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毕业论文(成稿)3 郑州牧业工程高等专科学校毕业论文题目生物检测技术在食品检测中的应用作者唐金祥学号5xx122065系别生物工程系专业生物技术及应用指导者乔宏兴评阅者xx年5月生物检测技术在食品检测中的应用摘要生物检测技术就是利用生物体对检测物质的特有反应而鉴定被测物质的质量和功效的方法。 随着我国食品技术的发展以及对外贸易的需要，传统的检测分析方法已经远远不能满足人们对食品检测技术的要求。 当今食品的检测与分析工作已经提高到一个极其重要的地位。 人们需要灵敏度高，特异性强，简便快捷的检测方法，特别是为了保证食品的安全和品质，人们更需要对食品进行各种有效营养物质和对人体有害，有毒物质的检测和分析。 随着科学技术的发展,检测技术日新月异,酶联免疫吸附测定技术由于其高度的准确性，特异性，适用范围宽，检测速度快以及费用低等优点，成为最为广用的方法之一。 聚合酶链式反应技术在食品检测的实际应用中表现出灵敏度高，速度快，简便，高效等优点。 为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持。 生物传感器有优异的选择性和较高的灵敏度，有可能不用试剂，在组分复杂的的试样用快速和连续测定被分析物。 因而在生物过程，食品工业等领域有广阔的应用前景。 由于生物芯片技术具有高通量，自动化，微型化高灵敏度，多参数同步分析，快速等传统方法不可比拟的优点，故在食品检测领域有着广泛的发展前景。 根据近年来国内外的研究进展，本文将对目前在食品检测中最常应用的酶联免疫吸附测定，聚合酶链式反应和生物传感器及生物芯片等在食品检测中的应用和未来的发展趋势做一简单介绍。 本文简要综述了目前在食品领域应用较广的生物检测技术如酶联免疫吸附实验技术，PCR技术，生物传感器，生物芯片等生物检测技术在食品检测中的应用与特点和应用前景做一简单的探讨。 ELISA技术自20世纪70年代出现以来,就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点,成为检验中最为广泛应用的方法之一。 随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展,各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备,单克隆抗体技术的应用,使得该诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性方面都有了大幅度的提高,并且在自动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定分析能力,已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。 用ELISA对蔬菜和水果中的杀菌剂噻菌灵检测的灵敏度达到9ng/mL。 因此世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此技术，美国化学会将ELISA列为农药残留分析的支柱技术之一。 1.1.1基本原理酶免疫方法和其它免疫技术一样，都是以抗体和抗原的特异性结合为基础的，其差别在于酶免疫方法以酶或者辅酶标记抗原或者抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，使检测水平接近放射免疫测定法。 酶免疫测定法可分为非均相免疫测定法和均相免疫测定法，非均相法又有固相法和液相法之分。 实践中，常用的是非均相酶固相免疫测定法即ELISA法。 该法将抗原或抗体结合到固相载体表面，将抗原或抗体相关物质与酶交联成酶结合物，一方面保持了与相应抗原或抗体结合的免疫特性，另一方面还具有酶活性。 当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后，则形成酶标抗原抗体复合物，复合物上的酶遇到相应底物时，可以催化产物水解、氧化或还原，从而产生有色物质。 根据有色物质的有无及其浓度，即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在，数量多少，从而达到定性和定量测定的目的。 