生物技术概论-细胞工程

1 生物技术概论 细胞工程 生物工程专业课程 吉林工程技术师范学院 2 第一节细胞培养的设施 条件及方法 3 研究基础 细胞学操作对象 细胞或组织基本技术 细胞与组织培养 4 一 细胞工程的基本原理 1 1细胞工程的概念及研究范畴1 2细胞工程的基础知识1 3细胞工程的理论核心 5 1 1细胞工程的概念及研究范畴 概念 应用细胞生物学和分子生物学方法 借助工程学的试验方法或技术 在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性 以获得特定的细胞 细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科 研究范畴 广义的细胞工程包括所有的生物组织 器官及细胞离体操作和培养技术 狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术 根据研究对象不同 细胞工程可分为动物细胞工程 植物细胞工程和微生物细胞工程 6 1 2细胞工程的基础知识 生物界有两大类细胞 原核细胞与真核细胞 原核细胞 DNA裸露于细胞质中 不与蛋白质结合 易于人们的遗传操作 生长迅速 胞内无膜系构造细胞器 是细胞改造的良好材料 真核细胞 胞内有细胞核和众多膜系构造细胞器 一般都有明显的细胞周期 处于有丝分裂时期的染色体呈现高度螺旋紧缩状态 既不利于基因外钓 也不利于外源基因的插入 可采取一定的措施诱导真核细胞同步化生长 植物细胞外还有数层以纤维素为主要成分的细胞壁 7 动物细胞结构图 细菌细胞模式图 8 1 3细胞工程的理论核心 1 3 1细胞全能性概念1902年 德国植物学家Haberlandt提出了细胞全能性的假想 1934年 White首次定义为 每个植物活细胞在合适的条件下 都有发育为胚的能力 70年代 扩大了以上定义范围 认为 植物活细胞不但能形成胚状体 而且能发育为完整植株 80年代初 认为 任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体植株的那种合成药用成分的能力 即培养细胞的药物生物合成的能力 9 目前细胞全能性定义 每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢 应激性和自体复制等生命基本属性 在合适的离体培养条件下 可以展现这些特征属性 10 1 3 2植物活细胞具有生命特征属性生命特征属性细胞具有生命特征属性离体培养细胞展现该物种的生命特性 11 生命特征属性 新陈代谢 应激性 自我复制 12 1 新陈代谢 是指维持生命各种活动过程中的化学变化的总称 生物体总是不断地从环境中摄取物质和能量 来维持自身 又有同等量的能量 以热或者其他形式排出体外 一旦新陈代谢停止 生命活动也就停止 生物体就会瓦解 即 生物体要维持生命 必须吐故纳新 13 2 应激性 是指生物体随环境变化的刺激而发生相应反应的特征 生物体的生存离不开环境条件 而环境又是不断变化的 除四季有规律的变化外 还有些急剧变化 如干旱 涝灾 高温 低温 昆虫侵害等等 生物体具有 某种机制 来感知和正确估计环境的变化 以便在体内加以校正 保证体内平衡 来应付突变的环境 14 3 自我复制 是指生物体利用自身作模板 通过代谢作用 复制出完全相同的结构 或产生也具有相同的自体繁殖能力的突变结构 前者为 遗传 后者为 变异 遗传 保证了物种的纯化 变异 为物种的进化提供依据 自我复制实现了遗传与变异的矛盾统一 15 细胞具有生命特征属性生物体由细胞组成 所以细胞也具有生命特征属性 细胞是生物体结构和功能的基本单位 核酸是构成细胞的重要物质 携带着遗传信息 并具有自我复制的能力 但当单独存在时 不能表现出生命特征属性 只有组成细胞时 才能表现完整的生命活动 16 同一个体每一个体细胞所含的基因是相同的 但细胞结构和功能往往不同 如根细胞具有吸收水分和养分的作用 叶片具有光和 蒸腾作用等 所以说 并非每个细胞能把全部遗传信息都表达出来 有的基因在这些细胞中表达 另一些基因在另一些细胞中表达 即 生命的全部属性在不同的细胞中分别表达 17 离体培养细胞展现该物种的生命特性1 培养细胞的新陈代谢在适宜条件下 离体细胞能够存活 则具有新陈代谢特性 如 绿色细胞具有光自养能力 培养细胞具有该物种的 药物生物合成的能力 18 2 培养细胞的应激性在适宜培养条件下 离体细胞具有应激性 植物组织切割损伤后 应激于培养条件而出现脱分化 并在适宜的条件下再分化 芽和根 19 3 培养细胞展现自体复制特性 20 21 细胞工程是生命科学领域的一个组成部分 就学科而言 它是涉及细胞生物学 发育生物学和遗传学等多门学科的综合科学 细胞工程以细胞培养技术 细胞融合技术为基础 现已被广泛应用于多个学科的基础研究工作以及农业 医药与食品等生产中 近年来细胞工程的开发和应用主要集中在细胞杂交 快速无性繁殖和细胞育种等方面 细胞工程在新技术革命的浪潮中对农业 食品等传统工艺革新有着重大的影响 22 细胞工程所涉及的主要技术有 细胞培养技术 细胞融合技术 细胞器移植和细胞重建技术 染色体工程技术 体外授精 胚胎移植技术和生物反应器技术等 在食品工业中应用较广泛的细胞工程技术主要是细胞培养技术 细胞融合技术 细胞重建技术及细胞代谢物的生产技术等 细胞工程的基本技术 23 1 细胞培养技术细胞培养技术是指动物和植物细胞在体外无菌条件下的保存和生长 即将机体内某一组织取出 使其分散成单个细胞 在体外人工的生长条件下培养 使细胞生长和不断增殖 24 细胞培养 25 植物组织培养 26 2 细胞融合技术指两种不同亲株经酶法去除细胞壁得到两个原生质体 并在助融剂作用下互相凝集并发生细胞间的融合 进而导致基因重组 获得新菌株 其融合频率明显高于常规杂交数倍至几十倍 对促进基因重组 遗传育种 选育优良品系 以达到高产优质具有重要实践意义 27 3 细胞器移植和细胞重建技术所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中 