植病研究法---细菌病害的研究法ppt课件

第三部分植物细菌病害研究技术 第一节植物病原细菌的鉴定第二节病原细菌的分离培养第三节病原细菌培养性状观察第四节致病性测定第五节细菌的形态观察 第一节植物病原细菌的鉴定 1 细菌病害标本的检查 1 症状的观察植物细菌病害表现各种类型的症状 不同属的细菌侵染植物后引起的症状有所不同 棒形杆菌属细菌主要引起萎蔫 假单胞菌属细菌主要引起叶斑和叶枯 少数枝枯 蔫萎和软腐 黄单胞菌属细菌主要引起叶斑和叶枯 土壤杆菌属细菌主要引起瘤肿 少数其他畸形 欧文氏菌属细菌主要引起软腐 少数蔫萎和枝枯 这样的区分虽然不是绝对的 但是指出它们之间的关系 在诊断上是很有意义的 许多细菌性病害的病斑带有水渍状 有时可以作为诊断的特征 但并不是所有细菌病害都是这样 病部有时有菌脓排出 菌脓灰白色到黄色 珠状或其他形状 干燥后在表面形成菌膜 第二节病原细菌的分离培养 植物病原细菌一般都是用稀释分离法 病原细菌在组织中的数量很大 稀释培养可以使病原细菌与杂菌分开 形成分散的菌落 容易分离得到纯培养 组织分离法对病原细菌是不适用的 原因是它不能使病原细菌与杂菌分开 杂菌生长快 会抑制病原细菌的生长 稀释分离有以下两种方法 1 培养皿稀释分离法 取灭菌的培养皿3个 每个培养皿中加灭菌水0 5ml 切取约4mm见方的小块病组织 经过表面消毒和灭菌水洗过3次以后 移在第一个培养皿的水滴中 用灭菌的玻棒将病组织研碎 静置10 15min 使组织中的细菌流入水中 配成悬浮液 然后用灭菌的移植环从第一个培养皿中移植3环到第二个培养皿中 充分混合后再移植3环到第三个培养皿中 然后 将溶化的琼胶培养基冷却到45 左右 倒在三个培养皿中 冷却凝固后 将培养皿翻转 在适温下培养 培养皿用记号笔注明分离材料 日期和稀释编号 细菌悬浮液的配法有时影响分离的效果 一般植物病原细菌 用灭菌水稀释是适宜的 有时改用灭菌的生理食盐水 0 85 的NaCl 或肉汁冻培养液稀释比较好 如水稻白叶枯病细菌 用蛋白胨水或粘土悬浮液稀释的 培养后形成菌落的数目比用清水稀释的多 粘土的作用大致是细菌团聚在土粒上 更容易形成菌落 2 平板划线分离法 取小块病组织 经过表面消毒和灭菌水洗过2次以后 放在灭菌载玻片上的灭菌水中 用灭菌玻棒研碎 静置一定时间 用灭菌的移植环蘸取以上组织液在琼胶平板上划线培养 先在平板的一侧顺序划3 5条线 再将培养皿转60 将移植环灭菌后 从第二条线末端 顺序划出3 5条线 目的都是使细菌分开形成分散的菌落 划线分离法的关键是要等到琼胶平板表面的冷凝水完全消失后才能划线 否则细菌将在冷凝水中流动而影响形成单个分散的菌落 为了加快消除冷凝水 可以将培养皿在37 的温箱中放一二天 或者在无菌的条件下 将培养皿的盖打开 翻转培养皿斜靠在盖上 在50 的干燥箱中干燥30min 植物病原细菌的分离还需注意 1 分离材料新鲜要从新鲜的标本和新的病斑分离 存放太久的标本 其中病原细菌的生活力减弱 而腐生性细菌则滋长很快 从这种组织分离到的大都是腐生菌 分离用的标本最好是夹在吸水纸中邮寄 放在塑料袋中保湿是不适宜的 标本保存的时间较长而不容易直接分离成功 可以经过接种后再分离 例如 分离软腐病细菌时 由于腐烂组织中往往杂有大量的腐生菌 可以挑取少许腐烂组织针刺接种在相应的健全组织上 发病以后再从接种的组织上分离 2 适宜的培养基 分离失败的原因 有时是由于培养基不适宜 一般来说 寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格 