ELISA法在实际应用中有直接法、间接法、抗体夹心法、三抗体、竞争法、抑制法等方法。 研究者可根据自身的条件和要求，灵活地设计适用的ELISA方法。 1.2酶免疫吸附测定法的应用1.2.1食品中微生物的检测目前5传统的微生物学方法仍然是食品检测中常用的方法，但存在操作繁琐、时间冗长、工作量大等缺点，对大部分微生物来说，用传统方法检测至少需要.6-7小时，有些致病微生物甚至无法进行人工培养。 各类肉品易受多种致病微生物的污染。 其中,沙门氏菌是人畜共患肠道病原菌和细菌性食物中毒重要病原茵。 原有的常规检测方法,存在操作复杂,需要特殊仪器、检测时间长等弊端。 因而有学者开始利用ELISA检测沙门氏菌。 蔡家利等1应用Dot-ELISA检测屠宰加工肉品中沙门氏菌。 该方法比常规培养法提前34天,不需要特殊实验设备,肉眼即可观察结果,且样品易保存。 和常规细菌学检验法对200份样品对比检验,该法检出结果符合率为96.65%。 田银芳等应用直接ELISA方法对350份奶样进行沙门氏菌的检测，与常规方法相比，该法的敏感性和特异性分别为100%和99.7%，所需检测时间仅为2-3d.Tsai等用ELISA检测奶酪和酸牛奶中的杂色曲霉、多主枝孢、白地霉、卷枝毛霉和产黄青霉，结果表明，根据霉菌的不同，检测灵敏度在1ng1g/ml，可以在2d内即这些霉菌在产品中形成肉眼可见菌落前，将其检出。 1.2.2检测食品中的毒素目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种以上,常见的产毒性真菌有曲霉菌属、青霉菌属、镰刀菌属等,其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒素、超曲霉毒素等。 南京市卫生防疫站的熊剑鹃2,利用免疫吸附方法测定酱油中黄曲霉毒素B1,过去酱油的AFTB1测定多以限量法,指标仅限于小于、等于5g/kg,老法对于超过5g/kg的样品,需作确证试验,手续更为繁杂,且不能准确定量,这与检出方法的灵敏度低不无关系。 按ELISA法可大大提高样品阳性检出率,在扫描仪上可直接测出数据,这对于酱油系列产品的厂家质量控制以及卫生机构的质量监测提供了快捷的方法,使进一步修改酱油的AFTB1限量标准成为可能。 目前,市场上出现了在食品中渗入罂粟壳等毒品,危害人民身体健康,而现有方法如比色法、极谱法、色谱法和免疫分析法无法有效监测样品,而酶联免疫测定方法灵敏度高,特异性强,操作方便,能快速监测。 宁波奉化市疾病预防控制中心的3利用酶联免疫测定法测定,进行了灵敏度、精密度和回收率研宋家铨、王新华究,最低检出限为0.11ng/mL;若采用样品稀释法排除干扰,稀释50倍可排除共存物干扰,按稀释50倍计算,最小检出浓度510ng/ml,具有十分明显的社会和经济效益.1.2.3.检测食品中农药的残留量近年来,各国对氯霉素残留量的最大允许限量(MRL)4日趋苛刻,如:欧盟1g/kg,美国和加拿大013g/kg,日本50g/kg,使原有的方法灵敏度不够,已不能适应于当前的检测要求。 盐城出入境检验检疫局的王太全等人5,研究了应用酶联免疫反应方法(ELISA),检测进出境肠衣中氯霉素残留量和运用德国的R-Biopharm公司的氯霉素残留测定试剂盒测定氯霉素残留量,氯霉素检测下量达到0.1g/kg。 克百威(Carbfuran,2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)商品名呋喃丹,是氨基甲酸酯类杀虫剂的主要品种之一,对人富有很高的毒性，在美国已将其作为饮用水的检测指标之一,规定其最大残留量为0.04mg/L。 因此,浙江大学的朱国念等6研究了直接竞争ELISA试剂盒来检测克百威,结果表明:研制的试剂盒最低检测限为0101mg/L线性检测范围为0.0110mg/L,供试样品检测结果的批内、批间、整体变异系数均低于8%,回收率均高于90%,符合农药残留分析要求。 试剂盒在4或-20下至少可保存6个月。 用ELISA试剂盒检测杀虫剂克百威残留较常规的仪器分析具有操作简便、灵敏度高、特异性强、快速等特点,并能批量地分析样品,值得在安全食品的生产与环境污染监测中推广应用。 