琼脂糖凝胶电泳注意事项ppt课件

琼脂糖凝胶电泳操作及其注意事项 欢迎大家一起交流 什么是电泳 带电颗粒在电场作用下 向着与其电性相反的电极移动 称为电泳 生物大分子如蛋白质 核酸 多糖等大多都有阳离子和阴离子基团 称为两性离子在电场中 带电颗粒向正极或负极迁移 迁移的方向取决于它们带电的符号 按分离原理的不同 电泳分为4类 移动界面电泳区带电泳等电聚焦电泳等速电泳 电泳有几类 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离 鉴定DNA RNA分子混合物的方法 以琼脂凝胶作为支持物 利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应 达到分离混合物的目的 琼脂糖凝胶电泳原理 琼脂糖凝胶电泳的操作 操作步骤配胶点样电泳成像拍照EB染色胶图分析 1 配胶 按所要分离的DNA分子的大小 称取适量的琼脂糖粉末 放入锥形瓶 加适量1 TAE电泳缓冲液 然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明状 适当冷却后倒入胶托 胶完全冷凝后放入电泳槽 电泳槽里的缓冲液必须没过胶面 2 点样 根据样品不同可分两种点样体系 A 样品 6XloadingbufferB 样品可直接点样 如ssp 最后记得点marker 并摆正胶的位置 点样 3 电泳 点完样后连接电源 设置好电源的参数 开始电泳 当溴酚兰的带 蓝色 的移动至一定长度即可停止电泳 电压要求 20V CM胶 在样品出孔用低压 3V CM 15min 然后调回标准电压 跑出的条带较好 电泳槽 4 EB染色溴化乙锭是一种扁平分子 可以嵌入核酸双链的配对碱基之间 在紫外线照射EB DNA复合物时 出现不同的效应 注意 严格区分污染区和非污染区 不把污染区的物品拿到非污染区 碰过EB的手套要及时丢弃 EB染胶区 5 成像拍照Tanon 2500数码凝胶图像分析系统把图像摄录 处理 打印一体化 采用高分辨率CCD 高质量 高清晰度 保证摄录凝胶图像在低照度下的灵敏度 不掉失条带 Tanon 2500数码凝胶图像分析系统 6 胶图分析以SBT PCR为例 主要做A B DR三个位点 每个位点条带大小不同 注意事项 注意事项 一 配胶 1 电子称的使用 要时刻注意保持电子称的精确性 保持清洁 根据不同的浓度的胶称琼脂糖 2 加TAE的量要适当 以免配出来的胶太薄导致胶孔太浅或浓度太低 3 倒胶前胶托一定要洗干净 并擦干 倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽量不要产生气泡 若胶液的温度太高要顶在胶托防止胶托变形 二 点样电泳 1 96孔塑料板要干净 loading要点均匀 控制在1 2ul的量 并做好对应标记 2 加样时 枪头要上紧 吸样均一准确 排液时吸头不要有残留 3 点完样后及时盖上胶垫 注意不要盖反 4 点电泳前最好检查待用胶是否合格 点电泳时要对准胶孔 尽量点完所有的样 5 点完样勿忘点marker并摆正胶位 电泳仪正负极不要插反 电泳槽的盖子要盖紧 三 EB染色 1 切胶要准 取胶要稳 泡胶要慎 避免EB溅起 2 碰到EB的手套要及时丢弃 3 EB液要适时跟换 盘子要清洗 4 抹布要严格区分 不可交叉使用 四 TanonTanon 2500数码凝胶图像分析仪的使用 1 使用前要注意清洁 以免影响胶图的清晰度 2 照胶时尽量减少开紫外灯的时间 3 拍照时先关摄像头再关紫外灯 不可颠倒 严格按照照胶的流程进行 4 照好的胶及