同时 一种适宜于纯培养的培养基 细菌群集没有其他杂菌干扰 不一定适宜于分离 细菌分散而单独存在 同时还可能有杂菌干扰 因此 分离时要选用适当的培养基 有时要用选择性培养基 但有时失败的原因不是培养基的成分不适宜 而是由于培养基的酸度不适当或存放的时间太长 因此 在灭菌后和使用前 最好是再核对一下培养基的酸度 二 分离培养基 1 通用培养基 NA培养基 2 属和种的选择性培养基 1 土壤杆菌属 Agrobacterium 一般是用甘露糖醇培养基甘露糖醇15g硝酸钠 NaNO3 5g硝酸钙 Ca NO3 z 4Hz0320mg磷酸氢二钾 K2HPO4 2g氯化锂 LiCl 6g硫酸镁 MgSO4 7H20 0 2g溴百里酚蓝0 1g琼胶15g蒸馏水1000ml灭菌后酸度是pH7 2 培养基呈深蓝色 土壤杆菌属细菌的菌落圆形 凸起 发亮 最初浅蓝色 以后深绿色 溴百里酚蓝抑制革兰氏反应阳性的细菌 氯化锂抑制假单胞菌属细菌 以上培养基 已有选择性培养基的作用 以甘露糖醇作为碳源是它的特点 2 假单胞菌属 Pseudomonas 没有特殊的营养要求 许多培养基都可用于分离 常用的培养基有 甘油酪朊水解物培养基甘油10ml蔗糖10g酪朊水解物1g氯化铵 NH4c1 5g磷酸氢二钠 Na2HPO4 2 3g硫酸十二烷基钠0 6g琼胶15g蒸馏水1000ml pH值6 8由于培养基中含有十二烷基硫酸钠 已经有一定的选择性 金氏培养基B King smediumB 分离有荧光的假单胞菌蛋白胨20 0g甘油10 0g磷酸氢二钾 K2HPO4 1 5g硫酸镁 MgSO4 7H2O 1 5g琼胶15 0g蒸馏水1000mlpH7 2 荧光假单胞菌在培养基中产生可扩散的青或褐色的色素 紫外线照射显示青到蓝色 此培养基也可用于欧文氏菌属 Erwinia 细菌的分离 Kelmen 1954 TTC培养基 蛋白胨10 0g酪朊水解物1 0g葡萄糖5 0g琼胶15 0g蒸馏水1000mlpH7 0分装100ml 灭菌后 加过滤灭菌的1 2 3 5一氯化三苯基四氮唑 TTC 的水溶液到灭菌冷却到55 的培养基中 使浓度最后达到0 005 青枯菌P solanacearum培养2天后 致病力强的野生型菌落白色 或中间有一淡红色点的菌落 致病力弱或丧失致病力的菌落深红色 边缘带蓝色 3 黄单胞菌属 Xanthomonas 蔗糖蛋白胨培养基 Aaywood1960 蔗糖2 0 蛋白胨0 5 磷酸氢二钾 K2HPO4 0 05 硫酸镁 MgSO4 7H20 0 025 琼胶1 5 蒸馏水1000mlpH7 2 7 4这是分离Xanthomonas属细菌最常用的培养基 也适用于假单胞菌属 欧文氏菌属和有些棒杆菌属的细菌 SX琼胶培养基 SchaadandWhite 1974 可溶性淀粉10g牛肉浸膏5g磷酸二氢钾 KH2PO4 2g琼胶15g蒸馏水1000ml适用于分离可以水解淀粉的X campestris的致病变种 必要时还可以加1 甲基紫B的20 的酒精溶液lml 甲基绿的1 水溶液2ml 和环己酰亚胺250mg 提高它的选择性 4 欧文氏菌属 Erwinia 前面介绍的培养基有许多也适用于欧文氏菌属 以下是对欧文氏菌具有特色的结晶紫聚果胶培养基 将搅碎器预加热 加500ml煮沸的蒸馏水 将以下成分依次加入 低速搅拌 结晶紫的10 水溶液1 0mllmol L氢氧化钠 NaOH 4 5ml氯化钙 CaCl2 2H2O 新鲜配制的1 