1.2.4检测食品中的其它成分食品中常含有一些生理活性物质，由于食品成分十分复杂，研究人员一直在寻找快速、准确的检测出这些活性物质的方法。 乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，7应用ELISA检测牛初乳中乳铁蛋白的含量，最小具有多种生理活性。 张英华等检出量为0.5ng/ml，与通常采用的电泳法和免疫扩散法相比，具有快速、准确，可同时检查几十个甚至几百个样品的优点。 免疫球蛋白(Immunoglobulin,简称Ig)指具有抗体活性、能与相应抗原发生特异结合的球蛋白,是构成体液免疫的重要的物质。 牛乳中特别是初乳中免疫球蛋白的含量相当高,最近开发的免疫奶,就是通过对乳牛进行免疫注射从而提高牛奶中的免疫球蛋白的含量;再有市场中强化免疫球蛋白的奶粉、口服液等。 因免疫球蛋白也是一种蛋白质,具有蛋白质的共性,但其在上述制品中含量又相对的少,常规的蛋白测定法无法测出免疫球蛋白的含量。 用ELISA即可成功解决这个问题,且同时可完成含量与活性8。 同时ELISA技术还可应用于食品中其它成分的测定,如抗营养素因的检测子如大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子10;食品加工过程中的酶的含量的变化9;食品营养成分如牛初乳中乳铁11;检测某些特定的蛋白含量等转基因表达蛋白,以分析食品是否转基因生物或者含有转基因成分。 1.3应用前景基因工程和蛋白质工程的发展,为生物酶标分析技术提供了新的技术思路和模式,弥补了其在实际应用中存在的一些缺陷和技术局限性,使其具有更为广泛的检测范围、更高灵敏度与特异性和更精确的定量能力,从而使ELISA技术以新的姿态出现在食品监测领域中。 总之,随着科学技术的发展,检测技术日新月异,ELISA技术比传统的检测技术具有灵敏度高、特异性好、快速、方法操作简单、样品处理量大、适用范围宽、检测费用低、易商品化等优点,因此可以肯定,ELISA在食品领域必将得到广泛的应用。 2聚合酶链式反应（PCR）PCR(Polymerase ChainReaction)即聚合酶链式反应,是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法,也称为无细胞克隆系统。 它可以在试管中建立反应,数小时后能将极其微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍,乃至千百万倍,并且无须通过烦琐费时的基因克隆程序,便可以12。 随着人们对食品安全性要求的不断提高,获得足够数量的精确的DNA拷贝PCR技术以其特异性强、灵敏度高和快速准确等优点在食品检测领域得以广泛的应用。 2.1PCR的技术原理根据已知的持扩增的DNA片段序列,人工合成与该DNA两条链末端互补的两段寡核苷酸引物,在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增,这种方法也就是PCR技术。 扩增过程由高温变性、低温退火和适温延伸等3步反应作为一个周期,反复循环,从而达到迅速扩增特异性DNA的目的。 高温变性是在体外将含有需扩增目的基因的模板双链DNA经高温处理,分解成单链模板,低温退火降低反应系统温度,使人工合成的寡聚核苷酸引物与目的DNA互补结合,形成部分双链,适温延伸是将反应循环系统的温度调至适温,在TaqD2NA聚合酶的作用下,有4种核苷酸存在时,引物链将沿着53方向延伸,形成与模板互补的新链,新链又可作为下一次反应的模板,如此周而复始使目的基因的数量呈几何级数扩增。 通常单一拷贝的基因经2530个循环可扩增100万200万倍13。 PCR技术检测的主要步骤为:运用化学手段对目标DNA提取;设计并合成引物,引物设计与合成的好坏直接决定PCR扩增的成效,通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域,长度为1530个碱基为宜;进行PCR扩增;克隆并筛选鉴定PCR产物,将扩增产物进行电泳、染色,在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带,根据该带的不同即可鉴定不同的DNA;DNA序列分析14。 