或者将两个细胞的细胞核 或细胞质 进行交换 从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术 克隆羊 28 29 30 动物细胞工程主要应用于培养有生理活性的物质 如病毒疫苗 干扰素 单克隆抗体等 由于动物细胞工程的复杂性及精密性 促进动物细胞大量培养的新工艺 新技术不断涌现 其中关键技术包括 无血清细胞培养基的开发 灌注悬浮培养 贴壁细胞培养 固定化细胞培养等培养技术的应用等 31 动物细胞结构 32 植物细胞工程主要指植物细胞培养技术 以前称之为植物组织培养 是一种将植物的组织 器官或细胞在适当的培养基上进行无菌培养技术 最常见的植物细胞培养技术有愈伤组织培养 悬浮细胞培养 器官培养 基尖分生组织培养 原生质体培养和固体化细胞培养几大类型 33 植物细胞结构 34 4 染色体工程 将单个染色体或染色体组转入或移出受体细胞 从而形成新的染色体组合和遗传构成 广泛用于优良品种的培育 如多倍体的育种 35 5 胚胎工程 胚胎工程是以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的细胞工程操作 主要技术包括体外受精 胚胎移植 胚胎切割等 36 6 干细胞与组织工程 干细胞是动物体内具有分化潜能 并能自我更新的细胞 分为胚胎干细胞和组织干细胞 37 7 转基因与生物反应器 1 转基因动物 2 转基因植物 38 二细胞培养的设施 条件及方法 主要介绍细胞工程实验室的设置及其所需要的基本条件 细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在于 要求保持严格无菌环境 避免微生物及其他有害因素的影响 一般来讲 它应能进行六方面的工作 无菌操作 培养 制备 清洗 消毒灭菌处理和贮藏 39 2 1细胞工程实验室的设置 无菌操作室无菌操作室是相对密封 防尘 防菌的工作空间 在结构和消毒方面都有基本的要求 2 1 1动物细胞工程实验室的设备 40 超净工作台 41 2 培养和观察室需要清洁无灰尘 孵育可在培养箱或可控制温度的温室中进行 一般实验室多采用培养箱进行 42 3 制备室该区主要进行培养液及有关液体的制备 在用天平 PH计 磁力搅拌器等设备下完成制备以后 应在无菌操作台进行过滤除菌 43 4 储藏室储藏室的主要设备有冰箱 液氮罐 储物柜等 还有一些器皿等 对储藏室的要求是取放方便 44 5 清洗和灭菌室应与其它区分开 主要有消毒柜 干燥箱和纯水制备等设备 进行所有细胞培养器皿的清洗 准备 消毒及纯水制备等工作 45 2 1 2植物细胞工程实验室的设置 植物细胞工程实验室除具有与动物细胞工程实验室相似的无菌操作室 制备室 清洗和灭菌室外 还有其特殊的设置 如具有光照条件的培养室 温室和驯化室等 46 1 无菌操作室2 培养室培养室的温度应当是可控的 一般保持在25 左右 3 鉴定室4 清洗室5 灭菌室6 制备室7 驯化移植室 47 2 2常用仪器与设备 1 超净工作台 48 2 倒置显微镜使用倒置显微镜定期检查培养细胞器皿中的细胞生长情况 可及时调整培养条件 若发现污染 可根据污染类型决定补救措施和处理方案 若能配置带有相机系统的高质量相关显微镜 效果更佳 49 3 电热干燥箱用于细胞培养中的有些器械 器皿需要烘干时使用 玻璃器皿也需要干燥消毒 实验室常用的是鼓风式电热干燥箱 其优点是温度均匀 效果良好 缺点是升温过程较慢 50 4 水纯化装置细胞培养对水的质量要求很高 所有与培养细胞接触的液体均需要纯水配成 水可采用离子交换纯水装置或蒸馏器纯化 51 5 冰箱细胞培养室必须配备普通冰箱或冷藏柜 最好还有一台低温冰箱 20 前者用于贮存各种溶液和短期保存组织标本等 20 低温冰箱则用于储存需要冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂 如酶 血清 配置的抗生素等 52 6 压力蒸汽消毒器7 细胞计数板和电子细胞计数仪8 过滤除菌装置9 离心机10 移液管和吸管11 离心管12 移液器13 天平 53 2 2 2动物细胞工程实验室的常用仪器设备 1 培养箱2 显微操作仪3 细胞融合仪4 细胞冷冻储存器5 培养用器皿6 手术器械 54 2 2 3植物细胞工程实验室的常用仪器设备 1 光照培养箱2 人工气候箱3 摇床4 培养瓶 55 2 3实验室的生物安全 在进行细胞与组织培养时 尤其是含有病原的生物材料的培养 不仅要保证培养物不受污染 也要保证培养物不会对实验人员和环境造成污染 56 清洗的主要目的是清除培养器皿中的杂质和微生物等影响细胞生长的成分 清洗后的玻璃器皿要干净 透明 无油质 且无任何残留物质 清洗完毕后的器皿在消毒前必须进行严密包装 以便消毒及储存 防止落入灰尘及消毒后再次被污染 3清洗与消毒 57 严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的 细胞培养过程中主要使用两类消毒方法 即物理灭菌法和化学灭菌法 不同的灭菌方式适用于不同的物品 如紫外线法适用于无菌室或超净工作台的台面等大面积消毒 高压蒸汽消毒适用于玻璃器皿 过滤除菌适于含有不耐热成分的培养基和试剂的消毒 化学消毒适用于实验室 无菌室的桌面 物体表面的消毒 58 过滤除菌器 59 3 1清洗 3 1 1玻璃器皿的清洗3 1 2胶塞的清洗3 1 3塑料制品的清洗3 1 4G6除菌滤器的清洗3 1 5不锈钢除菌滤器的清洗3 1 6包装 60 3 1 1玻璃器皿的清洗 组织细胞培养中使用量最大的是玻璃器皿 一般玻璃器皿的清洗包括浸泡 刷洗 浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿要求干净 透明 无油迹 且无任何残留物质 61 1 浸泡新瓶使用前都需要先用清水浸泡 以软化和溶解附着物 新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性 并带有一些对细胞有毒的物质 如铅和砷等 同时常有许多灰尘 可先用自来水简单刷洗 