门氏菌标准菌株( ATCC14028 ) ，12 株 A-F 群O 价 沙门氏菌分别 为: 甲型副伤寒沙门氏菌 ( IQCC10518) 、乙型副伤寒沙门氏菌( IQCC10504 ) 、核壳式聚苯乙烯羧基化磁性微球 ( 0. 5% ，100nm、700 nm、3 m、5 m) ( 天津倍思乐色谱技术开发中心) ; 碳二亚胺( EDC) ( 上海共价化学) ; N-羟基琥珀 酰亚胺 ( NHS ) ( 上 海 共 价 化 学 ) ; 牛 血 清 白 蛋 白第一作者: 硕士研究生( 陈颖研究员，葛毅强教授为通讯作者) 。* 国家科技支撑计划项目( 2009BAD9B06) ; 国家质检总局科研计 划项目( 2009IK312、2010IK178) 。无菌水中溶解 KH2 PO4 0. 2 g，KCl 0. 2 g，Na2 HPO4 12H2 O 2. 9 g，NaCl 8. 0 g，高压灭 菌) ; 洗 涤 缓 冲 液 ( pH8. 0 的 Trise-HCl，含 0. 05% Tween 20 ) ; 封 闭 液 ( 含 1% BSA 的 PBS 溶液) ; Dynalbeads 抗沙门氏菌免 疫磁珠试剂盒( 美国 Invitrogen 公司) ; BCA 蛋白定量 试剂盒( 美国 Novagen) ; Faststart universal probeMaster ( Rox) ( Roche 公司) 。蛋白质溶液浓度。通过测定固化前抗体浓度和固化后剩余抗体浓度，计算固化效率。固化效率 / % = ( 固化前抗体浓度-固化后剩余抗 体浓度) / 固化前抗体浓度 100磁性微球粒径的确定: 选择粒径为 100 nm、700 nm、3 m、5 m 的羧基聚苯乙烯磁性微球，与抗体进 行固化反应，分别测定固化效率，进行 3 次重复试验， 取平均值，确定最适磁性微球粒径。抗体浓度的确定: 选择最适粒径的磁性微球，按 上述方法进行活化，分别将抗沙门氏菌血清进行 10 倍、20 倍、40 倍、80 倍、160 倍、320 倍稀释，与磁性微 球固化，分别测定固化效率，进行 3 次重复试验，取平 均值，确定最适抗体浓度。固化时间的确定 确定磁性微粒的粒径及最佳抗 体浓度后，将抗体与磁性微球的固化时间设为 0. 5、1、1. 5、2、2. 5 h，与抗体进行固化反应，分别测定固化 效率，进行 3 次重复试验，取平均值，确定最适固化时 间。EDC 和 NHS 浓度的确定 将 pH 值为 6. 6 的 EDC 和 NHS 浓度各自设为 1 8 mg / mL 后进行浓度梯度 组合，分别活化已确定粒径的羧基磁性微球，再与抗 体进行固化反应，进行 3 次重复试验，取平均值，确定 最适 EDC 和 NHS 浓度。1. 2实验方法1. 2. 1免疫磁珠制备及其捕获效率测定1. 2. 1. 1抗体制备将 12 株 A-F 群 O 价沙门氏菌菌株在脑心浸液 培养液中 37 培养 18 24 h，经沙门氏菌显色培养 基平板划线纯化，获得纯培养菌悬液，送至上海英骏 生物技术有限公司，制备抗沙门氏菌免疫血清，分离 纯化得到沙门氏菌属多克隆抗体，分装，于 20 冷 冻保存。1. 2. 1. 2免疫磁珠制备免疫磁珠制备过程，参考李玲等的方法4，并略 作改动，具体操作如下:磁性微球活化: 取 500 L 羧基磁性微球至 1. 5 mL 离心管中，用 1 mL PBS 缓冲液洗涤 2 次后，加入 PBS 缓冲液 50 L 重新悬浮; 加入新配制的浓度为 6 mg / mL，pH 为 6. 6 的 EDC 及 NHS 溶液各 200 L，室 温( 24 ) 振荡( 500 r / min) 活化反应 20 min，上磁力 架除去液相; 用 1 mL PBS 缓冲液振荡清洗 3 次，上磁 力架除去液相。磁性微球与抗体固化: 加入 100 g / mL 的抗沙 门氏菌多克隆抗体 100 L，37 振荡( 500 r / min) 固 化 2 h，上磁力架，收集液相，测定固化后剩余抗体浓 度，以确定固化效率; 用 1 mL 的洗涤缓冲液振荡清洗3 次，上磁力架除去液相。免疫磁珠捕获沙门氏菌菌悬液中目的菌1. 2. 1. 4按照 BeadRetriever 全自动微生物分选仪操作规程，安装好磁免疫筛选设备。将沙门氏菌菌悬液及免 疫磁珠加入筛选系统中，选择相应的筛选程序“Sal- monella”进行沙门氏菌筛选( 该程序持续 22 min 左 右) 。筛选结束后，将富集后的复合物 100 L 转移至1. 