聚酮化合Monacolin K化合物毕业论文.doc

北京工商大学毕业论文（设计）聚酮化合Monacolin K化合物毕业论文第一章 绪论71.1 红曲和红曲霉71.1.1 红曲和红曲霉的概述71.1.2红曲和红曲霉的发展前景71.2 红曲霉的生物学特征101.2.1红曲霉的分类101.2.2红曲霉的形态学特征101.3 红曲霉的代谢产物111.3.1 莫纳克林K111.3.2 红曲红素131.3.3 桔霉素141.4红曲霉的培养141.4.1固态发酵141.4.2液态发酵151.5洛伐他汀（Monacolin k）151.5.1 他汀化合物的简述151.5.2 他汀类化合物的结构161.5.3 红曲洛伐他汀161.6 研究内容和意义17第二章 实验材料与方法182.1 实验材料182.1.1 实验所用菌种182.1.2 实验所用培养基182.1.3主要仪器和试剂药品182.2 实验方法202.2.1 菌种培养202.2.2 菌落观察及菌落生长情况及代谢产物测定212.2.3 DNA的提取及检测212.2.4 RNA的提取222.2.5逆转录RNA成cDNA（建立20ul反应体系）242.2.6 PCR扩增逆转录得到的cDNA25第三章 实验结果与分析263.1 实验结果263.1.1 菌落形态观察263.1.2 菌种生长曲线273.1.3 莫纳克林K代谢情况273.1.4 红曲霉DNA Pcr扩增琼脂糖凝胶荧光观察（mokf和mokh）283.1.5 红曲霉种子液RNA提取结果293.2 实验结果分析293.3 注意事项303.3.1 培养菌中的相关事项303.3.2 提取RNA和DNA中的相关事项：30第四章 结论与展望314.1 结论314.2 展望32致谢34参考文献35附录.36文献翻译.39文献原文.52第一章 绪论1.1 红曲和红曲霉1.1.1 红曲和红曲霉的概述红曲是以籼米为原料采用现代生物工程技术分离出的优质红曲霉菌(Monascus purpureus)经液体深层发酵而成，是一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。红曲生产历史悠久，是我国传统的发酵食品，也是现代社会应用广泛、药食同源的保健品。目前关于红曲定义的范围有所延伸，广义的红曲是指以红曲霉为菌种发酵(包括固态和液态发酵)淀粉质原料而制得的各种产品的总称。红曲霉以能产生大量红曲色素而得名，红曲霉(Monascus)中文别名 红曲、红糟、红大米，属于散囊菌目中的子囊菌曲霉科真菌，主要存在于树木、土壤中。红曲可用于酿酒、制醋、豆腐乳的着色剂和调味剂，也可做中药胡晓清. 红曲霉(Monascus spp)莫呐可琳K(Monaco1inK)高产菌株的诱变选育及其发酵条件研究D.武汉：华中农业大学,2003.。红曲自古以来在我国一直用于食品的着色，特别是肉制品的着色。由于化学合成色素的毒副作用，研究者正致力于天然色素特别是生物色素的研究与开发孙艳君,胡中泽,高冰.红曲霉的分离鉴定及红曲色素的测定J.中国酿造，2011,1:52-54.，其中红曲霉生产的红曲色素得到了较为深入的研究用天然红曲色素代替合成色素用于食品、化妆品、药品的着色，已成为发展趋势。近年来，红曲在我国的应用有增无减。随着研究的不断深入，工艺的不断更新，市场上的红曲系列产品种类越来越多马美荣, 樊游等. 降胆固醇红曲霉菌种的筛选J. 无锡轻工大学学报, 1999, 3:66-69.。红曲的产地多集中于我国福建、广东、浙江、台湾等地，福建省古田的红曲最为著名。如今，我国红曲产品的年生产能力不断提高，可达2万多吨，产值也达数亿元。目前应用范围较广泛的红曲产品是用于食品着色的红曲红，用于酿酒的红曲米及用于医疗保健的功能红曲等。国内代表产品主要有：红曲红色素、红曲米、“血脂康”、“脂必妥”等。1.1.2红曲和红曲霉的发展前景降低血脂及抑制胆固醇合成 血脂即为血浆中所含的脂类物质，其中包括胆固醇，胆固醇酯，甘油三酯及磷脂等。这些东西可以来自饮食，也可以由机体合成。体内合成的血脂约占血脂总量的70 %。李东，谢静，王敏，等. 红曲起源新考J.中药材，2007，30(4):484-487.早在明代李时珍本草纲目对红曲作了较全面的记载，认为其“破血、活血”功效显著。经过现代人们的研究发现红曲霉的发酵产物之一莫纳克林K是天然他汀类物质，能有效降低血脂及抑制胆固醇的合成，具有综合调节血脂，实现“三降一升”，即降低胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白。清除血管垃圾，从而达到保护血管内皮，一级预防和二级预防各类心脑血管疾病，如脑中风、冠心病、高血压、心肌梗死等沈士秀. 红曲的研究、生产及应用J.食品工业科技，2001，22(1):85.。有数据显示，莫纳克林K在血液中的浓度只要达到0.001-0.005 g/mL，就可以使胆固醇的合成受阻。因此被广泛应用于药品、保健品中。目前，含有莫纳克林类物质的红曲己被开发成降血脂和治疗心血管等疾病的新药洪智勇,毛宁.红曲霉降胆固醇有效成分的研究J.