母鼠孕期摄入乙醇对子鼠背侧中缝核内5羟色胺合成的影响.doc

母鼠孕期摄入乙醇对子鼠背侧中缝核内5羟色胺合成的影响作者：金福,金正勇,丁允英,朴相奇单位：1.延边大学附属医院 儿科，吉林 延吉；2.韩国朝鲜大学校医科大学 解剖学教室，韩国 光州;3.韩国朝鲜大学校医科大学 儿科学教室，韩国 光州【摘要】目的探讨母鼠孕期摄入乙醇对子鼠背侧中缝核内5羟色胺（5HT）合成的影响.方法选择SD母鼠24只，于怀孕第6日随机分为乙醇组、正常对照组和代理母组.乙醇组母鼠每日摄取热量为35cal的乙醇,正常对照组母鼠为35cal糊精,代理母组母鼠为普通饲料.乙醇组、正常对照组母鼠分娩6h后与其子鼠分开，麻醉后心脏采血，检测血液中乙醇和甲状腺素水平.乙醇组及正常对照组新生子鼠由代理母组代理母鼠养育，并分别于出生后0，7，14，21，28d时麻醉处死子鼠，采用免疫组织化学ABC染色法观察子鼠背侧中缝核内含有5HT的神经元的分布及形态.结果乙醇组母鼠血中乙醇浓度明显高于正常对照组，而乙醇组母鼠血中甲状腺素水平明显低于正常对照组.正常对照组子鼠生后7d开始出现成熟的含有5HT的神经元，即可观察到长而突起明显的、双极或多极的含有5HT的神经元，出生后14d开始出现含有5HT神经元突起所形成的分支及其相互间的连接.乙醇组子鼠始终未出现具有上述表现的成熟的含有5HT的神经元.在所有时间段中，乙醇组子鼠含有5HT的神经元数均较正常对照组明显减少，并于生后第7日开始显著减少.结论母鼠孕期摄取乙醇不仅可引起血中甲状腺素水平降低，而且可抑制后代背侧中缝核内5HT的合成及神经元的发育. 【关键词】 中缝核;血清素;乙醇;胎儿;大鼠Effects of prenatal alcohol exposure on serotonin in the rat dorsal raphe nuclei JIN Fu1, JIN Zhengyong1, CHUNG Yoonyoung 2, PARK Sangkee3 (1.Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China;2.Department of Anatomy; 3.Department of Pediatrics：College of Medicine, Chosun University, Gwangju, Korea) ABSTRACT:OBJECTIVETo investigate the changes of serotonin 5hydroxytryptamine (5HT) in the rat dorsal raphe nuclei with prenatal alcohol exposure.METHODSTwentyfour timepregnant SD rats were divided into three groups on the 6th day of gestation. Alcohol group received 35 calories of liquid alcohol diet every day; control group was fed a liquid diet in which dextrin replaced alcohol isocalorically; surrogate group intook food normally. Blood samples were obtained by cardiac puncture, under anesthesia, from alcohol and control groups within 6 h after its last pup was born. The plasma concentrations of alcohol and thyroxine were determined. Pups of alcohol and control groups were fostered by surrogate mothers, and executed at anesthesia at postnatal 0, 7, 14, 21 and 28 days for measuring the distribution and form of nerve cells containing serotonin via immunohistochemistry in the dorsal raphe nuclei.RESULTSThe blood alcohol concentration was higher in alcohol group dams than in control group, with significant difference. Thyroxine concentration was significantly decrease in alcohol group dams than in control group. In control group was observed mature serotonin containing neurons on and after the postnatal 7 