裂解细胞的方法.doc

Welcome to DXY.CN Forum 论坛首页 | 全文搜索 | 电子期刊 | 个人属性 | 注销登陆 标记已读 | 我的论坛 | 我的简历 | 我要招聘 | 帖子收藏 | 论坛帮助 Welcome to DXY.CN Forum蛋白质技术讨论版 蛋白质技术讨论/FONT 打印话题 寄给朋友 原创菌体/细胞裂解法汇总 精华 KILLUAHUNTER发贴: 35 积分: 2 得票: 7 状态: 离线 2005-12-06 23:11 由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。菌体/细胞裂解法汇总一、反复冻融法：1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A/www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/200410/80878%2Ehtml&b=0&a=3&user=baidu2、至少3次以上冻溶。/bbs/actions/archive/post/3895899_0.html3、IFCC推荐法：收集细胞悬液，4低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。/bbs/actions/archive/post/252157_0.html4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=142945&replyID=597858&skin=1二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。/bbs/actions/archive/post/3895563_0.html2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。/bbs/actions/archive/post/3895899_0.html3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。/bbs/actions/archive/post/1861187_0.html4、综合冻融和超声的方法：1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4下111500g60min离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol三、渗透法：冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。精编分子生物学实验指南四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。/bbs/actions/archive/post/1166442_0.html2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。/bbs/post/view?bid=65&id=4936753&sty=3&keywords=SDS+%C1%D1%BD%E23、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。/bbs/actions/archive/post/2524891_0.html4、20毫升细胞裂解液配方:40 L 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。/bbs/actions/archive/post/196557_1.html5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？/bbs/actions/archive/post/2492252_0.html6、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。/bbs/post/view?bid=65&id=4591035&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#45910357、检测蛋白诱导：从培养的不同时期各取出1ml，12000g1min离心。将沉淀重悬于100ul 1SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2SDS，0.1溴酚蓝，10甘油）中，100加热3min，然后12000g1min离心。上样15ul，6SDS-PAGE电泳。分子克隆P8268、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2SDS上样缓冲液（100加热）。迅速混匀后100加热3-5min。将样品冰上放置（或-20放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。2SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2（w/v）DTT，8SDS，0.002（w/v）溴酚蓝，40甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.59.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A/www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/200410/80878%2Ehtml&b=0&a=3&user=baidu10、我们用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放3060min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=112749&replyID=421724&skin=111、裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 叠氮钠，100g/ml PMSF，1g/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。/bbs/actions/archive/post/1168826_0.html12、对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100g/ml PMSF、1g/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。/bbs/actions/archive/post/1172173_0.html13、细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 g/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 g/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。/bbs/actions/archive/post/532062_0.html14、裂解buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（还原剂），7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金属鏊合剂），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂），50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3VO4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine（inhibitor of trypsin）。/bbs/actions/archive/post/1049377_0.html15、可选择：取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清，用100ul 1SDS上样缓冲液重悬，冰上放置。