海峡药学,2002,1. 32-34.。有关这方面的研究是当今红曲研究的热点之一，很多研究机构投入了很大的人力物力，希望能取得长足的进步。 降血糖作用红曲霉的培养物作饲料进行动物试验，发现试验兔在进食饲料后0.5 h内血糖降低了23%-33%，而在1h后血糖量仍比对照组下降了19%-29%鲁佳慧, 刘昕, 王江海, 等. 功能性红曲研究进展J. 2003 年全球华人保健 (功能) 食品科技大会论文集.。降血压作用研究发现红曲还可作血压升高剂,对血压有双重控制作用。在饲料中添加红曲霉培养物的动物试验中,发现添加0.2%-0.3%的红曲霉培养物的饲料， 可使患先天性高血 压老鼠的血压由超过266KPa(200mmHg)降至24.0 KPa (180mmHg) 以下，其有效成分为c氨基丁酸(GABA) 和葡萄糖胺或红曲霉的其它细胞壁成分 。分别添加含有该生理活性物质的红曲米0.25%和0.35%， 用以制成180烤制的面包140高压瞬间加热的酱与不添加上述降压物质的普通面包和酱作对比试验，其降压效果明显 Chang L.，Yan Z.，Yin Y.W.，et al. Monascus purpureus-fermented rice (red yeast rice)：A natural food Product that lowers blood cholesterol in animal models of hypercholesterolemia J.Nutrition Research，1998，18(l):71-81。红曲对自发高血压大鼠、DO-CA-盐型高血压大 鼠有明显的降血压作用 。每日经口服给予SHR大鼠、肾血管型高血压大鼠(RHR) 及DHR大 鼠0.0、0.4、0.8和1.2g/kgBW红 曲3 4 周 ， 每周测量收缩(SBP) 1 次.结果显示,红曲能够降低SHR 、DO-CA-盐型高血压大鼠 (P0.05),对 R H R大鼠的降血压作用不明显,其中DO-CA-盐型高血压大鼠的降血压作用强于SHR。食品着色剂食用色素因其可以改善食品外观和色泽的功能，成为食品添加剂重要的组成部分。食用色素目前主要分为两大类：天然色素和合成色素崔莉红曲色素提取及其黄色组分制备与检测技术研究D泰安：山东农业大学，2008。随着人们对健康的关注，天然色素以其安全、绿色、无毒而备受青睐。天然色素主要是指从动植物材料和微生物细胞中获取的具有着色功能的产品。但是动植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等多种因素影响，存在原料不足，产品价格昂贵等缺点，使应用受到限制，而利用微生物资源生产天然色素，可以有效避免这些缺点，而且工业化生产更为方便，因此，采用微生物生产天然色素将逐渐成为主流。红曲红素是一种由红曲霉属的丝状真菌经发酵而成的优质天然食用色素，是红曲霉的次级代谢产物，不仅广泛应用于食品工业，还广泛应用于医药和化妆品行业。红曲发酵产生的红曲红色素色泽鲜艳、色调纯正、饱满、光热稳定性好，是天然绿色理想的食品着色剂，常应用于肉制品、果汁、色酒、果酱、饮料、糖果、糕点等食品的加工中崔莉，张德权，张培正.红曲色素的研究现状分析J.食品科学.2008，8; 115-118.。工业化产品红曲精纯片 红曲精纯片除了不含任何添加剂，没有胶囊外壳，所以可长期服用对肠胃无任何刺激作用的优点以外还具有五大优势。一、红曲霉菌以大米为培养基，经过发酵后合成天然他汀，同时也产生对人体有害的桔霉素 Silavana T，Daniel J，Daroit. Piglnent production by monascus purpureus in grape waste using factorial design J. Swiss society of food science and teehnology.2008，41:170-174.。这是一个很难攻克的世界性难题，研制组经过无数次试验、摸索和工艺改进。终于把桔霉素的问题解决了，通过国家权威检测机构(无锡理工大学生物工程学院)检测出“桔霉素为零”的红曲产品。二、红曲精纯片里面的他汀含量居世界首位，这是难以想象的成就，让我们的分离提纯减轻了很大的负担。三、从他汀分子结构方面来讲，红曲精纯片中所含天然他汀的开环率最高，所以无须增加肝脏负担，对肝肾无损伤，活性强，效果显著，国内国际领先。四、经过10余年的努力，经过30代红曲菌优化选育，培育出活性更高，更稳定、效果更佳的红曲精纯片。它富含八种高纯度高活性的天然他汀小分子，对血脂有全面的调节作用，克服了化学合成他汀严禁组合使用的致命弱点。五、用大豆和大米共同作为培养基来代谢天然他汀的技术，这个技术是世界上绝无仅有，所以红曲精纯片中除含丰富的他汀以外，还有皂甙、黄酮、甾醇、18种氨基酸、脂肪酸、微量元素硒、铁、钙、锌等，维生素E、B1、B2等等林杰, 黄宏南, 林国斌, 等. 功能性红曲功效成分的含量测定J. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(6): 972-973.。