days，many of these cells were bipolar or multipolar in shape and their processes had increased in length and thickness, since postnatal 14 day, their fibers and terminals formed a rich network. In contrast, the maturation of serotonincontaining neurons was not found in alcohol group at all ages. The obvious decrease of serotonincontaining neurons was observed in alcohol group compared to control group at all ages, and significant reduction of serotonincontaining neurons was found after 14 days of birth.CONCLUSIONWhen dams exposured alcohol within gestation, not only the blood thyroxine concentration was significantly decreased in dams, but also serotonin synthesis of dorsal raphe nuclei and growth of serotonincontaining neurons were impaired in offsprings. Key words:raphe nuclei;serotonin;ethanol;fetus;rats 胎儿乙醇综合征（fetal alcohol syndrome，FAS）是因出生前乙醇暴露引起的胎儿和儿童常见的病理变化，具有胎儿出生前后发育迟缓、颜面部缺损或畸变及中枢神经发育异常等3种基本症状1.研究结果表明，母孕期经常饮酒，并有营养失调症状时，虽可不引起具有典型表现的FAS，但可引起以行为和认识障碍为主要表现的胎儿乙醇效果(fetal alcohol effects，FAE)，特别在胎儿脑发育关键时期持续饮酒数日时更易引起FAE2.5羟色胺（5hydroxytryptamine，5HT）是存在于哺乳动物中枢神经系统中的重要的神经传递素，与体温调节、睡眠及觉醒调节、疼痛传递的易化与抑制及焦虑和抑郁等重要的神经精神行为有着密切关系3，而含有5HT的神经元在脑内主要分布在脑干中缝核团4.本研究通过分析大鼠出生后不同时期背侧中缝核内含有5HT的神经元的分布及形态，观察了母鼠孕期摄入酒精在子鼠发育过程中对背侧中缝核中5HT合成的影响. 1 材料和方法 1.1 实验动物及分组 选择由Samtako Bio Korea公司（Accession Number：63013）提供的A级SD母鼠24只，体重为230250mg，于怀孕第6日采用随机抽签法分为乙醇组、正常对照组及代理母组.乙醇组母鼠（n=6）每日摄取含250mL/L乙醇的白酒20mL,热量为35cal；正常对照组母鼠（n=6）每日摄取糊精(日本)35mL,热量为35cal；代理母组母鼠（n=12）每日摄取普通饲料.各组母鼠均饲养于单独鼠笼，养育室温度为21，每12h调节明暗度.乙醇组、正常对照组母鼠分娩6h后与其子分开，将母鼠麻醉后行心脏采血，检测血液中乙醇浓度和甲状腺素值，进行统计学分析.乙醇组和正常对照组新生子鼠由代理母组的代理母鼠养育，1只母鼠所生的子鼠必须由另1只代理母鼠来替换.代理母组的新生子鼠行过量麻醉处死. 1.2 制作标本 出生后0，7d的子鼠给吸入乙醚麻醉，14,21,28d的子鼠腹膜注射给予戊巴比妥麻醉.麻醉后开胸，将灌流导管插入左心室，用含有肝素的生理盐水灌流冲洗，用多聚甲醛溶液为固定液灌流固定，迅速从颅骨中取出脑组织，浸泡在4多聚甲醛固定液中固定，取脑组织置于200mg/L蔗糖溶液中24h，待脑组织沉降后取出，液氮骤冷，于-20恒冷低温切片机中制作厚度为35μm的切片，置于4保管液中. 1.3 免疫组织化学ABC法染色 取组织切片（每5张中取1张），用0.1mol/L PBS冲洗数次，用1g/L过氧化氢处理，以阻断内源性过氧化物酶，用PBS冲洗数次，行免疫组织化学染色.首先用30mL/L正常山羊血清室温孵育30min，封闭非特异性结合位点.一抗（rabbit antiserotonin, BIOGENESIS）稀释度为11000，二抗（biotinylated goat antirabbit IgG，VECTOR）稀释度为1200，ABC复合物（avidinbiotin complex，VECTOR）稀释度为1100，二氨基联苯胺（3,3′diaminobenzidine tetrahydrochloride，SIGMA）显色，注意避光，尽可能使背景染色一致，PSB洗3次，每次10min，再用蒸馏水洗3次，每次5min，裱片阴干，常规脱水，透明，树胶封片，行光学显微镜观察.