第二节蛋白质结构与功能的关系.doc

3.2 蛋白质分子结构与功能的关系 了解蛋白质的三维结构是理解蛋白质如何行使其功能的基础。蛋白质功能总是跟蛋白质与其它分子相互作用相联系，被蛋白质可逆结合的其它分子称为配体。蛋白质配体相互作用的瞬时性质对生命至关重要，因为它允许生物体在内、外环境变化时，能迅速、可逆地作出反应。蛋白质上的配体结合部位与配体在大小、形状、电荷以及疏水或亲水性质等方面都是互补的。 3.2.1细胞色素的分子进化1、细胞色素C的一级结构的种属差异和分子进化从细菌到人，一切需氧的生物体内，都有细胞色素C的存在。细胞色素C是一个具有104112个氨基酸组成的多肽分子，是一种在需氧细胞的代谢中担任重要角色的蛋白质，在蛋白质一级结构的种属差异研究的蛋白质中占有最重要的地位。这是因为，细胞色素C分子的结构比较简单，大小合适，容易纯化结晶，结构测定也比较容易，因此，是研究分子进化的最好材料。现在已对不同种属来源的细胞色素C，从一级结构，三维结构以及功能等各方面进行了系统的研究。存在部位与作用：细胞色素C存在于细胞的线粒体中，是参加生物氧化的一种电子传递体，大约在十亿年前，生物进化到需要氧的阶段，即出现了生物氧化过程，于是就产生了细胞色素C，因此，细胞色素C是生物界广泛存在的一种古老的蛋白质。细胞色素的残基数：脊椎动物的细胞色素C由104个氨基酸残基组成。少数103个，昆虫108个氨基酸残基，植物111114个残基，一般为112个氨基酸残基。不同生物与人的CytC的AA差异数目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、猪、羊、狗 11马 12鸡、火鸡 13响尾蛇 14海龟 15金枪鱼 21角饺 23小蝇 25蛾 31小麦 35粗早链孢霉 43酵母 44以人的细胞色素C为标准进行比较，发现人与黑猩猩的细胞色素C的一级结构完全相同，与恒河猴只相差一个残基，与马相差12个残基。从细胞色素C的一级结构中的氨基酸残基的改变数的多少可以看出，生物从原核到真核，从单细胞生物到多细胞生物，从低等生物到高等生物的进化规律，反映了种属之间的亲缘关系。 2细胞色素C三级结构活性部位的保守性同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质，指由共同的祖先蛋白分子经过变异和自然选择而产生的功能上相同、相关并在结构上有某种程度相似性的不同蛋白质。在进化过程中一级结构始终保持不变的氨基酸残基称为守恒氨基酸残基，在不同物种的细胞色素C一级结构中，则有35个位置的氨基酸残基是完全不变的，因此叫做不变残基或叫做守恒残基，这些守恒残基分散在多肽链的各个部位，在分子进化过程中，细胞色素C的一级结构虽然有很大的变化，但三级结构基本上保持不变。三维结构的关键部位是守恒的，尤其是活性部位的氨基酸残基及其三维排布，均不会发生改变。这是蛋白质发挥其生物功能的基本条件。蛋白质分子的三维结构不能因为变异而受到严重影响。由于分子内部的氨基酸残基通常对维系三维结构比较重要，因此，变异较多地发生在蛋白质分子表面上。血红素是细胞色素C分子的电子传递中心，在生物进化过程中保持不变。其它不变的氨基酸残基有的是为了保证血红素在蛋白质分子中正确的立体位置，保持多肽的构象形成一个疏水性的狭缝，狭缝的结构严格地决定着整个细胞色素C分子的三维结构，不同物种的细胞色素C的狭缝区域，其疏水性残基一般是保守的，或者是可以保守性取代的残基，脯氨酸在拐角处，甘氨酸没有侧链，体积小，也在拐角处。保守性取代：指化学性质相似的氨基酸残基之间有相互置换的现象，例如：Leu 与Ile、 Phe 与Tyr、 Asp与Glu之间都能互相替换。Rossman等人研究了各种蛋白质结构与功能的相似性之后指出，在生物进化的过程中，蛋白质的二级结构、超二级结构以及三级结构存在很大的保守性，同源蛋白质的一级结构允许有种属差异，但生物功能所要求的特定构象不能改变。不同生物的细胞色素C的氨基酸组成是有一些置换，但它们的生理功能却是相同的。3系统树：根据蛋白质中氨基酸残基的变化情况与古生物学测定生物进化年代相比较，可以发现各种蛋白质分子进化都有其本身的进化速率，称为单位进化周期。单位进化周期是指蛋白质在进化过程中每一个残基上的变异所需时间。据此分析出细胞色素C的单位进化周期是2640万年，不同蛋白质的单位进化周期是不同的，血红蛋白仅为580万年。图3-34 生物进化的系统树 系统树是用计算机分析细胞色素C序列并找出连接分支的最小残基数的方法构建起来的，用其它计算机方法可推断出系统树分支点处的潜在祖先序列。根据系统树不仅可以研究从单细胞生物到多细胞生物的生物进化过程，还可以粗略估计现存的各类物种的分支时间 (图3-34) 。 3.2.2 肌红蛋白的结构与功能 3.2.2.1 肌红蛋白的分子结构 肌红蛋白(myoglobin)存在于肌肉中，能贮藏O2，供生物氧化之用。抹香鲸肌红蛋白是第一个经X-射线晶体衍射测定出精确三维结构的球蛋白，它的分子包括一条153个氨基酸残基组成的多肽链和一个血红素，其多肽链的氨基酸序列。图3-35肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白多肽链中的残基7580处于-螺旋中，其余为无规卷曲，整个肽链有8个长短不一的螺旋段，即A.B.C.D.E.F.G.H，在侧链基团相互作用下盘曲形成4.3nm3.5nm2.3nm扁园的球体。