5 mL 离心管，进行实时荧光 PCR 检测或进行适当 稀释，选择合适梯度平板计数，计算免疫磁珠捕获效 率。封闭: 加 入 100 L 封 闭 液，37 振 荡 ( 500r /min) 封闭 1 h; 用 1 mL 洗涤缓冲液振荡清洗 3 次，上磁力架除去液相。重悬: 加入 100 L PBS 缓冲液重悬，4 保存备 用。1. 2. 1. 5免疫磁珠捕获效率的测定将沙门氏菌加入脑心浸液肉汤过夜培养，菌落计数后将菌液浓度调整为 104 CFU / mL，分别取自制免 疫磁珠悬液 12，25，50，100 L，加入沙门氏菌细菌稀 释液 1 mL，参照步骤 1. 2. 1. 4 进行沙门氏菌筛选，收 集后的复合物 100 L，做 10 倍递减稀释，取最佳稀 释度菌液 100 L 进行平板菌落计数，每个试验重复3 次，计算免疫磁珠的捕获率，选择捕获效率最高者 为最适免疫磁珠添加量。同时以市售沙门氏菌免疫 磁珠试剂盒作为比较。免疫磁 珠 捕 获 率 / % = ( 磁 分 离 后 的 菌 落 数 / 磁1. 2. 1. 3免疫磁珠制备条件优化磁性微球的粒径，抗体浓度，磁性微球与抗体的固化时间及 EDC、NHS 的浓度为影响免疫磁珠分离 效率的主要因素，本研究针对这些因素，进行了一系 列条件的优化选择，确定固化效率最高者为最佳制备 条件5。参照 BCA 蛋白定量试剂盒说明书，测定蛋 白质标准溶液的 OD 值，制定标准曲线，计算得被测分离前的菌落数) 100结果与分析21. 2. 2免疫磁捕获-实时荧光 PCR 方法建立2. 1免疫磁珠制备条件优化结果采用 BCA 蛋白定量试剂盒测得固化前抗体浓度 为 4. 0 mg / mL。从磁性微球的粒径，抗体浓度，磁性 微球与抗体的固化时间及 EDC、NHS 的浓度 4 方面 优化免疫磁珠制备条件，优化结果如下:参照 1. 2. 1. 4 步骤对菌悬液中沙门氏菌筛选结束后，将富集后的复合物 100 L 转移至 1. 5 mL 离心 管，热裂解法提取 DNA，进行实时荧光 PCR 检测。引物和探针: 根据 Genbank 中沙门氏菌属 invA 基因序列和文献报道6，确定用于 invA 基因扩增的 特异性引物及探 针: 上 游 引 物 ( 5 -GCGTTCTGAAC- CTTTGGTAATAA-3) 、下游引物( 5-CGTTCGGGCAAT- TCATTA-3) 及探针( 5 FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTT- GTCTTCT-TAMARA 3) ，由上海英骏生物技术有限公 司合成。热裂解法提取 DNA7: 筛选后的免疫磁珠-沙门 氏菌复合物于 100 沸水裂解 10 min，冰浴 5 min，再 经 8 000 r / min 离心 5 min 后，取上清液 50 L 作为实 时荧光 PCR 扩增模板。扩增反应及体系 扩增体系如下: 25 L 反应体 系中包括 Faststart Mastermix 12. 5 L; 上下游引物各200 nM; 探针 200 nM; DNA 模板 5 L; 6 L 无菌双蒸 水。反应程序为: 95 10 min，95 15 s，60 1 min，45 个循环，设立阴性( 大肠杆菌 IQCC10103 ) 及空白( 无菌双蒸水) 对照。2. 1. 1磁性微球粒径的选择不同粒径的磁性微球与抗体的固化效率不同。本研究对比了 100 nm、700 nm、3 m、5 m 4 种粒径 的磁性微球与抗体的固化效率，以确定最适粒径的磁 性微球。实验结果表明: 随着磁性微球粒径减小，其 比表面积随之增大，与抗体的固化效率逐渐增大; 粒 径为 100 nm 的磁性微球与抗体固化效率最高，达93. 80% ( 图 1A) ，但此时微球间的聚集重叠较明显， 磁性微球聚沉现象严重，分散不均匀，经超声波超声 分散后，很快又聚集呈团状，不稳定。综合考虑，本研 究选择粒径 700 nm 的磁性微球作为后续实验的材 料，此时磁性微球与抗体固化效率为 90. 07% 。2. 1. 2 抗体浓度的确定本研究对比了 10 倍，20 倍，40 倍，80 倍，160 倍，320 倍稀释的抗沙门氏菌血清，以确定最适抗体浓 度。实验结果表明: 随着稀释倍数增加，固化效率也 逐渐增加，当抗体稀释倍数为 40 倍时，固化效率达到99. 77% ，当稀释倍数继续增大时，固化效率不再增 加，甚至会降低，抗沙门氏菌血清稀释 160 倍时，固化 效率达到最低，而当稀释倍数继续增加至 320 倍时， 固化效率又有上升趋势，但此时磁性微球上固化抗体 的绝对量过少( 图 1B) 。