后用稀盐酸浸泡过夜 培养后的器皿立即浸入水中以便刷洗 62 2 刷洗将浸泡后的玻璃器皿放到清洗剂溶液中 用软毛刷沾洗涤剂反复刷洗以去除器皿内外表面的杂质 需注意两点 一是防止损伤器皿表面光洁度以免影响细胞生长 二是不能有死角 63 3 浸酸清洗液由浓硫酸 重铬酸钾及蒸馏水配制而成 具有很强的氧化作用 去污能力很强 对玻璃器皿无腐蚀作用 这是关键的一个环节 在配制清洗液的时候要小心 注意安全 防止烧伤皮肤及烧坏衣服 64 4 冲洗玻璃器皿在使用后 刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗 使之尽量不留污染或清洁液的残迹 冲洗最好用洗涤装置 既省力 效果又好 如用手工操作 则需流水冲洗10次以上 65 3 1 2胶塞的清洗 胶塞的清洗新购置胶塞有大量滑石粉 用自来水洗净 再常规处理 常规清洗方法 水中浸泡2 NaOH煮沸10 20分钟自来水冲洗1 盐酸浸泡30分钟自来水冲洗蒸馏水清洗2 3次晾干 66 3 1 3塑料制品的清洗 塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装 打开包装即可用 多为一次性物品 但用后如用无菌处理后 尚可反复使用2 3次 但不宜过多 再用时仍然需要清洗和灭菌处理 67 3 1 4G6除菌滤器的清洗新G6除菌滤器置玻璃洗液中浸泡24小时 流水缓慢冲洗 至pH值为5 5左右 然后用4倍的蒸馏水缓慢冲洗 再用重蒸馏水缓慢冲洗 烤干 包装消毒备用 用过的G6除菌漏斗立即浸泡水中 注意 滤器千万不能干涸 过夜 流水缓慢冲洗24小时或更长时间 至滤面基本疏通时 50 烤干 滤器再置清洁液中浸泡24小时 或装满清洁液自然过滤 流水冲洗及其后的处理同新G6除菌滤器 68 针头滤器 除菌滤器 69 3 1 5不锈钢除菌滤器的清洗清洗液刷洗新的或使用后的滤器 然后用流水冲洗 去离子水浸泡 最后用三蒸水浸泡24小时 然后干燥 70 包装材料有皱纹包装纸 硫酸纸 棉布 铝饭盒及金属消毒筒 局部包装 全包装小物品装饭盒 注意期限 标明物品名 吸管用脱脂棉将管接口端堵塞 装入消毒筒 筒底垫棉花 3 1 6包装 71 72 72 3 2消毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌 真菌和病毒等微生物的污染 污染主要由于操作者的疏忽而引起 常见的原因有操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底等 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败 细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规 防止发生污染 消毒方法分为物理灭菌法 紫外线 电离辐射 湿热 干热 过滤等 和化学消毒法 各种化学消毒剂 两类 73 3 2 1物理消毒法1 紫外线消毒2 电离辐射消毒3 湿热消毒4 干热消毒5 过滤除菌 74 1 紫外线消毒 紫外线消毒用于空气 操作台表面和不能使用其他方法进行的培养器皿 紫外线直接照射 方便 效果好 经一定的时间照射后可以消灭空气中大部分细菌 但是真菌的抵抗力最强 紫外线的直接作用机制是通过破坏微生物的核酸和蛋白质等而使其失活 间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物 紫外线可产生臭氧 污染空气 对试剂及培养液都有不良影响 对人皮肤 眼睛都有伤害 因此 不能开着紫外灯进行实验操作 75 紫外灯 76 2 电离辐射消毒 这主要是指使用放射性核素产生的X线和加速器等发出的辐射进行灭菌消毒 适用于消毒量大和不适于作高压或滤过等培养用品 如培养瓶 培养板 注射器 移液器吸头 离子管等 电离辐射的优点是灭菌时物品不会升温 可直接对密封包装的物品进行灭菌 但由于电离辐射的诱变作用很强 不适合消毒的生物材料 77 电离辐射标志 78 3 湿热消毒 即高压蒸汽消毒 是一种使用最广泛 效果最好的消毒方式 湿热消毒时 消毒物品不能装得过满 应保证其内气体的流通 以防止消毒器内气体阻塞而发生危险 79 干热消毒法是将电热烤箱的物品加热到160 以上 并保持90 120分钟以杀死细菌和芽孢 该方法主要用于消毒玻璃器皿 消毒完毕后不可以马上将烤箱门打开 以免温度骤冷而使箱内玻璃器皿破裂 优点是消毒后的器皿干燥 易于储存 缺点是升温较慢 金属器械和橡胶 塑料制品不能使用干热消毒法 4 干热消毒 80 5 过滤除菌 过滤除菌是将液体或气体用微孔滤膜过滤 使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留 从而达到除菌目的 81 3 2 2化学消毒法 化学消毒法是利用化学消毒剂那些不能用物理消毒法进行消毒的物品和场地 如无菌室的空气 台面 操作者的皮肤等 操作简单 方便有效 82 我们都知道 细菌是有机生物 它的细胞壁和细胞膜是由磷脂质双分子膜组成 带有负电荷 而银作为重金属 带有活性极强的阳离子 也就是正电荷 银的杀菌作用 首先表现在物理学中讲到的 同性电荷相排斥 异性电荷相吸引 当银在其材料的表面释放出大量正电荷后 漂浮在空气中带有负电荷的细菌或其他有机生物 就会被吸附到其表面 正负电荷发生反应后 就抑制了细菌的呼吸 同时使细菌的细胞壁和细胞膜彻底变形破裂 失去繁殖和生存能力 发生 溶解死亡 83 另外 重金属本身具有超强的降解功能 当细菌被吸附在银表面时 银离子的超强降解功能就会破坏细菌胞内的酶系统 影响细菌正常的新陈代谢 从而使细菌死亡 一般的抗生素平均只能对6种病菌起到作用 但银能消灭650种病菌 84 无菌操作技术是细胞培养的基本技术 包括实验器具和材料的准备 培养室和超净工作台的消毒 洗手和着装 无菌培养等操作等 特别是操作过程中技术运用要规范 无菌概念和无菌操作必须贯穿整个培养过程的始终 3 3细胞培养的基本方法 85 3 3 1无菌操作技术 细胞在体外培养中最易被微生物感染 因此 