绝大多数亲水残基分布在分子表面，使肌红蛋白可溶于水；疏水残基则埋藏于分子内部，血红素结合于E与F螺旋之间的裂隙内(图3-35)。 肌红蛋白分子表面有一狭缝，E螺旋和F螺旋位于狭缝两侧，形成一个疏水微环境。肌红蛋白的辅基血红素就结合在这个狭缝内。血红素的侧链丙酸基伸到分子表面，在生理pH下，它们带负电荷，Fe2+与卟啉环四个吡咯N原子配位(图3-36A)，F8-His残基咪唑环N-3占据第五个配位位置，Fe2+在邻接His(F8)一侧，距离卟啉平面约0.03nm。O2占据第六配位位置，在卟啉平面另一侧与血红素可逆地结合。脱氧肌红蛋白中第六配位空置：而在高铁(Fe3+)肌红蛋白中H2O占据这个位置。在狭缝另一边E7His并未与血红素结合，称为远侧组氨酸，靠近第六配位位置(图3-36B)。图3-36血红素辅基的结构 肌红蛋白由3个外显子编码：外显子编码1至30(NA1到B2)，外显子编码31至105(B3至G6)，外显子编码106至153(G7至HC5)（图3-32）。研究表明，39至139(C4到H14)的片段与血红素结合关系密切。有人用蛋白酶从脱辅基肌红蛋白N-端和C-端各切去一段，制备出相当于32至139的多肽，加入血红素后构成微型肌红蛋白，在体外系统能可逆地与O2结合，与天然肌红蛋白相似。就氧合功能而言，1-31和140-153贡献不大，但不排除这些片段在稳定分子结构、促进合成、折叠和运输以及种系发生等方面可能的作用。图3-37 血红蛋白-亚基的形成 3.2.2.2 肌红蛋白的功能 血红素在水中可以短暂地氧合，然后形成血红素-O2-血红素夹层中间物，很快产生不能氧合的高铁血红素。虽然肌红蛋白中真正与O2结合的是血红素，但是肽链起着围篱作用。由于血红素结合在肽链绕成的疏水狭缝中，远侧His的位阻效应防止了夹层复合物的形成，避免了Fe2+氧化或流失，使血红素可以长时间可逆的氧合-放氧，完成O2载体的使命。同样是血红素辅基，在细胞色素中它是电子载体，在过氧化氢酶中参与过氧化氢分解为水和氧的催化过程。可见辅基的功能在一定程度上依赖于它所结合的多肽链提供的微环境。 为了给肌红蛋白肽链的围篱作用提供实验支持，James和Collman合成了围篱铁卟啉复合物，在铁卟啉平面一侧，有一个咪唑衍生物占据Fe2+第五个配位位置，另一侧有疏水侧链基团形成保护O2结合的围篱(图3-38)，它对O2的亲和力与肌红蛋白相仿。 CO是许多含碳物质不完全燃烧的产物，也是血红素在体内降解的产物之一。游离血红素对CO的亲和力比对O2的亲和力大25000倍：而肌红蛋白对CO的亲和力仅比对O2的亲和力大200倍。这是因为游离血红素与CO结合时，C-Fe2+键与CO键在一条直线上；而血红素与O2结合时Fe2+-O键与O=O键之间形成121的夹角。在肌红蛋白中，远侧His(E7)的存在对其与CO的结合显然会产生更大的位阻效应，结果大大降低了对CO的亲和力和CO中毒的危险，保证在生理条件下肌红蛋白能有效地履行贮藏和输送O2的功能(图1.37)。脱氧肌红蛋白中-螺旋含量约60，三维结构比较松散，稳定性下降。与血红素结合后，构象发生变化，-螺旋含量恢复至75，分子结构比较紧凑，稳定性也明显提高。这说明血红素辅基对肽链折叠也有影响。 3.2.3 血红蛋白的结构与功能 血红蛋白(hemoglobin, Hb)存在于脊椎动物红细胞中，是运输O2和CO2的工具。Hb是第一个得到X-射线衍射结构分析初步结果的蛋白质，还是第一个与生理功能相联系的蛋白质。从异常血红蛋白一级结构研究中提出了分子病的概念，从Hb与O2结合中发现了协同效应。从而成为迄今认识蛋白质结构与功能关系最好的范例。 3.2.3.1 血红蛋白分子结构 血红蛋白由四个亚基组成(22)，每个亚基含一条多肽链和1个血红素辅基。亚基多肽有141个氨基酸残基，亚基多肽链有146个氨基酸残基，二者有60个相同，约占42，其中有23个残基与Mb相同。Hb的亚基与Mb的氨基酸序列虽有明显不同，但血红素结合部却非常保守，而且它们的二、三级结构也十分相似，仔细对比也有一些差异(表3-5)。表3-5 血红蛋白-和-链与肌红蛋白二、三级结构的异同肽链区段肌红蛋白（Mb）-链（）-链（）A螺旋AB非螺旋B螺旋BC螺旋C螺旋CD螺旋D螺旋E螺旋EF螺旋F螺旋FG螺旋G螺旋GH螺旋H螺旋HC螺旋残基总数-螺旋非螺旋-螺旋非螺旋-螺旋无规卷曲-螺旋-螺旋无规卷曲-螺旋无规卷曲-螺旋无规卷曲-螺旋基(24个残基)含5个残基153=MbA16-B1不同=Mb=Mb有310螺旋都不同于Mb不存在无规卷曲EF25不同于Mb=Mb=MbG13为310螺旋Mb含20个残基含3个残基141=Mb少2个残基=Mb=Mb有310螺旋CD57不同于Mb=MbE1820为无规卷曲(=)=Mb=Mb(=)GH13不同于Mb(=)(=)146血红蛋白的四个亚基按四面体排布，亚基间凹凸互补，构成一个6.55.55nm的四面体。两个与两个亚基按双重对称轴排布，沿X或Y轴旋转180，外形相似；沿Y轴两个与两个亚基间均有空隙，形成中心空穴(图1.38)。