综上所述：红曲具有广阔的应用前景及研究价值，它走在时代的前沿。1.2 红曲霉的生物学特征1.2.1红曲霉的分类红曲中的红曲霉属于真菌门，子囊菌亚门，真子囊菌纲，散子囊菌目，红曲菌科，红曲菌属的真菌。中国科学院微生物研究所和轻工部食品发酵研究所(1983)正式收集编目的重要红曲霉有8种48个菌株。这8种为：紫红曲霉、安卡红曲霉、红色红曲霉、巴克红曲霉、烟色红曲霉、发白红曲霉、锈色红曲霉、变红红曲霉、布谷昭(1988)从酒曲、腐乳、酒糟及土壤和腐败果实中共分离到约20种红曲霉陈义光, 彭德姣, 田宏现. 红曲及红曲霉的研究与应用J. 湖北农学院学报, 2000, 20(2): 188-190.。日本学者佐藤喜吉(KikichiSato)利用各种培养基上红曲菌的生长情况和菌落特征进行分类，先后命名了13个种；日本学者冢广(Hiroshi)和我国台湾学者林庆福先生利用PDA，曲汁加乙醇和普氏液加氯化钠等培养基观察红曲菌的生理特征，将红曲菌分为四个群14个种。Hawskworth和Pitt(1983)采用MEACYA和G25N三种培养基在25条件下培养红曲菌，观察了一些模式菌株和许多新分离的菌株，将文献中记载的种名归入他们仅承认的三个种，并拟定了2个分类检索表。随后，多位学者在分类鉴定和描述新种时使用了上述三种培养基在25条件下培养红曲菌贾波，周立平.红曲霉研究之现状及发展前景J.中国食品添加剂，2002，6(8):32-35.。1.2.2红曲霉的形态学特征营养结构 菌丝体初期在粳米粒内部生长，无色，渐变为红色，并使米粒变成紫红色。菌丝体大量分枝具有横隔，多核，分枝繁密且不规律，内含橙、紫红色颗粒，在分枝的顶端产生单个或成串的分生孢子。孢子呈球形或椭圆形。闭囊壳橙红色，近球形，含有多数子囊，子囊内含8个孢子，子囊孢子卵形或近球形，光滑，透明，无色或漆红色。菌丝细胞幼时含有颗粒，老后含有空泡及油滴。菌丝体中常出现联结现象，两条菌丝生长在一处时由一个细胞产生突起，另一细胞的细胞壁消失，使二者沟通交流。无性繁殖 红曲霉无性生殖时，由菌丝生出分生孢子梗，并在顶部长出分生孢子，分生孢子以单生或以向基式生出26个成链。分生孢子大多为梨形，部分为球形，多核，萌发后形成菌丝继续生长繁殖。有性生殖 红曲霉有性生殖时在菌丝顶端或侧枝顶端首先形成一个单细胞多核的雄器，随后在雄器下面的细胞处以单轴方式又生出一个细胞，这个细胞就是原始的雌器。由于雌性器官的生长和发育，将雄器向下推，使雄器与柄把呈一定角度。这时雌性器官又在顶部生成一层隔膜，分成两细胞，顶端的细胞为受精丝，另一细胞即为产囊器。当受精丝尖端与雄器接触后，接触点的细胞壁解体产生一孔。雄器内的核和细胞质通过受精丝进入产囊器进行质配。在两性器官下面的细胞生出许多菌丝将其包围，形成初期被子器。被子器内产囊器膨大并生成许多产囊丝。每个产囊丝产生许多多核细胞，此时发生核配，经过核配的细胞为子囊母细胞。每个子囊细胞中的核发生三次分裂，形成8个子囊孢子。此时被子器已经发育成熟子囊消解，子囊孢子成堆留在被子器内，就像其中只有一个子囊。被子器外壳破裂后，子囊孢子散出，子囊孢子萌发后又形成多核菌丝纪远中. 红曲及红曲霉的研究现状及进展J. 天津药学, 2005, 17(2): 65-67.。1.3 红曲霉的代谢产物1.3.1 莫纳克林K1979年，远藤从Monascus ruber的发酵液中，分离出能抑制胆固醇生物合成途径关键酶3 - 羟基 - 3 甲基 - 戊二酰 CoA 还原酶(HMG-CoA)，具有还原酶活性的物质，称为莫纳克林K。此后，人们又得到了6a-hydroxy-iso-ML-236B、3a-hydroxy-ML-236B和ML-236A等代谢过程中的产物，并证明它们和莫纳克林K一样，都具有抑制胆固醇生物合成的活性。随后发现的结构类似物还有莫纳克林L、J、X以及它们的衍生物，这些物质也具有一定的抑制胆固醇生物合成的活性孙伟, 刘爱英, 梁宗琦. 红曲中莫纳克林 K (Monacolin K) 的研究进展J. 西南农业学报, 2003, 16(3): 112-116.。如今，人们将上述具有抑制胆固醇生物合成活性的物质统称为莫纳克林(Monacolins) 。莫纳克林K是莫纳克林家族中的一个重要成员，国内外研究都很多。莫纳克林K为白色针状晶体，分子式为C24H36O5，熔点为157159，易溶于甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、苯和碱性水溶液，不溶于正己烷以及中性或酸性水溶液。比旋光度= +307.6(甲醇溶液)，紫外光谱最大吸收峰为：229 nm，237 nm，246 nm(甲醇溶液) ：IR光谱(KBr)吸收带为：3550 cm ， 2970 cm，1220 cm 。莫纳克林K的化学名称为1，2，6，7，8，8a六氢3，5二羟基2，6二甲基8(2”甲基1”氧代)1萘庚二酸5内酯。