因此，确定抗体的最适固化 浓度为原液稀释 40 倍后的浓度，即 100 g / mL。2. 1. 3 固化时间的选择本研究分别选用 0. 5，1，2，2. 5 和 3 h 的抗体与 磁性微球的固化时间，以确定最适固化时间。结果显 示: 随着固化时间的增加，固化效率也逐渐增强，在1. 5 h 时固化效率达到最大，固化效率为 99. 26% ，随 着固化时间继续增加，固化效率不再增强，且由于固 化过程可能会将已固化到磁珠表面的抗体振荡脱落 下来，导致固化效率降低( 图 1C) 。因此，选择 1. 5 h 作为抗体与磁性微球的最适固化时间。1. 2. 3定免疫磁捕获-实时荧光 PCR 方法检测限的确将过夜 培 养 的沙门氏菌标准菌株菌悬 液，以0. 85% 灭菌生理盐水作 10 倍梯度稀释。取不同浓度 梯度的菌悬液各 1 mL，加入自制免疫磁珠至筛选系 统中，参照步骤 1. 2. 1. 4 进行沙门氏菌筛选，将筛选 后的复合物提取 DNA，实时荧光 PCR 检测，确定免疫 磁捕获-实时荧光 PCR 方法的检测限。1. 2. 4免疫磁捕获-实时荧光 PCR 检测鸡肉模拟样品中沙门氏菌准确称取 25 g 鸡肉样品，加入 225 mL 0. 85% 无 菌生理盐水于无菌均质袋中，均质器拍击 30 s。取各 稀释梯度的沙门氏菌标准菌株菌悬液 0. 5 mL，加入4. 5 mL 均质后的样品上清液，振荡混合均匀，得到沙门氏菌鸡肉模拟添加样品。取不同浓度梯度的鸡肉模拟样品 1 mL，加入自 制免疫磁珠，参照步骤 1. 2. 1. 4 进行沙门氏菌筛选， 将筛选后的复合物提取 DNA，实时荧光 PCR 检测，确 定免疫磁捕获-实时荧光 PCR 方法对沙门氏菌模拟 样品的检测限。EDC 和 NHS 浓度的选择2. 1. 4将 EDC 和 NHS 浓度各自设为 1 8 mg / mL，以确定最 适 EDC 和 NHS 浓 度。 表 1 为 经 不 同 浓 度EDC 和 NHS 活化后的磁性微球与抗体固化的固化效率。结果表明，当 EDC 和 NHS 溶液浓度分 别 为 6mg / mL 和 5 mg / mL 时，固化效率最大，达到 97. 14% 。因此，选择 6 mg / mLEDC 和 5 mg / mLNHS 活化磁性微球。图 1 磁性微球与抗体固化条件优化结果表 1 固化效率随 EDC 和 NHS 浓度变化表EDC 浓度 / ( mgmL 1 )固化效率 /%123456781234567879. 7185. 9491. 6076. 6584. 9391. 6295. 1894. 1184. 4082. 2081. 0182. 3786. 1481. 3779. 2788. 9376. 0977. 5781. 1896. 1392. 5285. 2491. 1093. 7982. 4484. 1689. 7487. 3291. 1289. 1591. 4686. 4090. 8585. 3193. 4190. 4896. 1488. 0789. 7996. 3178. 0596. 0895. 4695. 0697. 1494. 1794. 8496. 1284. 7890. 6589. 4488. 1192. 8290. 2588. 6187. 4279. 1489. 3994. 7582. 7188. 4187. 3984. 8494. 00NHS 浓度 /( mgmL 1 )104 CFU / mL 沙门氏菌菌悬液中全部目的菌，后续实验均采用 100 L 免疫磁珠进行磁捕获。相同条件 下，用 100 L 市售免疫磁珠试剂盒做为比较，捕获效 率达 97. 4% ，两种免疫磁珠捕获效率经 t 检验( P =0. 95) 无显著性差异，即自制免疫磁珠捕获效率与市售免疫磁珠捕获效果相当，但成本比市售免疫磁珠 低。经一系列制备条件的优化，最终确定以 6 mg / mLEDC 和 5 mg / mL NHS 活化 700 nm 粒径的羧基聚苯 乙烯磁性微球，与浓度为 100 g / mL 的抗沙门氏菌 抗体在 37 振荡孵育 1. 5 h，再经封闭，清洗等过程， 制备得到抗沙门氏菌免疫磁珠。免疫磁珠捕获效率的测定将沙门氏菌菌悬液与不同量的免疫磁珠反应，对 磁捕获后的复合物进行适当稀释，在 37 条件下培 养 48 h 后，计算菌落总数。