防止污染是决定细胞培养成败的关键 无菌概念和无菌操作必须贯穿整个培养过程的始终 86 1实验器具和材料的准备 根据实验要求 将所需的实验器具和材料准备好 以合适的方法进行消毒和灭菌 87 无菌培养室每天都要用新洁而灭拖洗地面一次 紫外线照射消毒30 50分钟 超净工作台面每次实验前要用75 酒精擦洗 然后紫外线消毒30分钟 一些操作用具要经过75 酒精擦洗后可置于台内同时进行紫外线照射消毒 但是台面上的用品不要放置过多或重叠放置 以免降低消毒效果 且勿使培养细胞和培养液受到紫外线的照射 2培养室和超净台的消毒 88 3洗手和着装 进行操作前要更换消毒的无菌服 帽子和口罩 以75 酒精消毒手和前臂 实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手 平时仅做观察时可着经紫外线照射30分钟后的一般工作服 89 培养操作基本要领和要求无菌操作成功或失败的首要条件培养前准备操作卡片用品置于场地 然后消毒操作野消毒洗手和着装火焰消毒 90 4无菌培养操作 培养操作动作准确敏捷不用手触及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定顺序培养用瓶和吸管的放置防止各种用液的交叉污染不向操作者讲话或咳嗽 91 80 92 93 93 97 94 3 4 1相差显微镜观察 培养细胞在生活状态下接近透明 结构之间的反差很小 因此必须借助于能够增强结构之间反差的相差显微镜才能更好地观测活细胞的生长状况 3 4培养细胞的观察 95 96 1 相差显微镜的工作原理 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折射率由差异的原理 即光波在折射率大的物体中比在折射率小的物体中前进的距离较短 此距离差异叫光程差 由于光程差引起光的相位变化称为相位差或相差 使用相差显微镜可使用肉眼不能分辨的相位查变为可分辨的振幅差 即敏感差 使无色透明的物体在镜下反差显著 影像清晰 97 2 相差显微镜镜的装置 1 环状光阑 2 相板 3 中心望远镜 98 3 4 2培养细胞的观察 1 细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目 以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法 99 3 细胞分裂指数 4 细胞贴壁率 5 细胞周期 6 MTT比色法测定细胞活力 2 细胞生长曲线 100 3 3细胞培养中常用的染色方法 3 3 1活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂 即活体染料 对活的组织或细胞进行染色而不影响细胞的生命活动的一种方法 101 1 活体染料的类别分为碱性活体染料和酸性活体染料两大类 2 活体染色方法台酚蓝染色法和吖啶橙荧光染色法 102 3 3 2染料排除检测法 死细胞的细胞膜通透性改变 染料进入不能排出 活细胞能够排出进入细胞内的染料 1 台酚蓝排除检测法2 溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法 103 3 4细胞培养的污染和检测 3 4 1污染途径空气器材操作血清组织样本 104 3 4 2污染对培养的影响及检测 污染对细胞的影响1 细菌污染培养液浑浊镜下可见菌体2 真菌污染大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面镜下呈丝状 管状或树枝状 纵横交错 105 3 支原体污染最常见 不易察觉大小介于0 2 2 m 约1 可通过滤菌器对酸耐受性差 对热较敏感 青霉素无效 正常 感觉 4 病毒的污染5 细胞交叉污染及检测 106 3 4 3污染的预防1 培养操作前的准备2 培养操作时的注意事项3 其他注意事项3 4 4污染的排除1 抗生素的应用2 加温处理3 动物体内接种除菌法4 巨噬细胞吞噬法 107 第二节动物细胞培养 108 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织 模拟体内的生理环境 在无菌 适温和丰富的营养条件下 使离体细胞或者组织生存 生长并维持结构和功能的一门技术 是动物细胞工程的基础 动物细胞培养定义 109 110 动物的细胞与组织培养是从动物体内取出组织或细胞 模拟机体内生理条件 在体外建立无菌 适温和一定营养条件等 使之生长和生存 并维持其结构和功能的技术 动物细胞与组织培养是动物细胞工程的重要技术基础 细胞融合 组织工程 胚胎工程 动物克隆等都离不开细胞的培养 111 细胞培养目的与用途1 科学研究 药物研究开发与基础研究药物研究与开发 1 新药筛选 如化学合成药物药效研究 中药有效成分筛选与鉴定等 2 疫苗研究与开发 如病毒性疫苗的研究与开发 肝炎病毒疫苗 艾滋病疫苗等 肿瘤疫苗 多肽疫苗 等 3 基因工程药物研究与开发 如干扰素研究与开发 细胞生长因子研究与开发等 4 细胞工程药物研究与开发 生物活性多肽研究与开发 人参皂甙 紫杉醇等生物活性成分研究与开发 5 单克隆抗体制备 包括诊断用单克隆抗体 治疗用单克隆抗体 112 基础研究 1 药物作用机理 2 基因功能 3 疾病发生机理2 生物制药 1 疫苗生产 如病毒性疫苗 肝炎病毒疫苗 艾滋病疫苗等 肿瘤疫苗 多肽疫苗 等 2 基因工程药物生产 如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素 粒细胞生长因子 胸腺肽等 3 诊断用和药用单克隆抗体生产 4 细胞工程药物生产 生物细胞内的一些生物活性多肽 生物活性物质等 113 2 1 1体外细胞的分型根据离体细胞在体外生长时是否贴壁的性质 将其分为贴壁型与悬浮型两类 贴壁型 悬浮型 114 1 贴壁型细胞 又叫粘附型细胞 可分为上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞型和多形细胞 