不同的对象如扩增DNA片断序列全知、半知或,其PCR参数、退火温度、时间、引物等都有较大的差别,将RFL P、Sequence、反转录PCR等技术相结合,形成了众多的衍生技术,如多重PCR,定量PCR,竞争PCR单链构型多态性PCR,巢式PCR等15。 这些技术的产生将使PCR技术在食品中的应用潜力更加广泛。 2.2PCR技术在检测食品中的应用2.2.1食品中病原菌的检测目前可根据病原菌特定的遗传因子，通过PCR可将食品中的病原菌检出，从而避免食物中毒的发生。 肠出血性大肠杆菌16是引起出血性大肠炎、溶血性尿毒症的一类大肠菌，由于其携带有Vero毒素遗传因子，通过PCR，即使反应物中只有10个菌存在也可将其迅速检出。 几乎所有的沙门氏菌17都具有侵入性相关遗传因子irvA，以此遗传因子设计引物，就可以高灵敏度地检出沙门氏菌.此外还能能快速、特异地从肉食品样品中检测出肉毒梭状芽孢杆菌和能引起人类食物中毒的金黄色葡萄球菌还有动物性食品中的李斯特杆菌等18。 近年来,用PCR技术检测沙门氏菌得到了迅速发展,产生了许多种PCR法。 如常规PCR、套式PCR、多重PCR。 也可几种方法结合使用,具有快速和灵敏度高的特点。 除上述几种食品致病菌外,PCR技术还可用于顽固性梭状芽孢杆菌、葡萄球菌肠毒素等的检测,且同样具有较高的特异性、敏感性。 2.2.2食品中腐败菌的检测腐败菌是食品加工中的一大危害，特别是在发酵工业中腐败菌将造成整批产品变质，如能在早期发现腐败菌，人们将能及时采取控制措施，从而保证产品质量，减少损失。 利用微生物生理生化特性鉴别微生物的传统方法在实际应用中已遇到越来越多的问题，例如利用葡萄糖苷酸酶活性鉴别大肠杆菌是目前美国和日本等国采用的标准方法，但已经发现几种大肠杆菌菌株因基因突变而产生假阴性结果，而样品中另外一些微生物则因含有该酶活性，又会出现假阳性结果，因此人们开始利用PCR来解决此类问题。 糖化酵母是一种主要的啤酒腐败菌，由于其与酿酒酵母有相似的生理特征，因此很难将它们区分开来。 根据两者糖化酶基因的不同，设计了检测糖化酵母的正向引物SD-5A和SD-5B反向引物，所需检测时间仅为5h，即使100ml啤酒中只有一个糖化酵母细胞也能被检出。 嗜啤酒梳状菌和福瑞森加梳状易造成啤酒的严重腐败，根据两株菌16SrRNA和23SrRNA基因间的间隔区的特异性序列分别设计引物，经PCR后检测，不仅可以将这两株菌同其他细菌区分开来，而且还可以将这两株菌区分开。 2.2.3食品成分的检测要检测出肉制品中肉的组成比较困难，Beneke等对热处理后的熟肉样品，经PCR后检测，发现牛肉、猪肉、鸡肉和火鸡肉的最小检测量为1%2%，且肉制品中的抗坏血酸添加剂不影响检测结果，并指出，在目前，PCR是区分鸡肉和火鸡肉的唯一方法。 随着基因工程的发展，出现了越来越多的遗传工程体，为了检测这些遗传工程体的食品是否符合标准，Huebner等发现定量竞争性PCR能很灵敏的检测出来至遗传工程体的食品，并能可靠的检测出官方所规定的食品中遗传工程体的极限。 2.2.4PCR技术在食品转基因成分检测中的应用PCR技术在食品转基因成分检测中的应用随着现代分子生物学技术的飞速发展,转基因食品日益走进我们的生活。 但是随着转基因食品逐渐走上人们餐桌的同时,其安全性也日益受到普遍关注。 这是由于转基因食品中通常会有新的遗传物质(NDA)和蛋白质,而这些物质在传统的食品中或许不存在19。 因此,为了保障人类的身体健康,消除消费者顾虑,有利于国际贸易和商品流通,建立快速、简便、准确的转基因检测方法非常必要。 目前,转基因食品的检测方法主要有三种:核酸检测法、蛋白质检测法、酶活性检测法。 每个方法都有各自的特点和不足,而PCR仍然是最常用以及最适用的检测转基因食品的方法。 这是由于PCR法不同于蛋白质法和酶法,后两者一般不能用于加工后产品的检测,因为蛋白质已变性,而PCR法则不受此限制.已有文献报道20在借鉴几种传统定量PCR方法的基础上,建立了一种新的实时荧光定量PCR法对转基因产品进行检测。 该法有效地解决了传统定量方法所存在的假阳性及准确度不高的难题。 2.3.PCR技术在食品检测领域的应用展望PCR技术在食品检测的实际应用中表现出灵敏度高、速度快、特异性强、简便、高效等特点。 