1/1或2/2之间接触面较大，包括G10H9之间以及B、D螺旋的34个残基，由1719个氢键将其缔合成稳定的二聚体(1/1和2/2)，不受血红素和O2结合的影响。1/1或2/2之间接触面较小，涉及1的CD和2的FG非螺区中19个残基，将两个二聚体缔合为四聚体，此种结合易受O2和血红素结合的影响。脱氧血红蛋白中,亚基间的静电相互作用（图1.39），以及分子中心空穴周围两个链的N-端-NH3+、Lys-82（EF6）、His-2和His143（HCl）共8个正电荷与空穴中的效应剂分子2，3-二磷酸甘油酸（BPG）之间静电相互作用（图1.40）对稳定脱氧血红蛋白的四级结构发挥着重要作用。这些静电相互作用在血红蛋白氧合后不复存在。3.2.3.2 血红蛋白的变构效应Mb和Hb均为储藏和运输O2的载体，Mb是单体，Hb为四聚体，在氧分压较低时Mb对O2的亲和力远大于Hb，如以P50表示一半结合部位被O2饱和时的氧分压，Hb的P50=26Torr，Mb的P50=1Torr。Mb+O2 MbO2设K为MbO2解离常数，则；若Y为Mb氧饱和度，则；用pO2代替O2，P0代替K，上式改写为：，是一个典型的双曲线方程对Hb来说，Hb+nO2 Hb（O2）。，或取对数，olg=nlogpO2-nlogP50上式即Hill方程，是一个直线方程，Y=0.5时n(斜率)值即为Hill系数。Mb的n=l，Hb的n=2.8，表明Hb与O2结合存在协同效应(或变构效应)，即先结合的O2影响同一分子中空闲的O2结合部位对后续O2的亲和力(详见别构酶一节)。若以纵坐标表示Y，横坐标表示pO2，Mb的氧合曲线为双曲线，Hb的是S型曲线(图1.41)。 Hb的氧合曲线反映了HbO2的解离特征：即在氧分压较高的区间，只有很少HbO2解离，表现为S型曲线上段：在氧分压很低时，只剩下不多的HbO2缓慢地解离，表现为S型曲线下段；只有在S型曲线中段相应的氧分压区间，HbO2随pO2下降快速解离。如果肺泡中pO2=100Torr，活动肌肉毛细血管中pO2=20Torr，P50=30Torr，n=2.8，在肺泡中Y=0.97，在活动肌肉毛细血管中Y=0.25，二者之差Y=0.72，即在此条件下血液从肺泡流到活动肌肉中将释放所携带的72的O2假如没有协同效应，即n=l，其他条件不变，那么Y肺泡=0.77，Y毛细血管=0.41，Y=0.36，可见在同样条件下协同效应使Hb的O2释放量增加一倍。实际测算表明，pO2从100降至20Torr，MbO2只释放10的O2。显然，血红蛋白适合于从肺泡到组织的O2运输，肌红蛋白则适合于通过组织间液从血液接受O2，将它储藏在细胞内备用。 人体的血红蛋白除HbA(22)外，还有HbA2(22)和HbF(22)。、链的一级结构仅有个别氨基酸不同，二、三级结构十分相似。成人血液中HbA2仅占2，HbF不到1，而胎儿血液中HbF是主要血红蛋白，在足月的新生儿血液中HbF占7080。在生理条件下，HbF对O2的亲和力大于HbA，使得胎儿通过胎盘循环从母体得到O2(图1.42)。Hb对O2的亲和力对pH和CO2的变化敏感，pH值下降时，Hb对氧的亲和力降低，HbO2解离曲线右移，S型渐趋双曲线型。实际上血液pH变化很小，而CO2增大同样导致Hb对O2的亲和力下降。Hb链N-端氨基可逆地与CO2结合。在代谢活跃的组织中，CO2增大或pH下降促进HbO2放O2，而O2的释放又促进Hb与CO2结合，这种现象称为Bohr效应(图1.43)。 1967年，Reinhold Benesch和Ruth Benesch发现2，3-二磷酸甘油酸(BPG)是血红蛋白的别构效应剂。在成熟的人红细胞中HbBPG，每个Hb在其中央空穴结合一分子BPG，通过与周围正电荷集团的相互作用使Hb的四级结构更趋稳定(见图1.39)。如果没有BPG，Hb的氧合就不存在协同效应，在生理条件下，BPG的结合使Hb对O2的亲和力下降到1/26。在某些内外因素影响下净输氧量下降时，机体可通过调整BPG浓度进行补偿。例如肺气肿病人因支气管气流受阻，Hb不能充分氧合，动脉血pO2仅为50Torr，只有正常值的一半。由于BPG浓度从4.5升至8.0mmol/L，使P50从26升至31Torr，动脉O2饱和度从0.86变到0.82，静脉O2饱和度从0.60变为0.49，因此净输O2量Y从0.26增至0.33。又如一个人从海拔0米到海拔4500米时，48小时内他的红细胞中BPG从4.0增至7.5mmol/L，净输O2量相应增大(图1.44)。由于亚基HCl是Ser而不是His，不能与BPG形成盐键，致使胎儿血红蛋白HbF(22)对BPG的结合力小于HbA(22)，因此对O2亲和力较高。 3.2.3.3 血红蛋白别构效应的分子机制 Hb-亚基的单体具有对O2的高亲和力，氧合曲线为双曲线，与Mb极为相似。孤立的亚基易形成四聚体，4被称为HbH，没有HbA的变构效应。因此，血红蛋白的别构性质来源于亚基间的相互作用。(1)氧合中血红素铁原子的变化：在脱氧血红蛋白中，由于连接血红素F8His咪唑环与血红素卟啉环间的位阻斥力，以及血红素铁外层电子处于高自旋状态，半径较大，不能进入卟啉环中央小孔，而离开卟啉平面约0.06nm：同时血红素向F8His方向稍微隆起，呈现圆顶形(图1.45)。在氧合过程中，铁外层电子变成低自旋状态，半径缩小了13，移动0.06nm，进入卟啉平面中央小孔，血红素完全呈平面状态。