粘附生长本是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式 粘附有两种含义 一是细胞之间相互接触 二是细胞与细胞外基质结合 动物细胞培养中 大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长 当细胞布满表面后即停止生长 这时若取走一片细胞 存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面 115 2 悬浮型细胞 体外生长不必贴壁 可在培养液中悬浮生长 因此也叫悬浮型细胞 一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物 当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长 血液白细胞 淋巴组织细胞 某些肿瘤细胞 杂交瘤细胞 转化细胞系等都属此类细胞 由于悬浮型细胞在瓶皿中生长时不贴壁 因而生存空间大 能繁殖大量细胞 并且容易进行传代培养 但在观察时不如贴壁细胞方便 116 2 1 2培养细胞的生长特点 细胞在体外培养生长时具有一些特点 如贴附 接触抑制和密度依赖等 1 贴附2 接触抑制3 密度抑制 117 1 贴附 贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本生长特点 以成纤维细胞为例 一般在细胞接种后 很快 约5 10分钟 便可见细胞形成伪足 与底物形成一些接触点 随后细胞逐渐呈放射状展开 细胞体的中心部分变成扁平状 最后 细胞成为成纤维细胞的形态 118 贴附 细胞的贴附和伸展受很多因素的影响 如离子的作用 细胞的伸展需要有钙离子的存在 而含低浓度钙离子的培养液不利于细胞的伸展 机械 物理因素等也影响着细胞的贴附于伸展 119 2 接触抑制 接触抑制是体外培养中某些贴附型细胞生长特性之一 一般情况下 正常的细胞不停顿地活动或移动 其外周的细胞膜呈现一些特征性皱褶样活动 但是当两个细胞由于移动而相互靠近发生接触时 细胞不再移动 但是肿瘤细胞由于无接触抑制而能够继续移动和增殖 导致细胞向三维空间扩展 使细胞发生堆积 因此 接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一 120 3 密度抑制 细胞接触汇合成片后 虽发生接触抑制 但只要营养充分 细胞仍然能够进行增殖分裂 数量仍在增多 但当细胞密度进一步增大 培养液中营养成分减少 代谢物增多时 细胞因营养的枯竭和代谢物的影响 则发生密度抑制 导致细胞分裂停止 121 2 1 3培养细胞的生长与增殖过程 1 单个细胞的生长过程2 细胞系的生长过程3 每代细胞的生长过程 122 1 单个细胞的生长过程 细胞周期是指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期 可分为G1期 S期 G2期和M期等各个阶段 培养细胞的单个细胞的生长过程与体内细胞单个细胞生长过程相似 123 1 G1期即DNA合成前期 各种细胞G1期持续时间的长短差异较大 短者4 5小时 长者可达数日 增殖旺盛细胞的G1期持续时间短 衰退细胞则时间长 124 2 S期即DNA合成期 主要机能活动为进行DNA的合成 各种细胞的S期持续时间差别较小 比较恒定 平均约6 8小时 此期遗传物质较易受损 因为DNA在合成过程中核苷酸双链分开 易于受到致突变或致癌物的影响 125 3 G2期为DNA合成后期 又称细胞分裂前期 本期细胞的DNA含量已加倍 正进行细胞分裂的准备工作 本期细胞对环境较敏感 易受温度 PH等因素的影响而停滞于G2期 但当这些不利的因素去除后常能恢复 本期持续时间较短 约2 3小时 126 2 细胞系的生长过程 1 原代培养期 原代培养期也称初代培养期 指从体内取出组织接种培养到第一代传代的阶段 一般持续1 4周 一旦已进行传代培养 Subculture 的细胞 便不再称为初代培养 而改称为细胞系 127 2 传代期原代细胞生长到一定时间之后 如果是贴壁细胞就会连接成片而铺满瓶底 这时就需要将原代细胞分开至多个新的培养瓶中 这个过程叫做传代 传代以后的细胞称为细胞系 128 3 衰退期此期细胞仍生存 但不增殖或增殖很慢 最后衰退死亡 在细胞生命期中 少数情况下在以上三个时期均可发生细胞自发转化 转化的标志之一是细胞获得永久性增殖能力 成为连续细胞系 连续细胞系的形成主要发生在传代期 被转化的细胞可能具有恶性性质 也可能仅有不死性而无恶性 129 3 每代细胞的生长过程 1 潜伏期 2 对数生长期 3 停止期 130 2 1 4培养细胞的遗传学特征 1 染色质与染色体2 细胞性别 131 2 1 5体内外细胞的差异及培养细胞的分化 1 体内外细胞的差异2 培养细胞的分化 132 2 2细胞培养液 4 2 1细胞培养的常用液体1 水水为细胞培养所必需 细胞所需的化学成分 生存环境 营养物质都必须用水溶解才能吸收 其代谢产物也必须溶解于水才能被排泄 用水必须高度纯水 普通自来水中含有大量离子及其他杂质 对细胞生长不利 实验室用的纯水一般有两种 蒸馏水和离子交换水 133 2 平衡盐溶液 BSS 平衡盐溶液是组织细胞培养中常用的基本液体 BSS可以维持渗透压 调节PH以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 主要作为合成培养基 液 的基础液及用于洗涤组织 细胞等 BSS内一般含少量的酚红 作为溶液酸碱度变化的指示剂 溶液变酸时呈黄色 变碱时呈紫红色 中性时呈桃红色 藉此易于观察培养液的PH变化 134 3 消化液 进行原代培养时组织的取材 传代培养中贴壁细胞的分离 都要用到消化液 培养细胞中常用的消化液有胰蛋白酶溶液 二乙烯四乙酸二钠 EDTA Na 溶液及胶原酶溶液 这些溶液可以单独使用也可混合使用 135 4 消化酶抑制液 在含血清培养时 血清中的某些成分可终止消化酶对细胞的作用 所以当用消化酶消化后直接加入培养液即可终止消化酶的消化作用 