分为四部分：羟基 内酯、连接内酯与亲酯基团部分成六氢萘环部分和侧链酯部分，莫纳克林K有内酯式和酸式之分，具体的分子式如图1.1： 图1.1 为莫纳克林K分子式结构莫纳克林K抑制胆固醇合成，生物化学的研究表明, 胆固醇合成的关键步骤是甲经戊酸的合成见结构式 Ji Yeun Kim, Hae-Jin Kim, Jee-Hwan Oh, and Inhyung Lee.Characteristics of Monascus sp. Isolated from Monascus Fermentation ProductsJ. Food Sci. Biotechnol,2010, 19(5): 1151-1157。其中影响最大的是3 - 羟基 - 3 甲基 - 戊二酰 CoA 还原酶, 它是胆固醇合成代谢中的限速酶, 各种因素对胆固醇合成的调节主要是通过对HMG-CoA还原酶活性的影响来实现的。Monacolin K的空间结构与HMG-CoA的结构非常相似, 且对HMG-CoA还原酶的亲和力比HMG-CoA强万倍, 所以它能竟争性地与HMG-CoA还原酶结合, 从而抑制胆固醇合成。这类物质的浓度只要达到0.001-0.005ug/ml, 胆固醇的合成就会受阻, 即人体血液中含有在1ug-5ug/L时会产生降低胆固醇功效阁。成年人血液量为20L, 所需Monacolin K有效剂量为100ug, 若菌株发酵液Monacolin K含量为47.1ug/ml, 服用3ml发酵液即可满足要求。1.3.2 红曲红素 红曲红色素是指将红曲米用乙醇抽提得到的液体红曲色素或从红曲霉的深层培养液中提取、结晶、精制得到的产物。红曲色素是深紫红色液体、粉末或糊状物，略带异臭，不溶于水、甘油，易溶于中性及偏碱性水溶液。在pH4.0以下介质中，溶解度降低，极易溶于乙醇、丙二醇、丙三醇及它们的水溶液中。熔点160-192 ，水溶液最大吸收波长为(4902) nm，乙醇溶液最大吸收波长为470 nm，溶液为薄层时为鲜红色，厚层时带黑褐色并有荧光。对环境pH稳定,不太容易受金属离子(Ca2+ 、Mg2+、Fe2+、Cu2+)和0.1%过氧化氢、维生素C、亚硫酸钠等氧化剂、还原剂的影响。耐热性及耐酸性强，其醇溶液对紫外线相当稳定，但经阳光直射可使其褪色。对蛋白质着色极好，一旦染着，即不掉色杨东林,朱智男,张男.红曲红色素的研究J.辽宁食品与发酵,1998,2.。当中主要呈色成分有6种，分别为红色色素(红斑素或潘红，分子式C21H22O5，相对分子质量350)，红曲红素或梦那玉红(分子式C23H26O5，相对分子质量382)、黄色色素(红曲素或梦那红，分子式C21H26O5，相对分子质量358)、红曲黄素或安卡黄素(分子式C23H30O，相对分子质量386)、紫色色素(红斑胺或潘红胺，分子式C21H33NO4，相对分子质量353)、红曲红胺或梦那玉红胺(分子式C23H27NO4，相对分子质量381)，赵双枝,张彦昊,周建建.红曲红色素的特性概况J.食品科学,2012,4.44-48.结构式如图1.2： 名称颜色分子式分子量结构Monascine黄色C21H26O5358Ankaflavine黄色C23H30O5386Rubropunctatin橙色C21H22O5354Monascorubrin橙色C23H26O5382Rubropunctamine红色C21H23NO4353Monascorubramine红色C23H27NO4382 图1.2为 六种主要提取物结构式1.3.3 桔霉素 红曲霉在产生色素和生理活性物质的同时,还能分泌一种真菌毒素桔霉素。桔霉素具有肾毒性也被称为肾毒素，主要作用的靶器官是肾脏，它能引起试验动物的肾脏肿大，尿量增多，肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，也可导致畸形、肿瘤的发生,甚至可以诱发突变。张朝晖, 王圆, 周立平, 等. 不产桔霉素的红曲霉菌种深层发酵生产莫纳克林KJ. 工业微生物, 2005, 4: 000.针对红曲中存在桔霉素这一现状，日本对红曲中桔霉素含量进行了限定，食品用途的红曲色素中桔霉素含量必需低于0.2 g/g 这样才能保证摄入的安全性，桔霉素分子结构式如图1.3： 图1.3 为桔霉素分子结构式1.4红曲霉的培养1.4.1固态发酵通过固体发酵红曲霉，仍然是当前获取红曲生理活性物质的主要生产方式。红曲米的生产往往取决于以下几个因素：培养基(主要是大米等)、红曲菌株、温度、水分和对污染的控制等。S.Roussos等人认为霉菌的固态发酵物料水活度低，基质混合和扩散困难，因此容易形成温度、底物浓度、产物浓度的梯度和物料的传导系数较小。针对传统固态发酵过程中操作繁琐，劳动强度大，生产周期长等特点，近些年来我国大力发展了厚层机械通风制曲工艺，该工艺以池代窑，机械通风且自动控温，使红曲固态生产达到机械化，提高了生产效率 Sumathy B，Julio C C，Carlos R S，Ashok P. Effect of light on growth，Pigment production and culture morphology of monascus purpureus in solid-state fermentationJ.World J Microbiol Biotech.2008，24:2671-2675.。1.4.2液态发酵近些年，红曲霉的液体深层发酵被更多关注。采用液体获得的红曲色素主要成分为水溶性的“复合色素”，该生产方式具有周期短、产品质量稳定等特点。但是由于液态发酵产色偏低，这在一定程度上制约了其工业化生产。目前日本的红曲色素液态发酵己达到一定的生产规模，我国也有多家单位进行了液态深层发酵技术的研究 Shengli Yang，Hui Zhang，Yaqin Li，et a1. The ultrasonic effect on biological characteristics of Monascus sp J. Enzyme and Microbial Technology 37 (2005) 139-144.。Silvana T等人利用葡萄酒企业废弃的葡萄残渣作为深层发酵的碳源，使红色素产量达到20-22.5g/L。Sumathy Babitha等人的研究证明了黑暗培养有助于色素的生成，红光和蓝光对红曲霉的生长形态均有较大影响，同时提出了在紫色红曲霉中存在光感应系统的假说。1.5洛伐他汀（Manacling k）1.5.1 他汀化合物的简述真菌代谢产物洛伐他汀 ( lovastatin ) 及其衍生物作为3 - 羟基 - 3 甲基 - 戊二酰 CoA 还原酶的抑制剂已广泛用作降胆固醇药物。目前用于人类的这类药物（他汀类药物）主要有天然他汀类和合成他汀类药物。天然他汀类药有洛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀和辛伐他汀, 洛伐他汀由土曲霉发酵生产, 美伐他汀由桔青霉发酵后经链球菌转化获得, 辛伐他汀由洛伐他汀经半合成( 化学修饰侧链) 生产。合成他汀类药物有氟伐他汀、西立伐他汀和阿托伐他汀High-yielding strategy of lovastatin in fungi of Monascusvan Tieghem .JIANG Li-xiang、GE Feng、LIU ChangFaculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650224, China.。胆固醇是甾醇类激素和胆汁酸的前体, 对维持细胞膜的完整性和生物体的健康至关重要。然而, 低密度脂蛋白( L DL ) 胆固醇含量过高时,，可沉积在动脉血管壁导致心血管疾病的发生, 心血管疾 病是发达国家导致死亡的两 大疾病之一。人体有两种胆固醇来源, 一是膳食胆固醇在肠胃道经酰基CoA - 胆固醇酰基转移酶( AC A T ) 酯化生成, 二是由酰基 CoA 经甲基戊酸途径在肝中合成。肝中生物合成的胆固醇约占总胆固醇的6 0% 70 % , 所以它是降脂治疗中的首选目标。美伐他汀于1976年首次从桔青霉和短密青霉分离获得。随后从红曲霉和土曲霉中分离得到洛伐他汀( 又称Monacolin K 和 Mevinolin )。这两种化合物都是催化胆固醇生物合成中限速步骤HMG - CoA 还原酶的可逆竞争抑制剂,对哺乳动物和动物培养细胞的甾醇生物合成都有明显的抑制作用。这些发现刺激了洛伐他汀作为治疗高胆固醇症药物的发展,，通过 对其结构进行修饰改造, 发展出了辛伐他汀和普伐他汀, 以及全合成的氟伐他汀、西立伐他汀和阿托伐他汀。为能有效地通过聚酮合成酶的组合生物合成等遗传工程手段创造具有潜在价值的新化合物,近年来, 对洛伐他汀生物合成及其相 关基因进行了广泛的研究, 取得了突破性的进展。1.5.2 他汀类化合物的结构天然他汀类化合物的结构非常相似, 它们具有相同的羟基六氢环酮聚酮部分,不同的侧链连接在C8 ( R1 ) 和C6 ( R2 )位。洛伐他汀的R1为甲基丁酰侧链, R2为6 - - 甲基;美伐他汀无 6 - 位甲基，天然他汀类化合物都以内酯的形式 存在,在体内需经酶水解成酸式才有活性, 全合成他汀类化合物尽管在结构上与天然他汀不同,但仍具有开环内酯部分,具有所有他汀类化合物竞争抑制HMG-CoA 还原酶的共性结构 Sakai K, Kinoshita H, Nihira T, et al. Identification of mokBinvolved in monacolin K biosynthesis in Monascus pilosus. J. Biotechnol Lett, 2009, 31(12): 1911-1916.。1.5.3 红曲洛伐他汀红曲洛伐他汀的相关研究起步较晚。2005 年，Chen等人以lovB为探针，从丛毛红曲霉M. pilosusK. Sat ex D. Hawksw. & Pitt 人工染色体文库中克隆了含有洛伐他汀合成酶基因簇，经过序列分析确定一段长为42 kb 的DNA 片段中有9 个与土曲霉洛伐他汀合成酶基因高度同源的基因片段MokAMokI（表1.1）。经氨基酸序列分析证实，MokA 和MokB 都含有同已知多聚乙酰合成酶结构相近的KS、AT、DH、MeT、KR 功能域。