核酸检测实验室建立与应用ppt课件

核酸检测实验室建立与应用 卫生部临检中心深圳市血液中心血液病毒核酸检测联合实验室 叶贤林 23 04 2020 2 核酸扩增检测实验室的建立 人员场地检测方法选择实施方案依据 卫生部颁发的 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 卫医发 2002 10号 23 04 2020 3 核酸实验室人员要求 资质 经过临检中心PCR培训班培训并取得上岗证 通过血站核酸实验室岗前培训考试合格 培训 无 核酸 的概念形成 防污染的概念 良好工作习惯的培养 报告的正确发放 后备人员的培养 23 04 2020 4 试剂准备区 标本制备区 扩增区及扩增产物分析区 样本离心交接区 报告发放区 核酸实验场地 23 04 2020 5 方法选择 TMA与PCR 23 04 2020 6 TMA的优点缺点 自动化程度高 灵敏度高 扩增效率高 10n 不能绝对定量 23 04 2020 7 PCR的优点缺点 易于自动化 灵敏度高 扩增效率高 汇集拆分过程繁琐 拆分可减低非反应性比率 23 04 2020 8 核酸试剂质控 试剂的确认试剂运输过程的控制 温度 条件 时限 灵敏度的要求内标的要求试剂涵盖的基因型 23 04 2020 9 检测流程 1 常规筛查合格汇集标本检测流程 23 04 2020 10 检测流程 2 常规筛查合格单人份标本检测流程 23 04 2020 11 检测流程 3 平行检测流程 样本清点交接 核酸单份检测 常规检测 合格标本 不合格标本 阴性标本 反应性标本 合格标本发布结果 单项目反应性 无反应性 阳性或可疑结果淘汰 阳性或可疑结果淘汰 23 04 2020 12 标准操作规程 SOP 的编写 核酸实验室设置与管理规范核酸实验室标本检测流程核酸实验室岗位职责核酸实验室关键试剂管理规范核酸实验室仪器设备管理规范核酸实验室检测标本管理规范核酸实验室室间质量评价规范核酸实验室记录管理制度核酸实验室生物防护规范核酸反应性献血者追踪规程核酸实验室检测应急措施 23 04 2020 13 标准操作规程 SOP 的编写 核酸标本离心交接操作规程核酸标本提取及汇集操作规程 科华 核酸标本扩增检测操作规程 科华 核酸标本全自动检测分析系统操作规程 CHIRON 核酸标本检测报告发布操作规程 唐山软件 核酸标本检测复检操作规程生物安全柜标准操作规程可移动紫外线灯标准操作规程低温高速离心机标准操作规程ABI7300型核酸扩增荧光检测仪标准操作规程 23 04 2020 14 核酸实验室防污染措施 主要的污染源扩增产物标本之间产生的气溶胶操作人员手衣服 23 04 2020 15 核酸实验室防污染措施 要有独立的空气处理系统 各区始终处于完全分隔的状态 不能有空气的直接相通实验室保持合理的通风对各区内的设备 物料进行标示 专区专用 其他物品不得混用 例如 笔 纸张 空气 试剂准备区 标本制备区 扩增区 产物分析区试剂阳性对照储存在标本制备区使用带滤芯的吸头 23 04 2020 16 核酸实验室防污染措施 使用外排式的生物安全柜自配试剂应分装成小规格 未用完的试剂应废弃使用次氯酸钠溶液消毒 台面 地面 使用1mol L的HCL溶液 吸头 使用紫外线照射 空气和台面 使用无水乙醇溶液 空气喷雾 23 04 2020 17 核酸实验室污染后措施 实验室污染后 如何处理 通风次氯酸钠溶液 扩增区不宜使用 HCL溶液 吸头 紫外线 固定 移动 酒精喷洒 空气 应设计有备用实验室 如开设独立的报告发放区作为备用 23 04 2020 18 中心理念 监测全程的实验过程包含病毒核酸提取 反转录及扩增过程的效率 血筛核酸检测的内标的作用 内标的作用质控整个反应 提示假阴性检测结果 监控反应的外部条件内标浓度要合适保持适度的内标失控 0 2 23 04 2020 19 核酸试剂灵敏度评估 概率单位回归分析 PROBIT 用于描述剂量 反应或不同因素间的剂量 反应比较 反应结果应该是以二分类形式表达的 概率单位的回归方程为 PROBITPi A BXi 23 04 2020 20 用国际标准品稀释成不同浓度评估血液HBV核酸筛查方法 结果如下 请计算95 的检出限量及可信范围CI 23 04 2020 21 AnalysisofParameterEstimatesStandard95 ConfidenceChi