而无血清培养时则必须使用消化酶抑制剂 以保护细胞免受残留的消化酶的过度消化而损坏 大豆胰酶抑制剂是最常用的酶抑制剂 终浓度为0 1 0 5 136 5 PH调整液 常用的有NaHCO3和HEPES溶液 1 NaHCO3匙培养基中必须添加的成分 常用的浓度有3 7 5 6 和7 4 三种 2 HEPES溶液HEPES是一种弱酸 化学名称是羟乙基哌嗪乙硫磺酸 它对细胞无毒性作用 是一种氢离子缓冲剂 主要作用是防止培养基PH迅速变动 137 6 抗生素液 培养液内加入适量的抗生素 可以预防由于操作不慎而产生的微生物污染 常用的抗生素有青霉素 链霉素 卡那霉素和庆大霉素等 138 7 谷氨酰胺补充液 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用 合成培养基中都要添加 由于其很不稳定 易分解 故需单独配制谷氨酰胺溶液 以便临时加入培养液内 139 2 2 2培养基 1 培养基的基本要求培养基按其来源可分为天然培养基和合成培养基 天然培养基的营养成分与细胞在体内所需条件比较接近 但就细胞在体外生存的环境来说 合成培养基也有其独到之处 譬如成分便于控制和标准化 140 1 营养成分 1 氨基酸 是细胞合成蛋白质的原料 所有细胞都需要12种必须氨基酸 缬氨酸 亮 异亮 苏 赖 色 苯丙 蛋 组 酪 精氨酸 胱氨酸 此外还需要谷氨酰胺 它在细胞代谢过程中有重要作用 所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源 同样也是合成三 二 一磷酸酰苷所需要的基本物质 体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸 141 2 单糖 培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解 六碳糖是主要能源 此外六碳糖也是合成某些氨基酸 脂肪 核酸的原料 细胞对葡萄糖的吸收能力最高 半乳糖最低 体外培养动物细胞时 几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质 142 3 维生素 主要扮演辅酶 辅基的角色 必不可少 生物素 叶酸 烟酰胺 泛酸 吡哆醇 核黄素 硫胺素 维生素B12都是培养基常有的成分 143 4 其他成分 无机离子与微量元素 细胞生长除需要钠 钾 钙 镁 氮和磷等基本元素 还需要微量元素 如铁 锌 硒 铜 锰 钼 钒等 巯基乙醇对细胞培养也有很大的作用 144 2 促生长因子及激素 各种激素 生长因子对于维持细胞的功能 保持细胞的状态 分化或未分化 具有十分重要的作用 有些激素对许多细胞生长有促生长作用 如胰岛素 它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸 有些激素对某一类细胞有明显促进作用 如氢化可的松可促进表皮细胞的生长 泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等 145 pH值约在7 2 7 4条件适宜细胞生长 随细胞数量的增多和代谢活动的加强 二氧化碳不断被释放 培养液变酸 PH值发生变化 可以配制具有缓冲能力的NaHCO3 CO2缓冲系统 还可以采用开放式培养方式 3 pH 146 细胞必须生活在等渗的环境中 大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性 4 渗透压 147 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基 如血浆 血清 淋巴液 鸡胚浸出液等 组织培养技术建立早期 体外培养细胞都是利用天然培养基 但是由于天然培养基制作过程复杂 批间差异大 因此逐渐为合成培养基所替代 目前广泛使用的天然培养基是血清 另外各种组织提取液 促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少 2 天然培养基 148 血清 serum 细胞培养的发展 培养基的质量又是关键 而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用 在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的 所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一 保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节 1 血清 149 澳洲小牛血清 150 血清种类 目前用于组织培养的血清主要是牛血清 培养某些特殊细胞也用人血清 马血清等 选择用牛血清培养细胞的原因 来源充足 制备技术成熟 经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解 牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的 但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适 151 标准牛血清 标准胎牛血清 152 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基 含有丰富的细胞生长必须的营养成份 具有极为重要的功能 牛血清分为小牛血清 新牛血清 胎牛血清 胎牛血清应取自剖腹产的胎牛 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛 小牛血清取自出生10 30天的小牛 显然 胎牛血清是品质最高的 因为胎牛还未接触外界 血清中所含的抗体 补体等对细胞有害的成分最少 153 血清的主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物 其组成成份虽大部分已知 