（医学课件）造血干细胞

造血干细胞 HemapoieticStemCell TotipotentHematopoieticStemCellPluripotentHematopoieticStemCell 1 一 血细胞起源的传统观点二 多能造血干细胞的发现三 多能造血干细胞的基本特性四 造血干细胞的组成五 造血祖细胞的增殖与分化六 各种造血祖细胞的增殖与分化七 造血干细胞 多能造血干细胞 的形态八 多能造血干细胞的来源九 造血干细胞研究的医学意义 2 一 血细胞起源的传统观点长期以来有一元论 二元论 三元论和多元论学派之争 目前的观点 3 1 Maximow和Bloom等的一元论学派原始网状细胞原血细胞 在不同的局部环境条件下再分化为各种血细胞 在骨髓分化发育为红细胞 粒细胞和巨核细胞 在淋巴器官发育为单核细胞和淋巴细胞 还认为原血细胞和原淋巴细胞 大淋巴细胞是同等细胞 网状细胞 原血细胞骨髓淋巴器官 红系粒系巨核细胞系单核细胞系淋巴细胞系 4 网状细胞成髓细胞原淋巴细胞红系粒系巨核细胞系单核细胞系淋巴细胞系 2 Naegi和Ehrich为代表的二元论学派网状细胞先分化为两种不同的原始细胞 一类称为成髓细胞 Myeoblast 增殖分化为红细胞系 粒细胞系 巨核细胞系和单核细胞系 分化为骨髓成份 另一类是原淋巴细胞 Lymphoblast 增殖分化为淋巴细胞系和单核细胞系 5 网状细胞原粒细胞原红细胞原淋巴细胞粒系巨核系单核系红系单核细胞系淋巴细胞系 3 Schilling为代表的三元论学派网状细胞先分化为三类不同原始血细胞 原粒细胞增殖分化为粒 巨核和单核细胞系 原淋巴细胞增殖分化为淋巴细胞和单核细胞系 原红细胞 Erythroblast 增生分化为红细胞 6 4 Sabin为代表的多元论学派各细胞系分别由各自的原始细胞在不同的部位生成 红细胞系由血窦内皮分化来的成红细胞发育而成 结论 尽管各学派观点有所不同 但都主张网状细胞或网状细胞和血窦内皮分化成原血细胞 即网状细胞是各种血细胞的始祖 7 5 目前的研究认为 一元论的观点基本正确主要不同点 多能造血干细胞不是过去认为的网状细胞 实验依据如下 网状细胞对射线照射不敏感 当用射线照射动物杀伤各种血细胞后 骨髓中的网状细胞仍存留 给照射后动物注射氚胸腺密啶核苷 3H TdR 3H TdR可掺入到网状细胞中 且维持很长时间 说明该细胞增殖不活跃 其他任何造血细胞均无标记现象 结论 网状细胞不作为造血干细胞直接产生血细胞 但它参与构成造血诱导微环境 对血细胞的增殖和分化有重要影响 8 二 多能造血干细胞的发现1 多能造血干细胞存在的事实Till和McCulloch1961年 首先证明了多能 造血 干细胞 MultipotentialStemCell MSC 的存在 他们在给受致死剂量60Co照射小鼠输入同种小鼠骨髓细胞 8 11天后 可见在受体小鼠的脾表面出现了肉眼可见的结节 称脾集落 SpleenColony 当时并不知道每个脾集落是起源一个多能造血干细胞 因此笼统地把它称为脾集落形成单位 ColonyFormingUnit Spleen CFU S 9 10 11 数骨髓细胞数 组织切片 光镜下观察 证实脾集落可以由红系 粒系或巨核细胞系 或其中的二者或三者混合组成 将单一细胞集落的细胞再输入另一只经60Co照射后的小鼠 仍可同样得到上述类型的脾集落 研究证明 脾集落的生成数与移植的骨髓有核细胞数之间呈线形关系 给小鼠输入带有标记的骨髓细胞 12 2 人造血细胞中存在多能造血干细胞白血病患者的骨髓细胞染色体分析提供了间接依据 Nowell等发现 80 90 的慢性粒细胞白血病 CML 患者的骨髓细胞中可出现一个异常的小染色体 以后人们证明它是第22对染色体长臂短缺后的剩余部分 称Ph1染色体 观察中发现慢性粒细胞白血病患者的红细胞系 粒细胞系和巨核细胞系均具有Ph1畸形染色体 推测 这三系细胞有共同的来源 它们前身细胞染色体的改变 导致它增殖分化后的所有血细胞都具有该标志染色体 13 阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者的研究中发现 细胞缺陷不仅存在于红细胞 也存在于粒细胞和血小板 证明了三种血细胞有着共同的来源 Martin 1980 在CML患者中发现 细胞和其它骨髓系的细胞一样 也具有同样的Ph1染色体 Moore 1979 在 例CML急性发作的患者中发现 前 细胞表型的白细胞 上述情况也证明 这两种疾病的发生也都是由于多能造血干细胞异常所致 14 人骨髓细胞体外长期培养的成功与混合性集落的发现为人类多能造血干细胞的存在提供了直接的依据 Prohal 1978 从铁幼粒细胞性贫血病人中发现了具有 细胞 髓系造血干细胞 巨噬细胞都含有相同的葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 G 6 PD 同功酶 综上所述 可以推测人 小鼠和大鼠体内有着不同等级的 或具有不同分化潜能的造血干细胞群 结论 目前研究发现 机体的许多器官内均存在造血干细胞 但以胎肝最多 在成体则以骨髓最多 15 G 6 PD有A B型两种形式 所有白种人的G 6 PD为B型 黑种人的G 6 PD为A型 1 3黑人妇女是G 6 PD为杂合子 她们的体内 包括皮肤成纤维细胞 血细胞等所有的组织 都是G 6 PDA B型细胞的混合物 但对患CML 具有G 6 PD杂合子的黑人妇女G 6 PD同功酶的研究表明 其皮肤中成纤维细胞的G 6 PD表型仍然是A B混合型 但她们的红细胞 单核细胞 粒细胞 血小板和淋巴细胞仅含一种形式的同功酶 或是A型 或是B型 说明这些血细胞是来源于A型 或B型G 6 PD的同源细胞 即以上血细胞都起源于一个多能造血干细胞 16 三 多能造血干细胞的基本特性多能造血干细胞具有很强的增殖能力 3H TdR标记试验表明 正常机体中大部分多能造血干细胞处于静止状态 即 0期 大约10 的多能造血干细胞处于增殖状态 它们可以增生并向不同的方向分化 多能造血干细胞具有多向分化的潜在能力 它可生成大量形态上可识别的幼稚和成熟的血细胞 多能造血干细胞具有自我更新的能力 多能造血干细胞不仅能持续地补充各种血细胞 还能通过自我更新 Selfrenew 保持它的特性和恒定数量 17 脾集落组织学检查表明 红系细胞组成的脾集落占多数 占脾集落总数的35 76 粒系细胞组成的脾集落占11 35 巨核细胞组成的脾集落占0 24 三类细胞组成的混合性集落占6 30 另外 还可见一些低分化细胞集落 18 四 造血干细胞的组成造血干细胞不是单一的细胞群体 而是由不同发育等级 Hierarchy 的干细胞组成 Magli及Iscove 1982 以摄影定位方法进一步发现 第8天的脾集落在72小时内都会消失 第11天开始又重新形成新的脾集落 第11天的CFU S被称为CFU S1 第8天的CFU S则被称为CFU S2 19 Lord进一步推测 CFU S1是具有较强自我更新和多向分化能力的脾集落生成细胞 即目前认为的多能造血干细胞 CFU S2则是一类自我更新能力弱或是具有多向分化 但失去自我更新能力的脾集落生成细胞 即目前认为的多能造血祖细胞 用5 氟脲嘧啶 5 FU 或长春新碱等先杀死处于细胞周期的CFU S 发现余下的非周期或慢周期的CFU S比周期中的CFU S具有较强的自我更新能力 外周血的CFU S自我更新能力比骨髓的CFU S弱 有人认为 它们可能是被淘汰到外周血中的 老化的 CFU S 20 五 造血祖细胞的增殖与分化各细胞系虽都源于造血干细胞 但他们的发生 发育却是分别进行 分别调节 相互协调的 在造血细胞的发育 增殖和分化过程中 多能造血干细胞首先增殖分化为各系的造血祖细胞 progenitorcell 即各系的造血母细胞 也称定向干细胞 CommittedStemCell 造血祖细胞不同于多能造血干细胞之处是 它已有所分化 其特征是 失去多向分化的能力 不能发育为各种血细胞 而只能向一系或密切相关的两系细胞分化 如中性粒细胞与巨噬细胞 增殖潜能已不是 