水溶液4 5ml琼胶2g硝酸钠 NaNO3 1 0g随后将聚果胶酸钠加入 高速搅拌15s 分装三角瓶灭菌后要立即倒入培养皿 制成平板干燥后使用 欧文氏菌属细菌有分解果胶酶活性的 形成中间有凹陷的菌落 5 棒形杆菌属 Clavibacter 此属细菌有些是难培养的 酵母葡萄糖矿物盐琼胶培养基 YGM 是很好的一种 酵母浸膏2 0g葡萄糖2 5g磷酸氢二钾 K2HPO4 0 25g磷酸二氢钾 KH2PO4 0 25g硫酸镁 MgSO4 7H2O 0 1g硫酸锰 MnSO4 0 15g氯化钠 NaCl 0 05g硫酸铁 FeSO4 7H2O 0 005g琼胶15 0g蒸馏水1000ml适用于分离棒杆菌 也适用于Xanthomonas 第三节培养性状 培养性状对细菌的鉴定是很重要的 不同属的植物病原细菌 它们的培养性状显然不同 不同种的植物病原细菌 很难根据它们的培养性状区别 但可以作为最后鉴别的参考1 培养性状的描述培养性状要分别在培养液 琼胶斜面和琼胶平板上观察 描述时 要指明培养基 培养时间和培养温度等 1 培养液培养性状 肉汁冻培养液常常用来观察培养性状 培养性状主要是指生长量 表面生长情况 色素的产生 有无沉淀和特殊气味等 表面的生长情况包括是否形成菌膜和菌环以及它们的厚度 细菌是否形成团状的漂浮物 培养液表面下生长的情况包括混浊程度 是均匀的云雾状还是形成团粒状和片状的菌团 底部的性状则指有无沉积物和沉积物的形状 2 琼胶斜面培养性状 斜面的培养性状 生长量的多少 菌苔的形状 颜色光泽和粘度 以及培养基的颜色和有无特殊的气味等 细菌学上往往将菌苔的形状分为丝状 念珠状 薄膜状 分枝状和根状等 菌苔的表面有光滑的 不平整的和有皱褶的 菌苔的颜色也不同 质地有粘质的 膜质的或蜡质的 菌苔有透明的 半透明或不透明的 表面有暗色的或发亮的 3 琼胶平板培养性状 了解平板上菌落的特征 有助于判断分离是否正确和挑取所需的菌落 琼胶平板上菌落的观察主要是 形状和大小 颜色和光泽 表面是否隆起或凹陷 边缘的形状 透明度和粘度 培养基颜色的变化等 2 细菌的色素 非水溶性色素 不能扩散到培养基中 所以菌落表现不同的颜色 而培养基则不改变颜色 黄单胞菌属的细菌能够形成非水溶性的黄色素 所以菌落是黄色的 不能将形成黄色菌落的植物病原细菌都当作黄单胞菌属的细菌 如玉米蔫萎病细菌 曾经分在黄单胞菌属中 但是根据它的黄色素与黄单胞菌属的细菌显然不同 现在已经分在泛生菌属 Pantoea 欧文氏菌属的细菌 除去有些可产生非水溶性的蓝色素外 有的也能产生非水溶性的黄色素 菌落也呈黄色 有些棒杆菌属细菌也能形成黄色菌落 水溶性色素 扩散到培养基中就能使培养基变色 其中有些色素是荧光性的 假单胞菌属细菌能否产生荧光性色素 是很重要的分类特征 色素的产生与培养基有关 如在新鲜牛肉配成的培养基上 荧光性色素的产生要比用牛肉浸膏配成的更为明显 为了测定假单胞菌属细菌色素的产生 可用特殊的如金氏培养基 有两种配方 培养基I培养基 蛋白胨2g2g硫酸钾 K2SO4 lg一甘油1g1g氯化镁 MgCl2 0 14g一磷酸氢二钾 K2HPO4 一0 15g硫酸镁 MgSO4 7H2O 一0 15g琼胶 水洗 2g2g蒸馏水100ml100ml酸度调节到pH7 2 培养基I适用于观察非荧光性色素 培养基 适用于观察荧光性色素 荧光性色素的产生可以直接观察或用紫外线照射观察 四 细菌的计数 细菌的繁殖量 植物接种和血清学方面的研究都要求知道细菌的数量 细菌计数的方法有 