为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持。 但是,PCR技术在实际应用中也表现出一些缺陷,例如容易出现假阳性、假阴性、产物容易突变、不能检测致毒微生物产生的毒素等。 随着生物技术的飞速发展和各项新技术与PCR技术的有机结合,以及今后专门针对如何控制外源DNA的污染、如何控制突变和如何利用PCR技术鉴别致毒微生物产生的毒素等方面的深入研究,必将为PCR技术在食品检测领域更加广泛的应用提供新的思路。 3生物传感器生物传感器的研究始于20世纪60年代初期。 是选用选择性良好的生物材料(如酶、DNA、抗原等)作为分子识别元件,当待测物与分子识别元件特异性结合后,所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等并予以放大输出,从而得到相应的检测结果的一套装置。 是一种新兴的生物技术产品，在分析领域中具有极大的潜力和应用前景。 在食品工业生产中，各种营养成分、农药残留、重金属毒性等都能够通过生物传感器快速、准确的测定。 生物传感器由于具有较好的敏感性、特异性,操作简便、反应速度快等优势,正逐步21。 挑战传统检测方法的主体地位3.1生物传感器的原理生物传感器主要由生物识别元件和信号转换器两大部分组成。 生物识别元件又称感受器，由具有分子识别能力的生物活性物质（如酶、微生物、动植物组织切片）构成。 信号转换器（如热敏电阻、光纤等）是一个电化学、光学或热敏检测元件。 当生物识别元件与待测物发生特异作用后，所得产物（或光、热等）通过信号转换器转变成可以输出的电信号、光信号等，从而到分析检测的目的。 它的整个传感原理如图1所示生物传感器有优异的选择性和较高的灵敏度，有可能不用试剂，在组分复杂的试样中快速和连续测定被分析物。 因而在生物过程、食品工业等领域有广阔的应用前景。 3.2生物传感器的应用3.2.1畜产品新鲜度的测定肉制品在贮存过程中，随时间的延长，细菌增殖，致使蛋白质分解成尸胺、腐胺。 当这些胺达到检测限度时，肉食品的细菌总数已达107个/g，这正好是肉品鲜度的指标，用酶传感器进行检测，已证明最为简便有效。 畜肉产品在后熟过程中，由僵硬状变软，因酶的作用而生成氨基酸、肽等呈味成分。 此时肉味最佳，然而后熟程序的判断仅靠专家评价则是不科学的手段，人为的影响因素很多。 现已发现动物肉品成熟的生物化学变化，如牛肉，将其放在2条件下贮藏，第3d起ATP、ADP、AMP均未检出，但呈味成分IMP，随着贮藏日数增加而减少，黄嘌呤、次黄嘌呤则呈直线增加。 因此，IMP、黄嘌呤、次黄嘌呤则为畜肉后熟程度的化学指标，也可作为肉品鲜度的指标，而这些指标的检测，采用多功能酶传感器已获得成功，该方法样品量少，分析时间短，再现性好。 酶胺也是肉鲜度的特异性指标，测定酪胺的酶传感器，在50200m范围内，含量范围与肉鲜度呈线性关系，该传感器包括一个单胺氧化酶、一胶原膜和一个氧电极，电极的响应时间45min。 3.2.2食品农药和抗生素残留量的分析随着科学的发展，不断有新的农药和抗生素用于农业生产。 它们在给人类带来富足的同时，也给人类健康带来了危害。 所以对农药和抗生素残留量的测定，对食品安全有着重要的意义。 目前，测定农药残留量常用的方法是色谱法、色谱-质谱联用法以及波谱法，由于这些方法所需仪器复杂、价格昂贵、耗时久，而且有些农药具有热不稳定性、挥发性，要用液相色谱或毛细管电泳才能测定，因此它们都难以满足现场快速检测分析的需要。 生物传感器的出现为此问题提供了一条可能的解决途径。 根据一些化合物能抑制特定的酶活性这一性质，近年来已经开发设计出一些电化学生物传感器，应用于农药测定。 例如，对于有机磷农药和氨基甲酸脂类农药的检测，目前已经开发了一系列基于胆碱酯酶电化学生物传22。 其基本原理乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化下可以分解为乙酸和胆感器碱CH3COO（CH2）2N+（CH3）3Cl-+H2O AchECH3OOH+HO（CH2）2N+（CH3）3Cl-在水溶液中，乙酸电离，从而使溶液的pH值发生变化CH3COOH CH3COO-+H+有机磷农药或氨基甲酸酯类农药可以有效的结合到乙酰胆碱酯酶的活性位点上，抑制酶的活性，减少pH值的变化。 