无限的 不能反复自我更新 只能更新数次 数量的恒定依靠多能造血干细胞的增殖来补充 具有对调节因子发生反应的 特殊结构 后者很可能是细胞表面受体 21 正常小鼠中 多能造血干细胞的增殖率较低 一般处于S期的多能造血干细胞少于10 绝大多数 90 处于静止状态 G0 期 若先用射线或细胞毒剂杀伤小鼠的幼稚细胞 在其造血恢复期则会有大量多能造血干细胞从静止状态转入增殖周期 增殖率可较正常对照者高25 50 以后 重新降低至正常水平 造血祖细胞的增殖率比较高 例如 红细胞系集落生成细胞 CFU E 处于增殖周期的细胞为70 75 中性粒细胞 巨噬细胞集落生成细胞 GM CFU 处于增殖周期的细胞为20 40 22 在人类 GM CFU中27 37 处于S期 即约有1 3的细胞处于增殖状态 关于多能干细胞从G0期转入S期的调节控制 目前尚不清楚 Byron在体外实验中发现 3种机制能启动静止的多能干细胞重新合成DNA 分别是 1肾上腺素能受体的刺激 胆碱能受体的刺激 类固醇物质刺激 粒细胞系定向干细胞与多能干细胞的差别之一正是缺乏 1肾上腺能受体 23 以往的概念认为 多能造血干细胞周围的造血基质细胞 网状细胞 并不分泌上述刺激物 多能造血干细胞与基质细胞间的接触性调节机制似乎是存在的 但是对于造血基质细胞及其调节的本质尚不清楚 目前认为 多能造血干细胞可重建永久性造血 而造血祖细胞只能重建非永久性造血 但是 在自我更新和分化方面 髓系造血祖细胞的与淋巴造血祖细胞不同 T细胞造血祖细胞在进入T细胞系之前仍保留自我更新能力 B细胞只是在浆细胞阶段才失去自我更新的能力 24 六 各种造血祖细胞的增殖与分化 1 粒系造血祖细胞1966年Bradiley和Metcalf首先创立了半固体琼脂培养基培养骨髓和血液白细胞的方法 加入集落刺激因子 colonystimulatingfactor CSF 骨髓细胞可在体外琼脂培养条件下生成主要由粒系 或单核 巨噬细胞 或两者混合组成的细胞团 粒细胞集落生成单位 colonyformingunitgranulocyte CFU G 单核 巨噬细胞集落生成单位 colonyformingunitmacrophage M CFU 或粒 单系集落生成单位 colonyformingunitgranulocyte macrophage GM CFU 以上这类细胞笼统地称为粒系祖细胞 25 目前的实验证明 粒细胞和单核细胞来自共同的造血祖细胞 数量 在正常人 骨髓中为20 150个 105有核细胞 末梢血中为1 10个 105有核细胞 研究表明 一日之内循环血中CFU GM数量呈时相性变化 上午9时处在高峰期 下午3时至夜间3时水平较低 其数量分别为一日平均值的150 和65 体育活动也能增加循环血中多能造血干细胞和祖细胞的数量 26 2 红系造血祖细胞20世纪70年代初 Stephesom Axelrad和Mcleod等用含红细胞生成素 erythropoietin EPO 的血浆凝块培养基 从小鼠胎肝或人骨髓培养出红细胞集落 称为红细胞集落生成单位 colonyforminguniterythroid CFU E 即红系祖细胞 CFU E是一种小而发育迅速的集落 内含8个 32个含血红蛋白的细胞 在小鼠 一般只需培养2天即可形成 在人则需培养7天方可形成 Cormack用显微摄影术证实 CFU E是一个可动的 有增殖能力的大细胞 它在EPO作用下分化为可识别的幼稚红细胞 并开始合成血红蛋白 27 Axelrad等随后进一步培养出另一种较CFU E更早期的红系造血祖细胞 他们或聚集在一起 或散在成许多小的细胞团 宛如爆炸开来 故命名爆炸裂样红细胞生成单位 burstformingunit erythroid BFU E BFU E的特性 集落很大 细胞总数可达1000个以上 其中大多数细胞含血红蛋白 发育较慢 小鼠需7 10天 人需两周时间培养才能形成 集落内的BFU E和CFU E在培养中具有不同的时间特性 不同的产率和对EPO不同的敏感性 