测数器计数法 混浊度计数法 平板菌落计数法 前两种方法是计数活的和死的细菌的总数 后一种方法是测定活细菌数目 1 测数器计数法 纽鲍尔 Neubauer 血球计数板是常用的一种 它是一块很厚的载玻片 上面划有每边长为O 05mm的小方格 方格的深度是0 1mm 测数时 先将盖玻片放在计数计上有刻度的位置 从盖玻片的一侧加小滴适当稀释的孢子悬浮液 然后在显微镜下观察每小格中孢子的数目 观察80小格 以它的平均数乘以4000000 就是每毫升悬浮液中孢子的数目 测定时注意事项 1 取待测稀释菌悬液向血球计数板加样前 须将菌悬液充分摇匀 2 加样过程中 应避免将菌液滴在盖玻片 3 由于菌体在计数室中处于不同空间位置 须在不同焦距下才能观察到 故观察时须不断调节微调 计数菌液中全部菌体 尽量避免遗漏 实验步骤 1 镜检计数室 对计数室进行镜检 若内有污物 清洗后才能计数 2 加样液 先在血球计数板两个计数室部位加盖玻片 再用无菌玻棒或滴管沾取待测菌悬液稀释液 已摇匀 从盖玻片边缘滴加 使菌液沿缝隙靠毛细作用自行进入计数室内 静置5min 3 显微镜计数 将血球计数板置于载物台上 先用低倍镜观察 后换高倍镜观察计数 位于格线上菌体只计上边线和左边线上的 如果出芽酵母芽体大小达到母细胞一半时 可计作两个菌体 选择五个视野 在每个视野内任意选择五个小方格计数 求出每个小方格菌体数量平均值 4 根据公式计算每ml菌液含菌数 5 测量完毕后 取下盖玻片用水冲洗血球计数板 严禁用硬物刷洗 晾干 放入盒内保存 2 混浊度计数法 测定悬浮液中细菌 酵母菌或孢子的数目 可先测定它的混浊度 然后与标准比较而后决定数目 麦法兰云度计可作为混浊度的比较标准 测定混浊度更精确的方法是用光度计 测定无色细菌悬浮液 一般是用波长450nm的光 或者用蓝色滤色片 如是有色的肉汁冻培养液 则用波长650nm的光较好 或用橙红色滤色片 3 平板菌落计数法 将细菌悬浮液定量稀释后 取一定量不同稀释度的细菌悬浮液 分别在琼胶平板上培养 从形成菌落的数目和稀释度 可算出每毫升中细菌数 细菌悬浮液一般都是按10倍的比例稀释 稀释以后 每管中吸lml或0 1ml加到灭菌的培养皿中 然后加溶化并冷却到50 左右的琼胶培养基 充分混合后培养 计算平板上菌落的数目 还有一种方法是先制成琼胶平板 取稀释的悬浮液加在平板上 然后用灭菌的 L 形玻棒将菌液涂匀 培养后计算菌落数目 涂抹法的好处是细菌都在平板的表面 可以避免培养基中下层细菌的生长条件不同的影响 一般是只将3个稀释度较高的 如5 6 7三管 培养测定 这要根据具体情况决定 由于细菌悬浮液是成10倍稀释的 前一个稀释度在琼胶平板上菌落的数目大致是后一个稀释度的10倍 如果差别很大 说明实验有差错 平板菌落测数法虽然比较费时 但是不需要特殊的设备 并且所测定的是活的细菌 平板菌落测数法测得菌落的数目 一般都要低于实际数目 由此可见 平板菌落计数法测定的是可形成菌落单元 colonyformingunit CFU 并不是细菌的数目 当然CFU和实际数之间是成正相关的 第四节致病性的测定 病株上分离到的细菌 确定它的致病性 是一种细菌病害鉴定的关键 一般来说 致病性的和腐生性的细菌是很难从形态和其他细菌学性状上区别的 黄单胞菌属的植物病原细菌是比较容易鉴别的一类 这类细菌大都是致病性的 有很明显的形态特征 单根极鞭 菌落的性状也比较典型 而其他几个属的植物病原细菌 尤其是假单胞菌属细菌 就没有这样明显的特征可以作为初步鉴别的依据 因此 一般的工作顺序是先确定致病性 完成符合柯赫法则的要求 然后再进行其他细菌学测定 在致病性没有确定前就进行一系列的细菌生理生化学测定 最后可能发现分离到的并不是真正的病原细菌 因此 宁可多花些时间确定致病性 进度似乎较慢 事实上可能更快一些 1 过敏性反应 致病性的初步测定 为了确定分离到的大量菌种哪些是致病性的 用常规接种方法比较费事 有的要经过相当长的时间 用植物的过敏性反应 来快速筛选致病性细菌 方法是将浓度107 ml的细菌的悬浮液注射在烟草叶片的细胞间致病性细菌往往在6 24h内就在注射点周围出现过敏性枯斑 而腐生性细菌则不表现这种反应 注射Pseudomonas属细菌的 一般在6 l0h即出现枯斑 注射Xanthomonas属细菌的要10 24h 注射的植物要在光照良好的温室中培养 温度在25 35 间 由于枯斑的出现很快 因此也可用离体叶片接种的方法 温度和光照便于控制 除去烟草外 其他植物也能用来测定过敏性反应 如棉苗的子叶可以测试水稻白叶枯病细菌 酸浆属植物可用来测定欧文氏菌属的细菌等 蚕豆叶片也是很好的试验材料 过敏性反应的测定只能作为一种参考性状 以此可以初步区别分离到的菌种是否为致病性的 但是它的适用范围还要经过更多的实践经验 因此 致病性的最后确定 一般还要用常规的接种方法 2 常规接种技术 1 接种物的准备繁殖的细菌一般都配成悬浮液接种 有时也可直接用来接种 至于测定菌系致病性的强弱和比较品种抗病性的差异等 则规定一定的浓度为妥 浓度太低有时接种不易成功 针对不同的病原细菌和实验的要求 经过实践确定适当的浓度 一般可用每毫升含3亿个细菌 3 l08CFU m1 的菌液 接种用的细菌要注意菌龄 菌龄老则细菌致病力显著减退 接种后甚至不发病 2 各种类型细菌病害的常用接种方法 1 叶斑病和叶枯病的接种叶斑和叶枯是最常见的细菌病害 接种的方法很多 但不外乎使细菌从伤口或气孔等自然孔口侵入叶片 由于植物病原细菌不能从表皮直接侵入 也不像真菌那样以孢子萌发形成的芽管从气孔侵入 因此要求在接种的时候就有较多的细菌进入气孔内 针刺接种喷雾接种高压喷雾接种摩擦接种 接种方法 1 针刺接种 针刺接种是很有效的接种方法 为了测定分离到的细菌的致病性 一般都先试用这种方法 比较简单的办法是 用接种针从琼胶斜面上挑取少许细菌直接穿刺叶片接种 为了提高接种效率 可以将许多针固定在橡皮塞或软木塞上 蘸取细菌悬浮液接种 一般称为多针接种法 针刺接种后的植物 不一定要求保湿 但有时保湿的效果要好一些 2 喷雾接种 将细菌悬浮液喷布叶面是常用的接种方法 在叶背更好 悬浮液的浓度一般是106 107CFU ml 有时浓度高一些更好 植物在接种后要保湿24 48h左右 如接种前也保湿24h 使气孔张开 则效果更好 大田喷雾接种 保湿是很困难的 因此多半是在傍晚进行 由于喷雾接种的细菌只有很少一部分能够从气孔进入叶片内 接种的效率较低 为了提高接种的效率 喷雾时可以在细菌悬浮液中加适当的展布剂 如吐温20或各种洗涤剂等 吐温的用量在0 1 1 0 左右 3 高压喷雾接种 细菌悬浮液用高压喷雾方法接种 会有较大量的细菌进入组织内 喷过的叶组织 充水而呈水渍状 有利于细菌的蔓延 接种的效率高 并且发病一般也较重 许多细菌病害在暴风雨后迅速蔓延 可以说是天然的高压喷雾接种造成的 接种细菌悬浮液的浓度 一般不宜超过5 106CFU ml 温室接种的植物 接种后一般保湿24 48h 有时不保湿也能发病 高压喷雾也适用于大田接种 在每4000ml左右稀释的细菌悬浮液中 