菌落总数( CFU / mL) = 同一梯度下 3 个培养皿 的菌落数之和 /3 10 该计数培养皿的稀释倍数计算得磁分离前的菌落数为 5. 2 108 CFU / mL，不同添加量的免疫磁珠捕获效率见表 2。表 2 不同添加量的免疫磁珠捕获效率2. 2免疫磁捕获-实时荧光 PCR 方法检测限的确定在确立了最适免疫磁珠添加量的基础上，取不同 浓度梯度的菌悬液各 1 mL，加入 100 L 免疫磁珠进 行磁捕获，实时荧光 PCR 检测结果见图 2，其中以 CT 值小于 45 确定为阳性扩增信号，能检测到的最低菌 液浓度即为该方法的检测限。结果显示，该方法对于109 104 CFU / mL 浓度的菌悬液均显示出阳性信号，更低浓度为阴性信号，确定该方法的检测限为 104CFU / mL 左右。2. 3菌落总数 10 7 / ( CFUmL 1 )不同免疫磁珠量 / L捕获效率 /%平行 1平行 2平行 3平均值1225501001225324810253646721415710 2. 524 2. 336 4. 550 5. 918. 6 4. 8445. 5 4. 4469. 9 8. 6796. 8 11. 27鸡肉模拟样品免疫磁捕获-实时荧光 PCR 检测2. 4限确定取不同浓度梯度的鸡肉模拟样品 1 mL，各加入100 L 自制免疫磁珠，免疫磁捕获后，进行实时荧光 PCR 检测结果显示，该方法对 108 104 CFU / mL 沙 门氏菌均检出阳性信号，更低浓度检出阴性信号( 图由表 2 可知，随着免疫磁珠量不断增加，捕获效率不断提高，当免疫磁珠添加量为 100 L 时，捕获效 率最高，达 96. 8% ，即此时免疫磁珠几乎可以捕获本研究将免疫磁珠捕获与实时荧光 PCR 方法结合，建立了免疫磁捕获-实时荧光 PCR 快速检测方 法，检测限为 104 CFU / mL 左右，可在 16 h 内检测出 鸡肉中 104 CFU / mL 的沙门氏菌。本实验制备的免 疫磁珠与市售沙门氏菌免疫磁珠试剂盒 ( Dynal 产 品) 捕获效率相当，但成本较低，同时由于本研究制 备的沙门氏菌多克隆抗体，是利用国内具有代表性的 A-F 群 O 价沙门氏菌进行免疫得到的，对于我国食品中沙门氏菌的快速分离和检验有着重要的应用价值。图 2 免疫磁捕获-实时荧光 PCR 检测限阳性对照: 沙门氏菌标准菌株 DNA; 阴性对照: 大肠杆菌 DNA;空白对照: 无菌水参 考 文 献3) 。结果表明，免疫磁珠表面抗体与样品中目的菌抗原特异性结合，有效去除了食品样品中抑制 PCR 扩增的成分，提高了检测的灵敏度，可联合实时荧光 PCR 检测法与免疫磁珠富集技术检测浓度为 104CFU / mL 的鸡肉样品。1张钧 . 食品安全与微生物控制综述J. 安徽预防医学杂志，2006，12( 6) : 408 410.Kumar S，Balakrishna K，Singh G P，et al. Rapid detection of Salmonella typhi in foods by combination of immu- nomagetic separation and polymerase chain reactionJ. World Journal Microbiology Biotechnology，2005，21( 5) : 625 628.Tatavarthy A，Peak K，Vequilla W，et al. An accelerated method for isolation of Salmonella enterica serotype Typhi- murium from artificially contaminated foods，using a short preenrichment，immunomagnetic separation，and xylose-ly- sine- desoxycholate agar ( 6IX method) J. Journal of Food Protection，2009，72( 3) : 583 590.李玲 . 基于量子点和免疫磁珠技术同步检测抗弓形虫IgG 和 IgM 抗体的实验研究D. 