随后，Chen等人构建了MokA 的置换型基因打靶载体，以潮霉素抗性基因为选择标记转化丛毛红曲霉，得到了44 株转化体，再经DNA 杂交技术筛得一株MokA基因敲除株BCRC38135，后经发酵实验证实其失去了生产洛伐他汀的能力。这说明MokA 很可能参与了洛伐他汀分子中九酮主体的合成。同样，为了研究MokB 在红曲洛伐他汀合成过程中的作用，Sakai等人构建了丛毛红曲霉的MokB 敲除株，并通过HPLC 分析该菌株的发酵产物，发现没有洛伐他汀的生成，却有中间产物Monacolin J 的累积，证实MokB 参与合成洛伐他汀的二酮侧链，与先前的氨基酸序列分析结果相一致。近年来，随着对洛伐他汀生物合成途径及其分子生物学认识的逐步深入，使通过代谢工程手段改良单个或多个酶促反应，进而提高红曲洛伐他汀的产量成为可能 Chen Y P, Tseng C P, Liaw L L, et al. Cloning and characterization of Monacolin K biosynthetic gene cluster from Monascus pilosus. J. J Agric Food Chem, 2008, 56(14): 5639-5646.附录实验其它图片图片一：DNA Maker 的凝胶成像图片二：DNA的凝胶成像有清晰的一条条带说明DNA提取成功图片三：发酵液RNA提取失败图片没有清晰的三条带，干扰的物质较多。图片四：cDNA凝胶成像失败的图片该图显示，DNA已经降解或者脱尾了。图片五：逆转录得到的cDNA经过PCR后的成功图像条带不是很清晰，但是足够说明，PCR成功文献翻译 多响应建模影响莫K降解摘要：储存温度和大气条件包装降解动力学对Monacolin K代理的影响,在红酵母稻米粉使用多响应建模方法进行了调查。发现存储的红曲米粉末在4C下真空包装提高保留Monacolin k多响应建模降解路径。Monacolin K酸成分形成dehydromonacolin K和未知产物在真空中受到boulle刺激,而在大气中氧化产品也形成了。莫纳可林K内酯形式和前体退化到dehydromonacolin K内酯形式,而退化dehydromonacolin K内酯形式在温度高于30C转化成未知产物更加明显。氧化产品也产生Monacolin K内酯在大气中。Monacolin K降解活化能大多以酸的形式表明退化Monacolin K到dehydromonacolin K，相比下内酯的形式更容易受到温度变化影响。关键词：退化 动力学 建模 Monacolin k 存储 红曲米1、序言：红曲米是大米发酵红模具。目前,红曲米被用作天然膳食补充剂控制血清胆固醇,因为它包含一个代谢物Monacolin K或辅酶A还原酶抑制剂。真菌产生的自然Monacolins发生在两个不同的结构：b-hydroxyl酸形式和内酯的形式。酸的形式是水溶性的形式可以绑定还原酶导致减少低密度脂蛋白。内酯是一种脂溶性形式，内酯形式相当重要的亲脂性的属性相比,因为其优越的肠道吸收的亲水酸形式。然而,Monacolin K内酯形式的缺点是,必须转化为酸内酯形式形式，虽然在肝CYP450 3 a4同功酶以绑定与-还原酶和消除体内的肾脏。除了monacolin K，其他药物如环孢霉素和大环内酯类是由同一CYP450同功酶代谢，这导致药代动力学相互作用,这是一种他汀类药物的风险毒性肌病和横纹肌溶解等。 Monacolin K敏感地降解成另一种形式在存储造成温度、水分活度或含水率和oxyge。欧等人报道,monacolin K在红曲米的解决方案是热处理85 - 121C。只有53.29%的monacolin K残留物被在121C 90分钟加热后恢复。此外,李等人的结果表明,内酯形式和酸的形式monacolin K dehy-drated到降解产物,dehydromonacolin K,在存储的红曲米粉60和80C为20天。转换monacolin K dehydromonacolin K不仅减少monacolin K的治疗效果,但也会导致不必要的吸附降解产品进入人体。李等人也调查了相对湿度和阳光对降解红曲米的monacolin K粉的影响在存储20的天内。他们发现,内酯环monacolin K在高相对湿度是水解酸的形式。此外, 在暴露在阳光之下monacolin K和dehydromonacolin K浓度会降低。氧气的影响在众多贡献monacolin K退化进行了研究。Monacolin K组成的heteroannular敏感氧化二烯环,这与Rajh等人的报告显示,Monacolin K暴露在干燥的大气氧15分钟后下降了40%。杂质化合物挥发性氧化产品和产品没有发色团发生氧化过程。氧化不仅会导致失去monacolin K限制了产品的保质期,但也可能产生有毒化合物降解。尽管进行了monacolin K的退化大量的研究,非常有限的信息可以在机制途径和monacolin K动力学退化在红曲米粉末存储。