设置阴性对照组，除不加一抗外，其余操作方法相同，实验得到的脑片为完全不显色的空白片，未发现阳性物出现，即无特异性反应. 2 结果 2.1 母鼠血中乙醇浓度和甲状腺素值 乙醇组母鼠血中乙醇浓度为（0.16±0.05）mmol/L，与正常对照组比较明显增高，相比较有显著性差异（P0.01）；乙醇组及正常对照组母鼠血中甲状腺素值分别为（20.2±2.7）μg/L，（31.2±2.4）μg/L，乙醇组母鼠明显低于正常对照组，相比较具有显著性差异（P0.05）. 2.2 子鼠背侧中缝核内含有5HT的神经元的分布及形态 出生时，于正常对照组和乙醇组子鼠背侧中缝核内均可观察到少量短而突起不明显的未成熟的含有5HT的神经元，但乙醇组子鼠含有5HT的神经元数较正常对照组减少(图1).出生后7d时，正常对照组子鼠背侧中缝核内含有5HT的神经元数较出生时增多,可观察到大量散在分布并具有明显突起、双极或多极成熟的含有5HT的神经元；乙醇组子鼠中含有5HT的神经元数虽较出生时有所增多，但较正常对照组减少，并仅可观察到具有短而突起不明显且未成熟的神经元(图2).出生后14d时，正常对照组和乙醇组子鼠背侧中缝核内含有5HT的神经元数均较出生后7d时增加，但在乙醇组子鼠中含有5HT的神经元数明显少于正常对照组；此时，于正常对照组子鼠背侧中可观察到含有5HT的神经元突起所形成的分支及其相互间的连接，乙醇组子鼠背侧中亦可见含有5HT的神经元，但未观察到神经细胞间所形成的连接(图3).出生后21,28d时，正常对照组和乙醇组子鼠背侧中缝核内含有5HT的神经元形态与分布类似于出生第14d时，乙醇组子鼠背侧中含有5HT的神经元数明显少于正常对照组，乙醇组子鼠背侧中仍未观察到成熟的含有5HT的神经元以及领近神经元间所形成的连接(图4及图5). 3 讨论 大鼠可出现躯干、大脑和小脑的生长障碍，并可延迟小脑浦肯野细胞的成熟56.小鼠出生后在内鼻皮层中含有神经肽Y神经细胞数减少7.近年来研究结果表明，如大鼠在出生前通过母体接触乙醇，可引起在5HT合成过程中起重要作用的TPH合成障碍8.Feng等9报道，出生前接触乙醇可影响大脑皮层和海马中脑源性神经营养因子蛋白及其mRNA表达.Nathaniel等10报道，乙醇可抑制催乳素的分泌，接触乙醇的母鼠可出现乳汁缺少，而突然中断持续接触乙醇的母鼠乙醇后可出现行为变化.本研究结果表明，怀孕6d至分娩持续摄入乙醇的母鼠所生的子鼠出生后背侧中缝核内含有5HT的神经元数明显减少，尤其在出生后14d开始显著减少，且在含有5HT的神经元成熟度及神经细胞间连接上也出现明显异常，提示出生前接触乙醇不仅引起包括内鼻皮层及海马等边缘系统、小脑及大脑的发育异常，还可引起脑干中缝核的发育异常，提示出生前接触乙醇不仅影响脑源性神经营养因子等神经营养素的合成，而且还影响神经肽Y，5HT等神经传递因子的合成.本研究结果表明，孕期摄入乙醇的母鼠血中甲状腺素水平明显降低，且子鼠背侧中缝核内含有5HT的神经元数量明显减少，在含有5HT的神经元发育上也出现异常，此结果可能与出生前接触乙醇的大鼠小脑浦肯野细胞发育异常及母鼠孕期低甲状腺素状态等有关.总之，孕母摄取乙醇不仅可明显降低血液中甲状腺素水平，而且可抑制其后代背侧中缝核内5HT的合成及含有5HT的神经元的发育,抑制或降低神经元之间的相互传递.【参考文献】 1 Spohr HL, Willms J, Steinhausen HC.Prenatal alcohol exposure and longterm developmental consequencesJ.Lancet,1993,34(8850):907.2 Hankin JR.FAS prevention strategiesJ.Alcohol Health Res World,1994,18:62.3 Azami J, Green DL, Roberts MHT, et al.The behavioral importance of dynamically activated descending inhibition from the nucleus gigantocellularis pars alphaJ.Pain,2001,92:53.4 Kim EK, Lee MH, Kim H, et al.Maternal ethanol administration inhibits 5hydroxytryptamine synthesis and tryptophan hydroxylase expression in the dorsal raphe of rat offspringJ.Brain Dev,2005,27(7):472.5 Nathaniel EJ, Nathaniel DR, Mohamed SA, et al.Growth Patterns of rat body, brain, and cerebellum in fetal alcohol syndromeJ.Exp Neurol，1986，93（3）：610.6 Nathaniel EJ， Nathaniel DR， Mohamed S， et al.Prenatal alcohol exposure and cerebellar development in ratsJ.Exp Neurol，1986，93(3)：