重庆: 第三军医大学，2009.Yang H，Qu L W，Wimbrow A N，et al. Rapid detection of Listeria monocytogenes by nonoparticle-based immunomag- netic separation and real-time PCRJ. International Jour- nal of Food Microbiology，2007，118( 2) : 132 138.Daum L T，Barnes W J，McAvin J C，et al. Real-Time PCR Detection of Salmonella in Suspect Foods from a Gastroen- teritis Outbreak in Kerr County，TexasJ. Journal of Clin- ical Microbiology，2002，40( 8) : 3050 3053. 陈伟，李正国，杨平，等 . 肉制品中志贺氏菌 DNA 的快 速提取方法J. 食品与发酵工业，2009，35 ( 5 ) : 12 15.李志培，苗丽 . 致病性大肠杆菌的流行及免疫磁珠分离 技术的应用J. 食品安全与检测，2004( 12) : 58 59. Taban B M，Ben U，Aytac S A，et al. Rapid detection of Salmonella in milk by combined immunomagnetic separa- tion-polymerase chain reaction assayJ. Journal of Dairy Science，2009，92( 6) : 2 382 2 388. 王海明，俞晓，金燕飞，等 . 应用磁免疫技术快速检测 食源性沙门氏菌方法研究J. 中国卫生监督杂志，234阳性对照: 沙门氏菌标准菌株 DNA; 阴性对照: 大肠杆菌 DNA;空白对照: 无菌水图 3 自制免疫磁捕获-实时荧光 PCR检测模拟添加样品结果5结论免疫磁珠( IMB) 是由磁性微球表面固化抗原或 抗体等免疫活性分子构成，是免疫学和磁载体技术结 合而发展起来的一项免疫学技术，可应用于检验检 疫、卫生防疫和食品安全检验等领域8 9。现国内外 已有利用免疫磁珠富集食品中沙门氏菌，但大多采用 免疫磁珠试剂盒结合传统培养法进行检测，操作费时 费力，且价格昂贵，无法得到普遍应用。王海明10等 利用英国 MATRIX 公司的抗沙门氏菌免疫磁珠试剂 盒捕获目的菌，捕获后的复合物直接在显色培养基中 培养，检测周期约为 40 h; Leon 11等利用 Dynalbeads 抗沙门氏菌免疫磁珠，结合酶联免疫( EIA) 反应检测 禽肉中的沙门氏菌，可在 48 h 内检测到样品中 104 106 CFU / mL 浓度的沙门氏菌。36789102009，16( 1) : 36 39.11 Leon-Velarde C G，Zosherafatein L，Odumeru J A，et al.Application of an automated immunomagnetic separation- enzyme immunoassay for the detection of Salmonella en-terica subspecies enterica from poultry environmentalswabsJ. Journal of Microbiological Methods，2009，79( 1) : 13 17.Rapid Detection of Salmonella in Chicken by ImmunomagneticCapture-Real Time PCR AssayZhang Dong-fang1，2 ，Yuan Fei1 ，Wang Pin1 ，Hu Yue1 ，Chen Ying1 ，Ge Yi-qiang2，31( Institute of Food Safty，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123，China)2( College of Food Science Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)3( China Rural Technology Development Center，Beijing 100045，China)ABSTRACT In this preliminary study，the Immunomagnetic Beads Capture-Real time PCR ( IMB-RTPCR) methodfor detecting Salmone