因此,这项工作的目的是探讨影响的储存条件,包括温度和大气条件在包退化动力学monacolin K在红曲米粉末存储使用多响应建模方法。多响应建模技术可以准确估计动力学参数,也有助于构建综合动力学模型来理解系统内部反应机理。2、材料和方法：2.1 微生物3541红紫色TISTR应从微生物资源中心购买,泰国研究所科学技术研究。培养温度维持在4C的马铃薯葡萄糖琼脂和子培养每4周一次2.2 种子培养的准备 3541紫色TISTR孢子悬浮液制备将无菌水加入活跃生长培养PDA和稀释的浓度2每毫升107个孢子。粳米Sao-Hai,获得当地市场在曼谷,泰国,是社保基金用作固体基质。50克的大米是浸泡在蒸馏水过剩1 h,随后转移到500毫升锥形烧瓶。7毫升蒸馏水添加调整的初始含水率大米37 - 40%。大米当时的热压处理过的121C 15分钟。冷却后,米饭接种5%(v / w)的孢子悬浮液和培养7天30C。然后,红曲米是地面和用作种子培养。2.3固态发酵 十克Sao-Hai大米室温下在蒸馏水中浸泡1小时，转移到每个培养皿,然后4毫升的营养汤含有2%(v / w)甘油,0.14%蛋氨酸(w / w),0.01%(w / w)硝酸钠在蒸馏水混合,用于调节大米的水分。在121C 15分钟灭菌后，接种2%(w / w)红曲霉培养。在25C 16.5天培养后,红曲米50蒸干,直到最终含水率小于10%(湿基)。样本通过80孔筛选。红曲米粉末的水分活度(aw)和pH值就会测得。2.4在包装和储存中温度和大气条件对红曲米中monacolin K的影响 8克的红曲米粉是用塑料袋包装层压的聚丙烯,聚乙烯和铝箔在真空和大气包。5包的大小是8英寸的厚度80微米。氧气传输速度在23C和0%相对湿度是0.06立方厘米/ m2,而水汽传输速度38C和90%相对湿度为0.06 g / m2。大气包条件下,氧和氮之间的气体混合物的比例是21:79 v / v,这是冲在400 mbar /铝箔袋。样本储存在4、20、30、40、50C的孵化器长达16周。使用温度计对存储孵化器的室内温度进行检测。在存储期间，含水率、水分活度、pH值,相对湿度和大气中的氧含量和monacolin K酸形式,monacolin K内酯形式,dehydromonacolin K酸形式和dehydromonacolin K内酯形式得到确定。进行两个复制实验。2.5 Monacolin K降解的动力学建模在红曲米粉中的发展 Monacolin K退化率和产品在形成存储被建模为方程式所示。分别为(1)和(2):dmonacolin Kdt kmonacolin Kn 1ddehydromon acolin Kdt kmonacolin Kn 2在t时间(周)、钾反应速率是恒定的,n是动力学反应(Horia,2006)和单位Monacolin K和dehydromonacolin K峰面积/ g衬底干重。基于机制路径,建立动力学模型提出了和翻译数学模型派生出来的微分方程对于每一个反应步骤使用和二阶反应动力学(马丁斯et al .,2005)。这些微分方程数值强度,同时找到了解决办法，格雷申配备了实验数据的k值反应一步预测。数值积分和参数估计是由欧拉和Runge-Kutte。的最佳拟合线被认为是相关系数(R2)。温度对速率常数的依赖进一步与阿仑尼乌斯方程有联系。(3)(Burdurluet al .,2006;Horia,2006):k k0 exp Ea 1 1R T T ref 3速率常数k,k从0开始阿仑尼乌斯常数在参考温度301.95 k不精确的 ,气体常数R(8.314 J /摩尔K),T是绝对温度(K)和Ea是活化能(J /摩尔)。2.6 分析技术2.6.1用高效液相色谱分析monacolin K分离0.5 g的红曲米粉提取10毫升的75%乙醇和超声处理1 h。然后离心样本3000 rpm和4C 10分钟。过滤上清通过0.2 lm膜。根据柴-描述的方法MA、ML、DMA和DML内容在红曲米粉分析了高效液相色谱法。进行了色谱分离亚特兰提斯与粒度5 lm C18柱,100 a和150年4.6毫米。色谱法的使用梯度乙腈执行(洗脱液)和0.1%磷酸(洗脱液B)。梯度条件的35%到75%洗脱液为20分钟,保持在从20到75%的洗脱液28分钟。总分析包括列稳定35分钟。流率为常数与紫外检测1毫升/分钟在237海里。monacolin K酸形式和标准方程内酯形式是y = 30696 x(R2 = 0.998)和y = 40906 x分别(R2 = 0.996),y是峰面积(lVsec),x是向心性Monacolin K酸形式和内酯的形式(毫克/公斤)。 液相色谱-光谱法(质)分析,使用的仪器是安捷伦1100型和默沙东3000 +。色谱分离进行了海波西尔金列3 lm的粒度和150 降到4.6毫米内径是一样的高效液相色谱分析。梯度条件是35%到75%洗脱液为30分钟,保持在75%的洗脱液5分钟。分析包括列50分钟。流量稳定是常数为0.5毫升/分钟。2.6.2 水分含量、水分活度、样本pH值、相对湿度和气态氧的定量分析含水率、水分活度和pH值的测定描述的方法是约翰斯图尔特证明的。