但还有一部分尚不清楚 且血清组成及含量常随供血动物的性别 年龄 生理条件和营养条件不同而异 血清中含有各种血浆蛋白 多肽 脂肪 碳水化合物 生长因子 激素 无机物等 这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性时达到生理平衡的 对血清的成分和作用的研究虽有很大进展 但仍存在一些问题 主要是 154 第一 血清的成份可能有几百种之多 目前对其准确的成份 含量及其作用机制仍不清楚 尤其是对其中一些多肽类生长因子 激素和脂类等尚未充分认识 这给研究工作带来许多困难 第二 血清都是批量生产 各批量之间差异很大 而且血清保存期至多一年 因此 要保证每批血清的相似性极为困难 从而使实验的标准化和连续性受到限制 第三 不能排除血清中含有易变物质 这被认为是 瓶中恶化 的原因之一 155 血清主要作用 提供基本营养物质 氨基酸 维生素 无机物 脂类物质 核酸衍生物等 是细胞生长必须的物质 提供激素和各种生长因子 胰岛素 肾上腺皮质激素 氢化可的松 地塞米松 类固醇激素 雌二醇 睾酮 孕酮 等 生长因子如成纤维细胞生长因子 表皮生长因子 血小板生长因子等 156 提供结合蛋白 结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质 如白蛋白携带维生素 脂肪 以及激素等 转铁蛋白携带铁 结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤 157 对培养中的细胞起到某些保护作用 有一些细胞 如内皮细胞 骨髓样细胞可以释放蛋白酶 血清中含有抗蛋白酶成分 起到中和作用 这种作用是偶然发现的 现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用 因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代 血清蛋白形成了血清的粘度 可以保护细胞免受机械损伤 特别是在悬浮培养搅拌时 粘度起到重要作用 血清还含有一些微量元素和离子 他们在代谢解毒中起重要作用 如SeO3 硒等 158 细胞培养中使用血清的缺点血清成分复杂 虽含许多对细胞有利成分 也含有对细胞有害的成分 使血清有几个明显的缺点 对大多数细胞 在体内状态 血清不是它们接触的生理学液体 只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清 因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态 血清可能促进某些细胞的生长 成纤维细胞 同时抑制另一类细胞生长 表皮细胞 血清含一些对细胞产生毒性的物质 如多胺氧化酶 能与来自高度繁殖细胞的多胺反应 如精胺 亚精胺 形成有细胞毒性作用的聚精胺 补体 抗体 细菌毒素等都会影响细胞生长 甚至造成细胞死亡 159 动物个体不同 血清产地 批号不同 每批质量差异甚大 其成分不能保持一致 取材中可能带入支原体 病毒 对细胞产生潜在影响 可能导致实验失败或实验结果不可靠性 血清的使用使得实验和生产的标准化困难 其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成 大规模生产中 血清来源越来越困难 价格昂贵 是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一 160 血清的质量标准 血清质量高低取决于两方面因素 一是取材对象 二是取材过程 用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内 取材过程应严格按照操作规程执行 制备出的血清要经过严格的质量鉴定 WHO公布的 用动物细胞体外培养生产生物制品规程 中的要求 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家 并应具备适当的监测系统 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物 血清要通过滤膜过滤除菌 保证无菌 无细菌 霉菌 支原体和病毒的污染 有些国家要求无细菌噬菌体污染 对细胞有良好的支持繁殖作用 161 血清的使用与储存 正确的使用及保存血清 才能使血清发挥应有的作用 使用前处理 大部分血清在使用前必须灭活处理 即56 处理30分钟 灭活的目的是去除血清中的补体成分 避免补体对细胞产生毒性作用 血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分 如生长因子 因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养 这样做的前提是确认血清中不含补体成分 对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养 162 储存条件 血清一般储存于 20 同时应避免反复冻融 购买大包装的血清后 首先要灭活处理 然后分装成小包装 储存于 20 使用前融化 融化时最好现置于4 融化后的血清在4 不宜长时间存放 应尽快使用 使用浓度 自从有了合成培养基 血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用 使用浓度一般为5 20 最常用是10 过多血清容易使培养中的细胞发生变化 特别是一些二倍体的无限细胞系 迅速生长之后容易发生恶性转化 采购血清时 最好先从供应商处索取样品进行试验 选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量 直至用另一批经过预先试验的样品代替 163 2 鼠尾胶原 胶原是细胞生长良好的基质 利于组织和细胞的固定 它是从动物特定组织中用人工法提取出来的 亦称天然培养基 胶原主要用于细胞的附着 能改善细胞表面的性质 促细胞生长 其中以鼠尾胶原最为常用和置备简便 164 3 