血红素的状态既受O2结合的影响，又依赖于Hb整体的四级结构。 (2)亚基三级结构的变化：在血红蛋白亚基中，血红素及F8His与邻近的15个侧链基团有紧密的联系。因此，氧合过程中铁原子的位移牵动F8His位移以及F螺旋、EF和FG片段等的位移(图1.46)。F螺旋向H螺旋移动二者之间的空隙变小，迫使HC2的Tyr侧链从隙中移开，导致链间盐键的断裂。这样，血红素上氧合引起的变化，触发亚基内部的构象改变，导致亚基交界面上的结构改变。 (3)四级结构的变化：氧合引发的构象变化传递到亚基界面上，促使两个原体(11)与(22)相对旋转15，平移0.08nm(图1.47)。脱氧状态时1亚基C7Tyr-42酚基与2亚基G1Asp99羧基间的氢键，在氧合引起的亚基位移中被破坏，而在1亚基G1Asp9的羧基与2亚基G4Asn102酰胺基间产生一个新的氢键(图1.48)。氧合过程中亚基的旋转和位移，使维持四级结构的盐键断裂，两个亚基的铁原子间的距离从3.99减为3.31nm，分子中央空穴变小以致容纳不下BPG，盐键的断裂也引起亚基的构象改变，如E11Val侧链移开，解除了O2结合的空间位阻。按照序变模型，上述血红蛋白氧合过程变构效应的机制概括于图1.49。3.2.2.4 异常血红蛋白编码血红蛋白多肽链的基因发生突变，导致个别氨基酸取代、缺失、肽段融合，延长甚至整个肽链的缺失，形成300种以上的异常血红蛋白。由于取代发生的位置、范围、性质各不相同，对血红蛋白结构和正常功能的影响也就有所不同，有的异常血红蛋白结构和功能均无重大改变，有些异常血红蛋白的结构发生显著变化而导致疾病，因此，对于阐明蛋白质结构与功能的联系极有参考价值。根据变异的性质，可将异常血红蛋白分为以上四类。 (1)分子表面发生变异的Hb：分子表面发生取代的异常Hb已发现一百多种，绝大多数不影响Hb的稳定性和功能，在临床上是无害的。但有少数可引起临床症状，尤其是镰刀状红细胞贫血症，患者红细胞含异常的HbS，红细胞呈镰刀形，易破碎，寿命短，从而导致严重的贫血，甚至危及生命。现已查明，镰刀状红细胞贫血患者编码珠蛋白链的基因有一个碱基突变(TA)结果6(A3)的Glu被Val取代，致使HbS比HbA少24个负电荷，pI从6.68增至6.91，在脱氧状态下溶解度仅为HbA的1/25。Val取代Glu使HbS每个亚基外侧产生一个粘斑，而脱氧HbS还有与粘斑互的部位，互相粘结，形成细长的脱氧HbS聚合体(图1.50)。几股这样的聚合体盘旋缠绕，形成在电镜下可见的直径为17nm和21.5nm的两种纤维。直径21.5nm的螺旋纤维更常见，有14股螺旋纤维。这些纤维使红细胞变成易碎的镰刀形。红细胞破碎后释放出HbS纤维，使血液粘度增大，血流不畅，小血管阻塞，造成供O2不足又恶性循环地导致形成更多的镰刀形红细胞。被释放的HbS随即被降解，以致造成严重的贫血，最后危及生命。纯合子(HbS/HbS)患者红细胞中HbS含量高达95以上，多于成年前夭亡；杂合子(HbS/HbA)患者红细胞中HbS含量约为35，一般不表现严重的临床症状，但在高海拔进行重体力活动或麻醉均可能引发红细胞镰刀化。镰刀形红细胞贫血是第一个证实的单一基因中一个等位基因点突变导致蛋白质分子变异而造成的分子病。(2)血红素结合部位发生变异的Hb:Hb每个亚基都有一个结合血红素的疏水性裂隙，除结合血红素的F8His和E7His外，其余与血红素接触的19个残基有15个是疏水残基。上述残基发生取代涉及到血红素的结合及Hb的稳定性。影响的大小和临床症状的严重程度取决于取代残基的性质。例如HbM为E7或F8His被Tys取代，带负电荷的酚基与Fe3+形成络合物，把血红素锁定在高铁(Fe3+)状态，从而丧失结合O2的能力。纯合子HbM几乎总是致死的，杂合子HbM只有一半血红素与O2结合，造成供O2不足，发绀和继发性红细胞增多。HbM-Milwaukee-1虽是链的Val167(E11)被Glu取代，但它与E7在螺旋同一侧，Glu的侧链羧基负电荷也能与Fe3+络合，把血红蛋白定格在高铁状态，并将E7His挤出血红素裂隙(图1.51)。另外，HbBristol链67的Val被Asp取代，其侧链负电荷与E7His的咪唑基正电荷形成盐键，使血红素裂隙遭到破坏，产生高度不稳定的Hb和严重的先天性亨氏小体溶血性贫血(CHBHA)。Hb Hammersmith则是由于链血红素裂隙人口处的Phe42(CD1)被亲水的Ser取代，使水进入空穴，阻碍血红素的结合。 (3)三级结构突变的Hb：如果多肽链中螺旋段的残基被Pro取代，或螺旋段及非螺旋拐弯处缺失一个或多个残基，均可破坏-螺旋和肽链的构象，导致Hb稳定性下降，丧失O2结合能力。例如Hb Genoa 26(B10)Leu被Pro取代；Hb Duarte 62(E6)Val被Pro取代，致使Hb不稳定和严重的CHBHA。Hb Freiburg 23(B7)Val缺失，Hb Gen Hill 91-95(F7-FG2)缺失，造成构象破坏，不能结合血红素，丧失氧合能力(图1.52)。 (4)四级结构突变的Hb：Hb氧合前后四级结构发生明显改变，1/2或2/1发生位移，因此亚基界面上的突变易造成变构效应的丧失，出现异常的氧亲和力。例如Hb Uakima和Hb kqempsey、Hb Radclife的亚基99(G1)Asp分别被His、Asn和Ala取代，导致脱氧Hb稳定性增大，O2亲和力升高。Hb Kansas 亚基102(G4)Asn被Thr取代，氧合态Hb的构象破坏，O2亲和力下降，患者动脉O2饱和度仅0.6而不是正常的0.97，因而明显发绀。3.2.3免疫球蛋白的结构与功能免疫（immunity）是人类和脊椎动物最重要的防御机制，免疫系统能在分子水平上识别“自我”和“非我”，然后破坏那些被鉴定为非我的实体。在生理水平上免疫系统对入侵的反应或应答（respone）是多种类型的蛋白质，分子和细胞之间的一套复杂而协同的相互作用，然而在个别蛋白质水平上免疫反应是配体与蛋白质可逆结合的一个生化系统。3.2.3.1抗原(antigen)抗体(antibody)的一般概念：当外源物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白（immune globin），并与之结合，以消除异物的毒害。此反应称为免疫反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。 抗体的特点：高度特异性，多样性。特异性是指抗体通常只能与引起它产生相应抗原发生反应，多样性是指抗体可以和成千上万的各种抗原起反应。3.2.3.2免疫球蛋白（immune globin）的分类：人免疫球蛋白分为：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。3.2.3.3免疫球蛋白结构抗体的四链单位：抗体有五大类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。人类所有的抗体都具有共同的四链结构单位，在四链单位中，有两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链），重链的分子量为51047104，大约由450个氨基酸残基组成，轻链的分子量为2200023000，由210230个氨基酸残基组成，两条轻链之间以及重链与轻链之间，均以二硫键相连，不论是重链或轻链都可以分成可变区和恒定区（图示）从多肽的N末端算起，占轻链的二分之一或重链的四分之一的肽段，是可变区（V区），在同类抗体的不同抗体分子中，其恒定区的序列变化很小，所有抗体都可以用（H2L2）n通式表示，H2L2是一个四链单位，n表示是四链单位数, IgG、IgA、IgD、IgE均为H2L2， IgM为（H2L2）5J，J为J链，分子量为20000，这5种抗体在结构上的主要区别是：H链结构，链间二硫键的数目与位置，以及四链单位数的不同。所有的抗体都是糖蛋白。1免疫球蛋白的一级结构：IgG是人类血清抗体中含量最多（占抗体总量的70%），作用最大，研究最清楚的一类抗体。它可以作为各类抗体的代表，因此，这里只介绍IgG分子的结构与功能。(1)IgG的分子结构是对称的，由两个相同的半分子构成，每个半分子包含一条轻链和一条重链，轻链与重链之间由一个二硫键连接，两个半分子的重链之间由2个二硫键连接，每条轻链包含214个氨基酸残基，分为长度大至相等的两个肽段，即VL和CL区，每个肽段都包含一个链内二硫键，每条重链包含446个氨基酸残基，分为四个长度大致相等的四个肽段。即VH、CH、CH2、CH3区，每个肽段都包含一个链内二硫键。(2)VL和VH的同源性和高变异区：IgG分子结构最明显的特征是：轻链和重链都可以区分为易变区和恒定区，VL区和VH区的长度大致上相等。对各种抗体的易变区序列的比较表明，各种抗体的易变区序列，虽然有高度的差异，但是仍然有一定的同源性。一级结构可变区内各个位置的残基变异频率并不相同，高度可变的区域称为高变区，L链可变区中有3个高变区，H链可变区有4个高变区，高变区是抗体与抗原直接结合的部位。(3)CH1、CH2、CH3、CHL同源性：如果按照链内二硫键的位置，把重链的恒定区分为大致相同等的CH1、CH2、CH33个片段，并按最大同源性的方式排列，然后加以比较发现，3段之间每100个氨基酸残基中就有2224个位置的残基是相同的，3段与CL1区也有高度的同源性。(4)IgG的活性片段用木瓜蛋白酶对IgG进行有限的水解反应，可以把IgG分子切成3个活性片段，其中N端两个相同的片段能与抗原结合，称为Fab，含有一个能与抗原结合的部位，（单价的），与抗原结合的复合物不产生沉淀，抗体分子有两个Fab，是双价的，与抗原结合的复合物可以形成沉淀。Fc是酶解的另一个片段，可执行各种生物学功能。IgG的生物学功能只有在抗体与抗原结合后才能产生，故有人认为抗原-抗体的结合好比“开关，一旦打开，引发出一系列生物学效应”。但对这种开关的机理尚未搞清。有的学者认为抗原与抗体结合后，抗体构象发生变化，但无论从X-光衍射或光的回光散射等方法都未确证构象的变化。二空间结构1铰链区：IgG分子呈“Y”字形或“T”形，2个Fab和一个Fc通过一个铰链区连接在一起。铰链区的特征是：重链区之间的二硫键多集中于铰链区，彼此平行含有较多的脯氨酸，不可能形成螺旋有相当的柔曲性，易被蛋白酶分子接近。2同源区：IgG分子有十二个结构域，其中每个轻链含有4个结构域（VL和CL），每个重链含有4个结构域（VH、CH1、CH2、CH3）图示。