BFU E需要较高浓度EPO的刺激才可产生大量的CFU E BFU E即存在于骨髓 也存在于外周血中 在某些严重贫血患者的外周血中BFU E数目可显著升高 小鼠的BFU E约为2个 105骨髓有核细胞 其沉降率为4 0mm 小时 28 CFU E的特性 在EPO作用下 CFU E可分化为很多形态可识别的幼稚红血细胞 CFU E似乎并不存在于正常的外周血中 CFU E约有325个 105骨髓有核细胞 CFU E的沉降率为5 6mm 小时 以上结果表明 BFU E和CFU E是红系造血祖细胞分化过程中不同阶段的细胞亚群 他们分别是早期红系祖细胞和晚期红系祖细胞在体外培养条件下生成的集落 29 3 红系和巨核系祖细胞有证据表明 骨髓中还存在一种能向红系和巨核系分化的祖细胞 BFU ME 这是一种两能祖细胞 巨核系祖细胞在含巨核细胞集落刺激因子 Megakaryocyte ColonyStimulatingFactor Meg CSF 的刺激下 在体外可以培养出小鼠和人的巨核细胞集落 成年小鼠骨髓中巨核祖细胞的数量为10个 20个 105骨髓有核细胞 30 4 淋巴系祖细胞淋巴细胞的体外半固体琼脂培养技术的进展尚不能令人满意 目前比较成功的是在体外可培养出正常人 细胞集落和正常小鼠 细胞集落 5 多向性祖细胞Johnson Fauser和祝氏等人用小鼠胎肝细胞 人骨髓细胞和小鼠骨髓细胞 在适当刺激因子的条件下 体外培养出两种或两种以上细胞系组成的混合性集落 CFU MIX 以上结果提示 有二能 三能 或四能造血祖细胞的存在 31 EpoGM CSFGM CSFGM CSFGM CSFIL 3IL 3G CSFM CSFIL 5IL 4Meg CSFTPO 原红细胞原巨核细胞原粒细胞原单核细胞原粒细胞原粒细胞原 细胞原 细胞 红细胞血小板中性粒细胞单核细胞嗜酸粒细胞嗜碱粒细胞 细胞 细胞 巨噬细胞肥大细胞浆细胞 BFU ECFU MegCFU GCFU MCFU EoCFU Bas 前 细胞前 细胞 CFU GEMM CFU MECFU GM 髓系干细胞淋巴系干细胞 CFU E 巨核细胞 抗原抗原 GM CSFGM CSFGM CSFGM CSFIL 3IL 3IL 3 IL 1 IL 6 IL 3IL 1 IL 6 GM CSF骨IL 1胸IL 1IL 2IL 3IL 6腺IL 6IL 7髓IL 7 造血干细胞 多能造血干细胞 GM CSFGM CSFGM CSFIL 3IL 3IL 3 IL 1IL 2IL 2IL 4IL 4IL 3IL 5IL 6 GM CSFGM CSFGM CSFGM CSFGM CSFIL 3IL 3IL 3G CSFM CSFIL 5IL 4Epo Epo GM CSFIL 3M CSF IL 4 32 七 造血干细胞 多能造血干细胞 的形态既然造血组织中肯定存在着造血干细胞 因此不少学者企图确定其形态特征 由于研究和观察方法不同 对其形态描述还不完全一致 淋巴细胞样单核细胞样其他 33 淋巴细胞样 一些早期工作认为 造血干细胞很象淋巴细胞 例如 给大剂量射线照射的小鼠输入同系正常骨髓细胞后 间隔地注射3H TdR 受体小鼠骨髓中有淋巴细胞被标记 恢复期中 继淋巴细胞的3H TdR标记高峰后 原红细胞等才逐渐达到正常 Yoffey等认为 正常成体骨髓中不存在特殊的造血干细胞 而由淋巴细胞 过渡细胞行使造血作用 提出淋巴细胞 过渡细胞部门 Lymphocyte transitionalcellcompartment 起造血干细胞作用的学说 淋巴细胞 过渡细胞部门在正常稳定状态下由80 90 小淋巴细胞和10 20 过渡细胞构成 其中过渡细胞 细胞核较大 染色质细 但是在体积大小 增殖能力 细胞质嗜碱程度上又有不同 故又分为两类 34 一类过渡细胞 体积大 细胞质嗜碱性强 3H TdR易于掺入 说明其增殖活跃 称为嗜碱性过渡细胞 另一类过渡细胞 形态与单核细胞相似 细胞质着色浅 3H TdR的标记率低 称为浅色过渡细胞 他们设想 