空气的相对湿度大气包来衡量湿度指示器。气态氧的浓度分析气相色谱仪,0.2毫升的气体包被一个注射器通过硅相连包装薄膜表面。然后注入气体样品气相色谱法与CTR列6英尺长4毫米的内径的多孔聚合物和外径8毫米的一个拥挤的活化分子筛举行常数温度60C。注入温度为150C和气体检测使用一个热导检测器在150C。载气是氦50毫升/分钟的流量和O2、N2的百分比计算的探测器的响应。2.7 统计分析统计分析是由方差分析展示出，平均值的差异是由邓肯的决定多个测试范围，重要影响因素物质测定在置信水平95%以上。3 结果与讨论初始含水率、aw和pH值的红曲米粉末在这项研究中为5.770.35%(湿基),0.310.01分别为4.480.15。在16周储存水分样本的内容几乎是常数的范围之内5.22 -6.47%,而aw和pH值的范围内分别为0.28 - -0.31和4.47 - -4.79。氧气的比例内容在大气包是20.47 - -21.85%。3.1储存温度和大气条件对红曲米monacolin K稳定性的影响图1中 a和b现在温度和大气状况对manacling k含钾量的比率的影响，在任何时间manacling k含钾量(C / C0)除以最初的时候红曲米粉。结果表明:减少的MA(图1)和ML(图1 b)存储时间内增加。这表明monacolin k酸和内酯在存储形式是不稳定的。特别是在高存储温度50C,其余的MA是7.52和-16.48%其余的ML在真空和大气包存储后4周是0 - 5.70%。这表明monacolin K是热敏的。观察红曲米储存在40 - 50C MA下降最为显著。此外，在所有真空和大气情况下，任何温度ML下降都极为显著。这个结果与李（发现在60和80C热处理20天红曲米粉中MA和ML下降最为显著）一致。图1 MA(a)水平的变化,ML(b),DMA(c)和DML(d)中存储的红曲米粉末真空包装(实线)和大气包下(破折号线)在4C(菱形四边形),20C(三角形),30(圆),40C(广场)和50C(交叉)表示。缩写:DMA,dehydromonacolin K酸形式;DML dehydromonacolin K内酯形式;MA,monacolin K酸形式;ML,monacolin K内酯的形式。在同一存储温度下，MA和ML在大气中的含量低于在真空中的含量。例如,MA的保留和ML在大气中为38.261.00%而在真空中为10.892.78%,分别存储在40C真空中5周,而MA的保留量16.982.79%和ML不是大气包在同一存储条件下检测到。这表示,MA和ML大气条件下易被氧化分解，monacolin K退化影响因素如光和水分含量。这些数据同Rajh 的实验结果相一致（他提出提纯monacolin K暴露在干燥的的大气中15分钟会减少40%）。MA和ML在4真空储存16和12周后的最大剩余百分比为75.451.74%和28.754.11%,分别为(图1 a和b)。相比之下,MA在 50C储存样品中MA退化最快剩余百分比为6.531.40%,而ML在大气中储存四周检测不到(图1 a和b)。关于dehydromonacolin K化合物，除了DML在40-50储存时减少，其他存储时间内DMA和DML都是增加的(图1 c和d)。这些结果表明, monacolin K的酸和内酯在储存期间通过脱水转化为他们的dehydromonacolin k形式。此外, 由于DML储存期间的减少DML可能被转化为未知的产品,特别是在高温下的40和50C真空和大气中 (图1 d)。在4真空储存MA转化为DMA，ML转化为DML的最小百分比分别为49.102.90%、 57.544.10%。3.2红曲米中manacling k 退化的动力学建模考虑monacolin K的降解途径,前面的结果显示,MA储存中变成了DMA(图1 a和c)。然而,内酯之间的转换形式和酸形式没有在本研究提出因为内酯环之间的转换和羟基酸只出现在液态或在高相对湿度条件空气固态(75 - 92.5%)。空气的相对湿度在这项工作只有大气压下28 - 31%的范围。质量平衡计算的结果表明,不平衡反应物之间的质量主要以酸的形式(MA)和(DMA)存在。例如，MA在30C真空下放置16周，,识别和量化(DMA)达到最初的73%左右。在这一点上,可能除了DMA,其他降解产物或未知化合物也可以形成。因此,未知化合物的形成可以从方案1动力学模型看出MA的脱水成DMA和未知的产品。方案一结果表明,在真空中的第一阶段反应，方案1与实验数据相符(图2)，零阶和二阶反应动力学显示低价值的相关系数(R2)(数据未显示)。多响应建模技术清楚地证实,MA在真空存储中退化成DMA和其他未知化合物，MA的退化和DMA的形成通过一阶动力学反应显示高值R2。储存温度增加，k1和k2的值增加，这个结果与Ou发现一致，他发现使用简单的动力学模型可以证明红曲米中的monaclin k在90-121通过一阶反应退化。为了确定MA在大气压下的降解反应机理，实验结果和方案1的反应结果相符，结果很好的证明了利用建模证实一阶反应。然而，K2的真空和大气值