这些结构域由于其氨基酸残基序列有高度相似性，因此，在二维结构方面，是很相似的，被称为同源区，每个结构域内部有一个链内二硫键，此二硫键能够维持结构域的稳定。3结构域：对任何一个结构域而言，肽链折叠，形成7条折叠股，其中4条折叠股构成一个反平行折叠片层的四链层，另3条折叠股构成了一个反平行折叠片层的三链层，四链层与三链层通过一个二硫键相连。3.2.3.4免疫球蛋白的主要功能1 凝集作用和沉淀作用(结合抗原)：与抗原结合是Ig免疫功能的基础，它是由每个Fab片段中重链和轻链的变区所组成。每一个四链单位表现为二价，能与2个抗原决定簇结合，而无论是分子抗原(如蛋白质等)还是颗粒抗原(如细菌、病毒、红细胞等)一般都表现为多价，能与多个抗体结合，因此在抗原、抗体结合后可形成大的网格结构，出现凝集和沉淀等现象。凝集的病原体会影响营养物质的吸收或代谢物质的排泄，而且凝集的颗粒或沉淀的颗粒会有助于吞噬细胞的吞噬。2 激活补体：补体是血浆中一组参与免疫反应的对抗原非特异性的蛋白酶系，血清中游离的IgG不能固定补体，只有当Ig与具有抗原性的细胞结合后，并且只有在2个以上的IgG与抗原结合后才能通过Fc部分激活补体酶系来激活补体、固定补体，使酶系按一定顺序依次活化，最后形成19个补体分子组成的十聚体。这说明IgG的CH2功能区与C1q的相互作用必须在抗原-抗体复合物处于集聚状态时才能发挥激活补体的生理功能。3 调理作用：调理作用是指促进颗粒抗原（如细菌）被吞噬细胞的吞噬作用。Ig颗粒抗原结合后有调理作用，即Ig与颗粒抗原结合后，可改变抗原表面的电荷，从而减少抗原与吞噬细胞间的静电排斥力。吞噬细胞本身就有吞噬异物，包括病原微生物的功能，不过，当有抗体及补体参与时，则可大大增强其吞噬能力，由于吞噬细胞有多种补体受体，当补体分子或其片段与相应受体结合，可刺激该细胞促进吞噬，诱导呼吸爆发，增强因子分泌及杀菌能力，称为补体的调理作用。4中和毒性和病毒：一些引起疾病的细菌如破伤风杆菌、白喉杆菌以及内毒素杆菌等，都能产生外毒素(exotoxin),因而引起各种疾病。这些外毒素在体内可以诱导IgG类抗体，IgG类抗体与外毒素结合，使之丧失毒性(称为中和毒素作用)，保护了机体。例如白喉毒素，它对敏感细胞的毒性作用是抑制细胞的蛋白质合成。白喉毒素与氨基酰转移酶共价结合，抑制细胞内蛋白质的合成，致使敏感细胞死亡造成对机体的危害。5. 多克隆抗体和单克隆抗体：如果给动物注射抗原,虽然抗原与各种抗体产生细胞的亲和性有所不同，但是还是有大量抗体产生，细胞将与之结合，结果血液中出现的抗体源于数种不同的细胞克隆，这些抗体就是多克隆抗体（polyclonal antibodies）。如果可以分离到抗体产生细胞的单克隆，然后使所有的抗体均来自同样的克隆，这样制备的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibodies）。由于单抗细胞的寿命有限，严重限制了单抗的常规制备。1975年，Milsetein和Kohler创建了不受限制地大量制备针对特异抗原的单抗技术，将可产生专一性抗体的B淋巴细胞与具有无限繁殖能力的恶性淋巴瘤细胞（骨髓瘤细胞）融合，融合体称为杂交瘤，它既可以永久地培养，又可分泌大量的均一的抗体。由于用这个技术产生的抗体具有很高的专一性，现已成为研究的常用工具。3.2.4朊病毒的结构与功能朊病毒 3.3蛋白质组学研究3.3.1功能基因组与蛋白质组人类基因组计划被誉为20世纪的三大科技工程之一。其划时代的研究成果人类基因组序列草图的完成，宣告了一个新的纪元“后基因组时代”的到来。其中，功能基因组学（functional genomics）成为研究的重心，蛋白质组学（proteomics）则是其“中流砥柱”。正因为如此，Nature、Science分别在2001年2月15日、16日公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”（Nature 409：747，2001）、“Proteomics in genomeland”（Science 291：1221，2001）的述评与展望，将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度，认为是功能基因组学这一前沿研究的战略制高点，蛋白质组学将成为新世纪最大战略资源。以人类基因组计划为工程的基因组计划是20世纪的重大科技工程。其中，HGP旨在完成人基因组24条染色体上5万左右基因的作图(遗传图与物理图)和30亿碱基的DNA全序列的测定。此计划自1990年实施以来得到快速发展：1994年人基因组全套遗传连锁图发表，1995年全基因组覆盖率高达94的物理图问世；同年，汇集了人基因组初步全物理图，3、12、16、22号染色体高密度物理图以及30余万左右cDNA序列信息的“人基因组指南”经Nature结集出版；2000年6月26日，宣告人类基因组序列草图测定完成；2001年2月15日、16日，国际人类基因组计划与美国Celera公司分别在Nature、Science公布人类基因组草图。与此同时，模式生物与致病微生物等的基因组研究相继展开。