通过检测这种微小的变化，便可以测得溶液中的有机磷农药的含量。 此种快速检测手段目前发展很快，不过其检测灵敏度在很大程度上受到胆碱酯酶类型和的影响。 而且，高含量重金属离子、无机阴离子及一些有机物对传感器的响应有一定的干扰。 伴随着生物技术的不断进步，利用基因工程技术，人们已经成功制备和分离了能够特异性分解有机磷农药的有机磷水解酶。 在此酶的作用下，有机磷农药可以发生如下反应O XOPHR-P-Z+H2ORPOH+ZHRR其中X表示O或S，R代表烷氧基（C1C4），R为烷氧基苯基，Z表示苯氧基。 此反应的产物可进一步电离出H+，从而可以利用对H+敏感的检测器得到相应的输出信号。 它相对于传统的基于胆碱酯酶的生物传感器的优势有如下3点选择性好，只对有机磷农药有响应，因此能有效的区分有机磷农药与氨基甲酸酯类农药；传感器探头的再生过程简单，再生周期也大为缩短；检测过程中不需要加入其他辅助试剂。 Mulchandani等研制的一系列基于此酶的生物传感器，包括电位型、电流型及光纤型生物传感器，在食品农药残留量检测中具有良好的检测效果。 3.2.3食品中重金属含量的测定由于铅、汞等重金属离子可以在生物体体内不断的沉积和富集，它们的污染对食品的品质和人类的健康都造成了极大的威胁。 检测重金属离子的生物传感器主要基于重金属离子可以造成氧化酶和脱氢酶失活的原理，因此，如果选择合适的酶并将其固定于亲和性膜上，结合Clark氧电极，通过计算氧的消耗速率就可以推知重金属的污染程度。 Hipert和Reinhold以谷光甘肽作为水溶液中检测重金属离子的生物传感器的生物识别元件。 这些肽/蛋白通过硫醇盐选择性地与重金属连接。 如果生物识别元件被固定在合适的信号转换器表面，由连接金属离子影响而在固定化肽/蛋白层中产生的变化，可被转换器转换成电信号。 3.2.4含糖量的测定现在测葡萄糖（G）的生物传感器23已广泛应用于医疗、食品及发酵工业中，在食品工业中，生物传感器不仅能测定食品及原料的含糖量，更重要的是能对多种食品工业过程进行监测。 生物传感器对食品中的果糖、蔗糖、麦芽糖等有较好的测定效果。 3.3发展前景生物传感器作为一门实用性很强的高新技术，之所以备受人们的青睐，主要是在各个现代科学和技术领域里它有潜在的应用前景24。 但迄今为止，除少数的生物传感器应用于实际测定外，生物传感器还存在着急需解决的问题，如一些生物识别元件长期稳定性、可靠性、一致性等方面还不理想，批量生产尚待建立，多数仍处于研究阶段。 然而，作为一门新技术，它有着极强的生命力，随着科技的发展生物传感器在各个方面将会占据主导地位25。 4.生物芯片技术生物芯片(biochip)是上世纪90年代初发展起来的一种全新的微量分析技术是采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。 由于常用玻片/硅片作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。 它综合了分子生物学、免疫学、微电子学、微机械学、化学、物理、计算机等多项技术,通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有很高的应用价值,具有高通量、微型化、自动化和信息化的特点,在食品微生物领域、食品毒理学、营养学、转基因产品检测中均有应用。 在转基因食品检测中也有着广泛的发展前景26。 根据不同的领域和用途现已研发了多种生物芯片，如基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等。 基因芯片已成为生物芯片中最重要的一类。 4.1生物芯片技术在食品卫生检测中的应用2730随着经济全球化的发展,食品卫生检验与动植物检疫技术已成为WTO贸易技术壁垒(TBT)。 食品的安全性问题已制约了我国农产品的出口创汇能力以及加入WTO后的国际竞争力。 生物芯片技术可以对食品安全状态有一个快速的、科学的、量化的了解,找出食源性疾病的阈值;同时建立进出口食品监督管理的预警和快速反应系统。 DNA芯片在微生物重要基因(毒力基因、抗药基因、致病因子)筛选监测、直接分析细菌基因组进行菌种鉴定与流行病学研究及基因表达中得到了广泛的应用。 