还可加容量15ml的金刚砂 600目 加压206841 413682Pa在傍晚接种 接种后不保湿 方法与汁液传染的植物病毒病的大田接种相似 4 摩擦接种 少量植物接种 可以在叶片上撒少量金刚砂 600目 然后用纱布蘸取细菌悬浮液 浓度约107CFU m1 在表面轻轻摩擦接种 叶斑和叶枯类型的细菌病害 还可以用将细菌悬浮液注射到叶片组织或灌注在心叶中 如玉米的喇叭口 的方法接种 有些在维管束组织中蔓延很快的叶枯病 如水稻白叶枯病和玉米细菌性叶枯病 可以用在细菌悬浮液中浸过的剪刀剪叶的方法接种 2 肿瘤和茎秆枝条病害的接种肿瘤和茎杆枝条病害的接种 一般都是用针刺或注射的方法接种 3 腐烂病的接种腐烂病一般都是用针刺或注射的方法接种 块根和块茎还可以剖开或切成薄片 在切面上滴细菌悬浮液接种 植物病原细菌很少引起根腐 块根除外 但茎腐还是常见的 4 蔫萎病的接种蔫萎病的接种可以采用针刺 注射 蘸或灌注土壤等方法接种 使细菌侵入到寄主维管束组织中 第五节细菌的形态 革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状 它的机制还不完全了解一种解释是碱性染料可以穿过细胞壁与细胞原生质的酸性成分起作用 加碘以后形成复合体 革兰氏反应阳性的细菌 它的细胞壁阻止褪色剂对复合体中染料的提取 所以不褪色 革兰氏反应阴性的细菌 可能由于细胞壁中含有较多的类脂物 可以被褪色剂溶解 因而染料可被提取而褪色 还有一种解释认为碘液是起染媒剂的作用 与结晶紫以及细胞中核糖核和镁离子形成复合体 这种复合体不容易被褪色 革兰氏染色反应阴性的细菌不形成这的复合体 结晶紫就容易褪色除去 方法及其他注意事项 略 结果 阳性菌 紫色阴性菌 红色 由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立 Figure1 Gram Figure2 Gram 鞭毛染色 植物病原细菌的染色 除去革兰氏染色外 最重要的是鞭毛染色 鞭毛的有无 数目和着生部位是重要的分类和鉴定性状 一种植物病原细菌 经过革兰氏染色和鞭毛染色 大致已经可以确定它的属 细菌的鞭毛很细 只有0 02 0 03 m 一般光学显微镜看不清 鞭毛上沉积了染剂后才能看到 这是所有鞭毛染色法的根据 由于染剂也可以在载玻片上沉积 所以要用非常清洁的载玻片 染剂处理的时间很重要 处理时间太短 鞭毛上没有足够的沉积物就看不清楚 处理时间太长 载玻片上的沉积物太多则影响检查 1 载玻片的准备 鞭毛染色要用新的或没有损伤的载玻片 先在浓铬酸洗涤液中浸24h 清水洗过后用蒸馏水洗 再在95 的酒精中浸过后 将玻片通过火焰几次 到载玻片边缘的火焰呈桔黄色为止 通过火焰的载玻片 放在多层吸水纸上任其冷却 洗净的载玻片也可以浸在盛有95 5酒精的扁平染色皿中 使用前再通过火焰烧去酒精 检验是否洁净的标准是在载玻片上加1滴蒸馏水 如果水滴很快而且均匀地扩散开来 表示载玻片是清洁适用的 2 细菌悬浮液的配制 配制细菌悬浮液时要注意菌龄 最好是用在斜面上培养18 24h的 但生长较慢的 如黄单胞杆菌属 细菌 可用适当延长到36 48h的 染色前 菌种每隔一二天移植一次 必要时可连续进行几次 以增强细菌的活性 配制的时候 在培养斜面上加灭菌水3 5ml 可根据浓度增减 静置 可以稍加摇动 但不要振动 一定时间 细菌就散开而形成悬浮液 放置的时间一般是5 30min 产生胶质的细菌则需要30min或更久一些 放置时间太