自1995年支原体(Mycoplasma genitalium)和流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)基因组全序列发表以来，先后有10余种原核生物的基因组全序列发表，第一个真核生物酵母的基因组全序列于1996年完成，截至2001年底，已有不少于75种生物的基因组全序列测定完成。3.3.1.1蛋白质组研究的开端 “proteome(蛋白质组)一词由Marc Wilkins于1994年在意大利Siena的一次2-DE电泳会议上首次提出。其导师澳大利亚Macquarie大学的。Keihh Williams于同年向澳政府提出一项建议；通过对某一种生物的所有蛋白质全部进行质谱筛选与序列分析，以一种不同于DNA快速测序的途径对其提供分子水平的全面分析。1995年，悉尼大学Humphery smith I实验室与Williams等辱家实验室合作，对至今已知最小的自我复制生物Mycolasma genitalium（一种支原体)进行了蛋白质成分的大规模分离与鉴定，并在文献中首次公开使用“pro-teome”一词，同时指出该文所采用的技术体系对于大规模鉴定并分析基因对应的产物以及发现新型蛋白均具有十分重要的意义1。3.3.1.2蛋白质组的含义proteome (蛋白质组)一词源于“PROTEin”与“genOME”的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”：Swinbanks则指出“proteome”代表一完整生物的全套蛋白质。与此同时，Kahn P则认为“proteome”反映不同细胞的不同蛋白质组合。由此可见，“proteome”有三种不同的含义：一个基因组、一种生物或一种细胞组织所表达的全套蛋白质。 功能蛋白质组（functional proteome）：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。蛋白质组学（proteomics）：研究细胞内全部蛋白质（蛋白质组）的组成及其活动规律的学科。3.3.2蛋白质组研究方法3.3.2.1二维电泳蛋白质提取与样品制备1二维凝胶电泳技术二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是目前惟一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。2-DE是由OFarrell和Klose于1975年分别提出的2,17。在2-DE中；蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离。由于电泳装置的限制和载体两性电解质的特性，使得2-DE的重复性很差，很难制备大量重复性好的2-DE胶。20世纪80年代初期出现的固相化pH梯度(immobilizedpHgradient，IPG)等电聚焦电泳技术，使2-DE的重复性和上样量大大改善，不同实验室之间的实验结果可以进行比较，加之后续的微量鉴定技术如Edman微量测序技术以及质谱技术灵敏度的提高，使得2-DE获得了广泛的应用，成为蛋白质组研究中首选的分离技术。2样品制备进行双向电泳的蛋白质样品必须进行精确的制备，制备原则如下：(1)尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。(2)细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解。(3)样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于80。勿反复冻融已制备好的样品。(4)通过超速离心清除所有的杂质。(5)加入尿素之后加温不要超过37，防止氨甲酰化而修饰蛋白。3细胞裂解的方法(1)温和的裂解方法 1)渗透裂解：主要应用于血细胞、组织培养细胞；通常用低渗溶液悬浮细胞。 2)冻融裂解：常用于细菌、组织培养细胞；通常用液氮迅速冷冻细胞，随后在37融化，反复几次。 3)去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，释放其内容物；常用于组织细胞；通常用含有去污剂的裂解液重悬细胞，也可以直接用样品裂解液或重泡胀溶液进行裂解。另外，如果阴离子去污剂SDS用于裂解细胞，可以用含有兼性离子去污剂、非离子去污剂的裂解液稀释样品，也可以用丙酮沉淀以分离出SDS。 4)酶裂解法：某些细胞含有细胞壁，需要首先用酶来消化细胞壁。例如：用溶菌酶(1ysozyme)来消化细菌的细胞壁；用纤维素酶(cellulase)和果胶酶(pectinase)消化植物；用溶细胞酶(1yticase)消化酵母细胞壁。此法常用于植物、细菌和真菌。通常这些酶在等渗溶液中处理细胞。(2)剧烈的蛋白裂解1)超声裂解法：超声仪可产生超声波，通过切应力来裂解细胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果，但需注意应最大可能减少热量和气泡的产生。此法常用于细胞样品。通常用迅速的超声重悬细胞，并在冰上冷却。2)弗氏压碎器(French Pressurecell)：在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力，从而裂解细胞。