同时,DNA芯片对水、食品中所含微生物的种类及有无致病性的检测和鉴定也将发挥重要作用。 生物芯片将会成为食品卫生监督和商品检验检疫中的重要工具。 根据检验内容和对象的不同,检验检疫基因芯片可分成4种:食品卫生检验芯片(病原体、激素、农药残留、真伪)、植物检疫芯片、动物检疫芯片、转基因作物检疫芯片。 采用生物芯片技术,可以最快速、最大量、最高效地对病原体、转基因产品以及中药质地(农药、重金属含量,产地真伪等)进行检测。 4.1.1水中致病菌检测与鉴定水中可能存在多种致病菌,及时准确地检测出这些致病细菌对保障人民健康具有重要意义。 传统的微生物检测方法一般都涉及细菌的培养、形态及生理生化特性的分析等步骤。 长期的实践证明,这些方法是比较有效的,而且检测的特异性与准确性也较高。 但尚存在不少问题,例如检测成本高、速度慢、操作烦琐,而且有些细菌生长速度很慢,难以检测。 分子生物学和免疫学技术如探针杂交、PCR技术等也在致病菌检测中得到广泛应用,使检测效率大大提高,但缺点是:一次实验往往只能针对一种或少数几种细菌,而存在的致病菌种类可能很多,涉及众多属、种和型别,故不能满足同时快速检测多种细菌的需要。 近十年来,基因芯片技术迅速崛起,已在很多领域广泛应用,也为开展快速检测致病菌提供了崭新的技术手段。 基因芯片检测技术体现出了高通量、高效率的优势。 一张芯片一次可以对水中可能存在的常见致病菌进行全面、系统的检测与鉴定,且操作简便、快速,对于一个菌落,可以在4h之内完成菌种判定。 4.1.2.食品中大肠杆菌检测与鉴定Joon MyongSong (2000)等研究了以抗体固定化毛细管反应器和酶联免疫反应剂阵列为基础的缩微生物芯片系统对于大肠杆菌O157:H7的检测。 广泛存在环境中的细菌与人类有着密切的关系。 在适当的温度和湿度条件下,细菌能够通过水和食物迅速的传播。 据报道,在人体内外共存在150多种的细菌。 许多传染性疾病例如肺炎、霍乱等等都是因对人类致命的病原菌引起的。 在每年估计的5000万死亡人数中几乎40%源于传染病,这个事实清楚表明致病菌的危害极大。 重要的污染食物和引用水的致病菌的数量一直不断增加。 大肠杆菌O157:H7是一种典型的存在于食物中的致病菌,它能够在小肠中产生大量的强有力的毒素,并能导致出血性大肠炎或者溶血性尿毒症的并发症,都会导致死亡,尤其是对儿童。 大肠杆菌O157:H7的传染量据估计低到10个细胞,免疫学方法是鉴定存在于食物中特殊种类致病菌的最有效的方法之一。 特定细菌的选择性鉴定是非常重要的,因为大多数情况下,少量的致病菌于大量的非致病菌在复杂的生物环境下是共同存在的。 虽然用于目标基因纯化的PCR技术提供了显示了高灵敏度和高选择性,但是从致病菌中得到目标基因却是一个耗时的过程。 另一方面,免疫学方法在对致病菌的鉴定过程中与整个细胞检测的核酸分析比起来快的多。 以抗体固定化毛细管反应器和酶联免疫反应剂阵列为基础的缩微生物芯片系统能对大肠杆菌O157:H7进行多元化的检测。 对于毛细管反应器阵列采用单侧激光照射能大大改善生物芯片系统的视觉结构,使用ELISA和Cy5荧光标记的免疫阵列,大肠杆菌O157:H7的最低检测限分别为3和230个细胞单位。 该系统具备同时监测多功能免疫阵列和高灵敏性检测大肠杆菌O157:H7的能力。 4.2在食品毒理学研究中的应用传统的食品毒理学研究必须通过动物实验模式来进行模糊评判,它们在研究毒物的整体毒性效应和毒物代谢方面具有不可替代的作用。 但是,这不仅需要消耗大量的动物,而且往往费时费力。 另外,所用的动物模型由于种属差异,得出的结果往往并不适宜外推至人,而且动物实验中所给予的毒物剂量远远大于人的暴露水平,并不能反映真实的暴露情况。 所以,传统的动物实验仅仅是一种粗糙的、不精确的方法。 Agshari等 (1999)报道生物芯片技术的应用将在毒理学领域带来一场革命。 生物芯片可以同时对几千个基因的表达进行分析,为研究新型食品资源对人体免疫系统影响机理提供完整的技术资料。 并通过对单个或多个混合体有害成分进行分析,确定该化学物质在低剂量条件下的毒性,并且分析推断出该物质的最低限量。 最近,美国环境卫生科学研究所(NIEHS,Na2tion