浅色过渡细胞是一种能自我复制更新 自我保存的细胞 同时它又可演化成为嗜碱性过渡细胞 即各种原始血细胞的前身细胞 35 单核样细胞 monocytoidcell 一些学者认为 造血干细胞是单核样细胞 Tylen和Everett等人将联体动物之一 或遮一后肢的动物进行全身致死量照射 再用同位素标记联体动物或遮蔽后肢动物的骨髓细胞 观察在造血重建过程中的细胞形态 结果发现 未经照射的后肢动物或联体动物所提供的主要细胞是单核样细胞 这种细胞的细胞核直径8 10 m 位于细胞中央 形态不太规则 有褶叠和凹陷 染色质颗粒细小疏松 细胞质丰富 略嗜碱性 36 虽然也有人把这类细胞归为淋巴样细胞 但Lglen等人认为它们的形态和功能都与大 中淋巴细胞不同 应称作单核样细胞 照射的联体大白鼠血液中首先出现的这种单核样细胞 照射后第 天约占有核血细胞的50 9 并在骨髓增生成为红细胞系和粒细胞系 与此同时 单核样细胞经血循环进入胸腺 增生分化为胸腺淋巴细胞 37 近年来 科家们采用了新的方法和途径研究了造血干细胞的形态 Dicke等应用细胞分离技术浓集和分离造血干细胞 使其在骨髓细胞悬液中的比例提高到20 在此基础上 他们进一步在光镜和电镜下观察了小鼠 猴和人骨髓中可能性最大的造血干细胞 Candidatestemcell 38 光镜下 这种造血干细胞具有相似的形态 直经约8 m 细胞核较大 呈圆形或肾形 染色质细而均匀 染为亮紫色 细胞质淡蓝 不含颗粒 电镜下 这种造血干细胞的超微结构特点是 细胞体呈圆形或稍不规则形 直经7 10 m 细胞核呈圆形 一侧常带有缺痕 染色质细而分散 近核膜的周边部位稍密集 核仁明显 较大 1 2个 细胞质较少 呈一窄缘 含有丰富的游离核糖体 少量小线粒体和小泡 不含高尔基复合体 内质网 溶酶体及多泡体 没有或仅有极少的多聚核糖体 39 40 41 VanBekkum等借助密度梯度离心获得含约20 造血干细胞的骨髓细胞悬液 光镜和电镜观察 提出 多能造血干细胞大小 形态类似小淋巴细胞 细胞直径7 10 m 有少量细胞质 除游离核糖核体和少量线粒体外 无其它细胞器 过氧化物酶染色阴性 VanBekkum明确指出 多能造血干细胞结构不同于小淋巴细胞 主要是 大小变动范围较淋巴细胞大 细胞核大致呈圆性 但多不太规则 凹陷不如淋巴细胞的深 核染色质较小淋巴细胞的细小 分布弥散 未见小淋巴细胞常见的高尔基复合体 内质网和溶酶体 线粒体较小淋巴细胞的少 且小 含游离核糖体较小淋巴细胞的多 但极少有多聚核糖体 42 结论 上述工作确实使我们对造血干细胞的形态较过去有了深入的认识 然而 应该估计到技术操作 如浓集 分离 制片 对细胞形态的影响 造血干细胞的不均一性 以及观察的主观性等造成的误差 因此 造血干细胞的形态仍是一个有待深入研究和解决的课题 虽然不少学者作了颇有成效的探索 但对多能造血干细胞的形态结构至今尚不清楚 这是因为造血干细胞在骨髓和其它造血组织中数量很少 无法将它们分离出来作具体的研究 这也是阻碍造血研究进展的重要原因之一 43 八 多能造血干细胞的来源最早的造血干细胞起源于胚胎早期卵黄囊间充质所形成的血岛 当胚体建立血循环后 才能在胚肝内测出多能造血干细胞 若在发育早期摘除卵黄囊 虽然胚胎可进一步发育 但却不能形成血细胞 在胚胎发育时 多能造血干细胞是随血流迁移 播种 定居于各造血器官的 44 45 雌 雄两性鸡胚联体实验证明 胚胎早期胸腺淋巴细胞的染色体有半数与对方染色体相同 表明每个联体的胸腺淋巴细胞有半数来自对方 前体细胞是经血流迁入胸腺的 胚胎鼠和其它哺乳动物的实验也证明 卵黄囊造血干细胞是通过血液迁移到肝 脾和骨髓 在胚胎发育晚期 造血干细胞从肝向其它造血器官迁移 46 股骨或胫骨移植 第17天左右的胎鼠肝 脾已有旺盛的造血功能 而骨髓造血功能尚未出现 将这种雌性胎鼠的股骨或胫骨移植于成年雄性鼠皮下 周后取骨髓检查可见有旺盛造血 染色体分析显示全部细胞为雄性染色体型 结果证明 胚胎期骨髓造血并非从固有细胞分化产生 而是肝 脾等造血器官的造血干细胞经血流