此法常用于含有细胞壁的微生物，如细菌、酵母和藻类。通常将细胞悬液置于预冷弗氏压碎器中，加压后收集粗提液。3)研磨法：用研钵或研杵研磨细胞，此法常用于固体组织、微生物。组织和细胞通常冻存于液氮中，随后研磨成粉状。可加少量石英砂研磨。4)机械匀浆法：常用于固体组织。匀浆器可用于破碎细胞或一些软组织；而混合器或一些研磨设备用于一些较大的组织。通常将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液(35倍于组织体积)，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液。5)玻璃珠匀浆法：通常剧烈振荡的玻璃珠可以打破细胞壁，释放细胞内容物。此法常用于细胞悬液或微生物。用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置于结实的管子里。每克细胞(湿重)加入13g玻璃珠，剧烈振荡1 min，冰浴1min。重复上述步骤得到蛋白质样品。4用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解1)PMSF(苯甲基磺酰氟)：是一种不可逆抑制剂，常用浓度为1 mmol/L，灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于可在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇(DTT)或者-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减少，因此，在晚些时候可加入含巯基的试剂。2) 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸(EDTA、EGTA）：通常应用1mmolL的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。3) 肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽(1eupeptin)，它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A，(pepstatin)，抑制天冬氨酸蛋白酶(如酸性蛋白酶)的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin)，抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin)，抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在pH=9的时候不能抑制蛋白酶。4) 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK)：通常作用浓度在0.10.15mmol/L，这些柑同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。5蛋白质的分步提取技术具体操作步聚如下：第一步：水溶液的提取：约515 mg细胞加入2ml裂解液I（40mmol/L Tris）。反复冻融34个循环，加入适量的Dnase I和Rnase A，振荡混匀。离心收集上清液，冷冻干燥器中抽干后即为第一步提取物。第二步：含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取：向第一步的沉淀中加入500l的裂解液II（8mol/L Urea, 4% CHAPS, 100mmol/L DTT,40 mmol/L Tris，0.5% Pharmalyte 3-10，20g/ml Dnase I和5g/ml RnaseA）。剧烈振荡混匀，离心收集上清即为第二步提取物。第三步：含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取：将上一步所余的沉淀用40mmol/L Tris清洗后，加入200l裂解液III（5 mol/L Urea, 2mol/L thiourea, 2%SB3-10， 2mmol/L TBP, 40L Tris，0.5% Phar-malyte 3-10，20g/ml DNase I和5g/ml RNase A）。强裂振荡混匀，离心后收集上清，保存于-70。分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液成分是40mmol/L Tris的无离子水溶液，有效溶解亲水性的蛋白质。3.3.2.2二维电泳与细胞蛋白质的分离图3- 聚丙烯酰胺凝胶的单体结构和网状结构聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，PAG)是通过丙烯酰胺(acrylamide)单体和交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene bisac