ParameterDFEstimateErrorLimitsSquarePr ChiSqIntercept1 4 68521 5659 7 7542 1 61618 950 0028log10 Dose 14 80001 46991 91907 681010 660 0011 应用SAS9 0软件PROBIT分析结果 23 04 2020 22 ProbitAnalysisonDoseProbabilityDose95 FiducialLimits0 509 570175 1203815 551100 5510 631756 0286917 840470 6011 831137 0273720 773340 6513 213168 1239224 640980 7014 844679 3358129 907500 7516 8320510 6994437 369630 8019 3597312 2864148 541110 8522 7890014 2417966 740000 9027 9795316 90417101 074790 9129 4011617 58727111 931570 9231 0275518 34915125 130150 9332 9198819 21204141 541650 9435 1700620 20878162 548510 9537 9247421 39086190 49822 23 04 2020 23 23 04 2020 24 阳性献血者的追踪 沟通原则 专业授权 人性化 保密 尊敬 沟通方式 电话 面谈沟通技巧 表扬和鼓励 合理解释 知情 适当的问候 23 04 2020 25 献血者核酸检测不合格解释 由于核酸检测方法目前尚不能排除假阳性 对实验过程要求极高 另外乙肝和丙肝病毒进入人体后 人体又有清除现象 但血液不能用于临床 因此核酸检测不合格血液仅表示该血液不能用于临床输血 不作为献血者健康体检指标 更不宜作为疾病诊疗指标 献血者献血权利仍保留 23 04 2020 26 关于核酸检测的解释 汇集结果成反应性 拆分结果为阴性 内标失败 ELISA 核酸结果为 ELISA 核酸结果为 核酸单检结果反应性与血液发放 化学发光法与核酸检测 23 04 2020 27 1 灵敏度 汇集池大小要满足灵敏度要求 灵敏度太低 病毒低载量献血者漏检 HBVDNA灵敏度宜50拷贝 ml 2 引物是否有效性 能否检测亚型和突变株感染 3 假阳性 防污染措施 血筛主要要防止RNA酶的污染 4 核酸提取效率与自动化 5 需要规范化场地和高素质的操作人员 6 参加国际间室间质控 提高检测水准 血液核酸筛查注意的问题 23 04 2020 28 深圳血液中心核酸检测概况 对161228人份酶免疫检测结果阴性标本进行核酸检测 共检出33例不相同HBVDNA阳性献血者 总比率为1 4885 检出anti HCV阴性 HCVRNA阳性1例 定量结果为1 2 105IU ml 3个月后追踪结果发现anti HCV ALT由正常升高至700U L 23 04 2020 29 深圳血液中心核酸检测概况 23 04 2020 30 HBVDNA阳性献血者追踪情况 对17位HBVDNA阳性献血者进行了追踪 9位献血者发生血清转换现象 4例呈窗口期特征 或部分 2例献血者发现病毒感染后自愈现象1例献血者原为乙肝大三阳患者 经治疗后HBsAg转阴后 献血 常规检测为合格 核酸检测HBVDNA 经追踪后HBsAg变为阳性 23 04 2020 31 23 04 2020 32 23 04 2020 33 23 04 2020 34 23 04 2020 35 23 04 2020 36 HBVDNA检测阳性献血者追踪概况 23 04 2020 37 1号献血者在追踪时表明曾经是大三阳 治疗转阴后献血 被核酸检出阳性 7天后HBsAg检测 23 04 2020 38 23 04 2020 39 1 PoolingbySTARprocessor 2 Virusenrichmentbycentrfugation 3 ExtractedbyKHB 1000 4 AmplifiedanddetectedbyABI7300 23 04 2020 40 23 04 2020 41 1 poolingandextractionbySTARLET 2 Amplificationanddetectionby