鸡胚浸出液鸡胚浸出液 embryonicextract 是早期动物细胞培养中应用的天然培养基 现已很少使用 4 水解乳蛋白水解乳蛋白 lactalbuminhydrolysate 为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物 含有丰富的氨基酸 是常用的天然培养基 可用于许多细胞和原代细胞的培养 165 合成培养基是根据天然培养基的成分 用化学物质模拟合成 人工设计 配制的培养基 它有一定的配方 是一种理想的培养基 目前合成培养基多达10多余种 有的培养基仍在不断进行改良 早期组织培养是利用天然培养基 目前合成培养基已经成为一种标准化的商品 从最初的基本培养基发展到无血清培养基 无蛋白培养基 并且还在不断发展 合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展 3 合成细胞培养基 166 在体外培养技术的发展过程中 培养基配方的设计一直是重要的研究课题 研究者模拟 借鉴细胞在体内生存生长的各种条件 设计出类似体内环境而适宜细胞在体外生存的各种培养基 这些培养基大都只能使细胞在体外短暂生存 只有添加了少量的天然培养基 细胞才能在其中生长增殖 在研制的过程中 发现了 基本培养基 或 通用培养基 在加入一定量的血清后成为 完全培养基 1 基本培养基 167 1 基本培养基的组分 168 2 基本培养基的种类 MEM DMEM IMDM RPMI1640 199 109培养基 HamF10 HamF12 McCoy s5A 169 现今国内外都普遍使用市售的干粉型培养基 除专门从事研究培养外 各实验室已不需要自己从基本成分开始配制培养基 利用干粉型培养基配制液体培养基一般注意以下问题 仔细阅读说明书配制时要保证充分溶解配制所用的水为双蒸水或三蒸水 3 培养基的配制 170 合成培养基 粉 1袋碳酸氢钠2 0g青 链霉素各100单位 毫升加三蒸水至1000ml过滤除菌 调节pH值至7 2加血清 终浓度10 培养基的配制 171 2 无血清培养基 无血清培养基 serumfreemedium SFM 有时也称化学限定性培养基或化学成分明确的培养基 是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长增殖的合成培养基 172 无血清培养及培养用液 无血清培养基组成基础培养液附加成分 细胞外基质 营养成分 生长因子 酶的抑制剂 无血清培养液的配制必须使用高质量的水 这是因为无血清培养基内缺乏天然成分的大分子物质对细胞的保护作用 可能对细胞产生致死损害 一般都要使用三次蒸馏水以上的蒸馏水 173 细胞培养自19世纪中叶开始萌芽到现在 发展了许多不同的方法和技术 2 3细胞的基本培养技术 174 也称初代培养 即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段 一般持续1 4周 其最大优点是组织和细胞刚刚离体 生物学特性未发生很大变化 多呈二倍体遗传特性 由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大 是检测药物很好的实验对象 原代细胞是建立各种细胞系的第一步 是从事组织培养工作人员熟悉和掌握的最基本的技术 原代培养方法很多 但基本过程都包括取材 培养材料的制备 接种 加培养液 培养等步骤 同样 在所有操作过程中 都要注意保持培养物及其生长环境的无菌条件 2 3 1原代培养 PrimaryCulture 175 1 组织取材 取材是原代培养的最初环节 取材的部位是否准确 组织是否保持活性 材料处理是否恰当 直接决定试验的成败 不同动物 不同组织的取材方法也不同 176 鸡胚组织培养在鸡的病毒与疫苗研究中经常使用 选取受精鲜鸡蛋 擦掉表面脏物 置孵化箱或温箱中37 孵育 每天翻动鸡蛋一次 温箱内放一盛水的平皿以维持培养箱内的湿度 一般采用9 12天的鸡胚 于无菌条件下 将鸡蛋以大头向上放在一个小烧杯中 用碘酒和酒精消毒 用剪刀环行剪除气室端蛋壳 切开蛋膜 暴露出鸡胚 用干净玻璃棒伸入蛋中轻轻挑起鸡胚 放入无菌培养皿中 根据需要取材 鸡胚组织 177 鸡胚 178 2 鼠胚组织 由于鼠胚组织取材方便 易于培养 又是与人相近的哺乳动物 已成为较常用的培养材料 但小鼠皮毛中易隐藏微生物 且不易消毒 179 3 皮肤和黏膜 皮肤和黏膜是上皮细胞培养的重要组织来源 人的皮肤黏膜主要取自手术切除的部分组织 180 4 血细胞 体外培养的血液白细胞可用于染色体分析 淋巴细胞体外激活剂药物筛选等 取材时多采用静脉取血 微量培养时可从指尖或耳垂取血 取血时常用凝血剂防止凝血 抗凝剂的量以产生抗凝效果的最小量为宜 量大时容易导致溶血 抽血时一定要使用一次性器具 杜绝混用 防止交叉感染事故的发生 181 5 内脏和实体瘤 人体肿瘤组织主要来源于外科手术或活检组织 除消化道外其他内脏基本都是无菌的 但有些实体瘤坏死而导致被细菌污染 去外层新鲜的组织 避开瘤体中央的坏死或变性组织 182 2 组织细胞的分离 动物的各种组织均由结合相当紧密地多种细胞和纤维成分组成 一般体积大于1立方毫米的组织块置于培养瓶中后 只有处于周边的少量细胞可以生存和增殖 大部分中间的细胞因营养穿透有限而代谢不良 且受周围细胞及组织的束缚而难以移出 目前分散组织的方法主要有机械法和消化法 183 1 机械法 1 离心分离法2 切割分离法3 机械分散法 184 2 消化法 消化法是利用生化和化学的手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法 用此法获得的细胞制成悬液可直接进行培养 消化作用可使组织松散 细胞分开 细胞容易生长 成活率高 各种消化试剂的作用机制各不相同 1 胰蛋白酶消化法2 胶原酶消化法3 螯合剂消化法 185 3 培养方法 1 组织块培养法 186 2 单层细胞培养利用机械法和消化法获得细胞悬液后 接种于细胞培养瓶皿内 贴壁型细胞很快就贴壁生长 形成单层细胞 本法有其适用于细胞建系和大量