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文档简介

PCR反应原理及其操作 1 PCR的基本原理2 PCR反应体系3 PCR的基本步骤 PCR的基本原理 试管中进行的DNA复制反应 依据DNA半保留复制的机理 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质 通过人为控制体外合成系统的温度 使双链DNA变成单链 单链DNA与人工合成的引物退火 DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA PCR反应体系 4种dNTP混合物各200umol L dATP dGTP dCTP dTTP 引物各10 100pmol模板DNA0 1 2ugTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol L PCR的基本步骤 1 DNA变性 90 96 双链DNA模板在热作用下 氢键断裂 形成单链DNA 2 退火 复性 25 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部双链 3 延伸 70 75 在Taq酶 在72 左右 活性最佳 的作用下 以dNTP为原料 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的DNA链 高温变性 低温退火 中温延伸 在引物作用下 Taq酶从引物3 端开始延伸DNA链 即DNA的合成方向是从子链的5 端自3 端延伸的 实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程 DNA的复制需要引物 其主要原因是DNA聚合酶只能从3 端延伸DNA链 PCR每一步的转换通过温度的改变控制 DNA模板解链 变性 引物与模板结合 退火 DNA聚合酶催化新生DNA的合成 延伸 三个步骤构成PCR反应的一个循环 此循环反复进行 可使目的DNA得以迅速扩增 理论扩增率 2n递增 n为循环次数 25 30循环 目标DNA可增加109倍 由于引物和底物的消耗 酶活力的下降等因素 扩增产物的增加 逐渐由指数形式
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