6000rpm10min离心培养物。弃除上清，用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温。4，9000g30min离心。取上清。裂解液：5 mM DTT，15 mM KCl，5 mM MgCl2，50 mM HEPES, pH 7.9，1 mM EDTA，10 mg/ml溶菌酶（临用前加上DTT和溶菌酶）。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100 g/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine (终浓度1.5%)，然后超声波破碎。16000 rpm30 min离心。取上清然后加入Triton X-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA琼脂糖柱层析。 20021108 edited on 2007-07-15 23:43 有没有中级没过的啊？ biosepq大白龙 丁香园荣誉版主 发贴: 3194 积分: 262 得票: 5 状态: 隐身 2005-12-06 23:54 支持整理！ 欢迎来到蛋白质技术讨论版！ 【原创】兄弟们中级成绩可以查了 峨嵋九九发贴: 30 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 2005-12-07 19:45 很好,非常感谢有心人 【原创】脊柱微创介入治疗 ahui107发贴: 35 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2005-12-10 14:10 非常不错 【每周一问】NO.91-Epidural anesthesia（part1） aikido发贴: 33 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2005-12-10 21:53 我想问一个问题，我想得到细胞膜上的蛋白该用什么裂解的方法？ 【help】请教DS-156的一些问题,谢谢 caca214发贴: 3 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-04-26 09:40 非常有用啊感谢楼主！辛苦辛苦！ 【】是不是最后一门的分数大多6264居多？ wlln2006发贴: 2 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-04-26 10:52 佩服楼主！非常有用！谢谢哦！ 成绩大家都知道了,但是分数线呢?50?60?70? yxx44发贴: 31 积分: 4 得票: 0 状态: 离线 2007-05-01 14:06 楼主，辛苦了，谢谢 【讨论】中科院女博士论文造假被曝光 amberly我心本无乡，心安是归处 丁香园版主 发贴: 2316 积分: 303 得票: 75 状态: 在线 2007-05-01 17:32 aikido wrote:我想问一个问题，我想得到细胞膜上的蛋白该用什么裂解的方法？是细菌的吗？破碎使用French Press，1000 psi过3遍（或以上）如果没有French Press，就用超声，效果没那么好。然后细胞低速离心（3000 g）去掉未破碎细胞，超高速（200 000g）离心得到膜碎片。然后用合适的detergent将膜蛋白从膜上释放出来。 论文版欢迎您 【共享】一例胆战心惊的麻醉 muyx八珍豆腐*人穷脸丑 发贴: 274 积分: 13 得票: 3 状态: 离线 2007-05-02 23:23 【引LZ言】“由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料”楼主真可谓是性情中人也，佩服，佩服！【建议】园子里也可以搞 “定期悬赏” 来弄某一方面的总结吧，毕竟整理整理这么多的帖子不容易啊，那可是要阅贴无数的呀，加1、2分太寒碜了！ 不学则无术-)* 【社会人文】丁香视点：2007年度全美最佳医院 chrissqloo发贴: 100 积分: 2 得票: 0 状态: 离线 2007-05-04 01:09 谢谢楼主的的整理 中级考试可以查分了 zhaowantong发贴: 8 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-05-05 12:55 非常感谢！ 【准分子讨论】近视手术？医学界的一个阴谋(转载.chenxi1965)-是这样吗？ cdwmomo发贴: 22 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-05-16 19:58 非常感谢啊 ！收藏 【眼底病讨论】男 .69岁。视力右眼0.6。左眼指数/30cm.左眼视力下降半年 Zhangyuxin521发贴: 12 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-05-16 20:45 谢谢!最近也一直没有找到很好的裂解方法,真是雪中送碳. 【分享】精心总结的28号令与17号令对比申报流程！（17号令与28号令讨论专贴，请勿另开新贴） qin0718发贴: 62 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 2007-05-20 22:48 非常感谢！ 【活动】北京战友丁香园七周年庆典活动图文报道（有关资料将陆续上传。） wdna圣斗士 发贴: 638 积分: 13 得票: 0 状态: 离线 2007-05-22 16:14 大家都感谢楼主付出的努力啊，享受中ing 北京金叶天翔公司授权淘宝网专卖店！以会员价专卖新编全医药学大词典医学文献王新编临床用药参考 / 【活动】北京战友丁香园七周年庆典活动图文报道（有关资料将陆续上传。） SKSRF发贴: 12 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-05-22 22:51 佩服楼主！非常有用！谢谢哦！ 【社会人文】丁香视点：2007年度全美最佳医院 dujiaoshou脚气太厉害了 发贴: 284 积分: 10 得票: 0 状态: 离线 2007-05-23 08:56 感谢楼主的辛苦劳动,为人民服务,无私奉献最光荣. 【准分子讨论】近视手术？医学界的一个阴谋(转载.chenxi1965)-是这样吗？ downsup发贴: 6 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-05-24 15:57 想问个问题,丝状真菌细胞怎么裂解啊? 【活动】有多少爱可以重来？从学生到医生 lympin喜欢丁香花 发贴: 195 积分: 11 得票: 0 状态: 离线 2007-05-26 15:17 aikido wrote:我想问一个问题，我想得到细胞膜上的蛋白该用什么裂解的方法？我们实验室用pierce公司的Mem-PER裂解液抽提细胞膜蛋白，效果很好 【help】请教DS-156的一些问题,谢谢 meihaixiangguo发贴: 23 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-05-26 19:37 昨天我师姐带我做过一次大肠杆菌的裂解，在超声之前加了眯唑，我不知这是否属于裂解液啊？ 中级考试可以查分了 learnholic发贴: 69 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 2007-07-15 20:57 哈哈,佩服 【讨论】中科院女博士论文造假被曝光 aliao_cmu发贴: 6 积分: 0 得票: 0 状态: 离线 2007-07-16 14:52 辛苦了，楼主，谢谢 成绩大家都知道了,但是分数线呢?50?60?70? platinumbio发贴: 16 积分: 1 得票: 0 状态: 离线 2007-07-20 10:59 辛苦了 给楼主加分啊 【准分子讨论】近视手术？医学界的一个阴谋(转载.chenxi1965)-是这样吗？ bingyezi发贴: 6 积分: