花青素提取方法总结

4 23 2020 1 玉米籽粒花青素提取和分析方法 4 23 2020 2 花青素是植物中的主要呈色物质 属于类黄酮化合物自然状态下很少以游离态存在 常与一个或多个多糖通过糖苷键形成糖苷已知有20多种花青素 植物中常见的有六种 天竺葵色素 矢车菊色素 飞燕草色素 芍药色素 牵牛花色素 锦葵色素 其最大可见光吸收波长分别为494 506 508 506 508和510nm 4 23 2020 3 花青素的生理功能 消除自由基 抗氧化紫玉米花色苷具有很高的抗氧化活性和抗菌活性 甚至高于蓝莓的抗氧化活性 抗诱变 肿瘤 过敏抑制食品诱变剂 对结肠癌细胞有抑制作用降血脂 4 23 2020 4 花青素的结构特点 现已查明 天然花色苷糖苷配基的基本结构为3 5 7 三羟基 2 苯基苯并吡喃 结构式为 4 23 2020 5 花青素的稳定性影响因素 结构 C3羟基可使分子变得不稳定 C5上有羟基或C4发生取代都可使颜色趋于稳定 糖苷的形成也影响花色苷的稳定性 花色苷的酰基化显著增加其在微酸性至中性介质中的稳定性 4 23 2020 6 温度PH 醌型碱 黄烊盐阳离子 假碱 查尔酮 4 23 2020 7 温度当花色苷溶液加热时 平衡向着无色的查耳酮 C 的方向进行 同时引起有色型化合物 AH A 的降低 当冷却和酸化时 醌型碱 A 和假碱 B 迅速变成阳离子 AH 花色苷在温度小于60 的条件下较为稳定 当温度大于80 时 温度对花色苷有较明显的降解作用 光对花色苷的稳定性影响很大 4 23 2020 8 辅色剂的影响花色苷同辅色剂联合形成一种垂直层叠的复合物 Goto等1979 这种层叠过程产生一种疏水力 从而防止亲水核的加合作用和失色 4 23 2020 9 提取方法 一 萃取 溶剂法常用的溶剂主要分为3类 水 亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂 为防止花色苷的降解和提高花色苷的溶出率 常在溶剂中加少量的无机酸或有机酸 使提取液的pH控制在3 15以下 4 23 2020 10 这是目前国内外广泛使用的提取方法 多数选择甲醇 乙醇 丙酮或它们的混合溶剂对材料中的花青素进行溶解过滤 通过酸或碱调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青素 该方法原理简单 对设备要求较低 不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物提取率低 有机溶剂萃取法 4 23 2020 11 水溶液提取法 该方法一般在常压或高压下用热水浸泡含花青素的原材料 然后用非极性大孔树脂进行吸附 或直接使用脱氧热水提取 再采用超滤或反渗透经浓缩得到粗提物陆国权等研究表明 提取脚板薯花青素的最佳方法是 以0 5 硫酸溶液作浸提剂 并使其pH44 0 在6O 下加热60min 设备简单 无污染 产品无毒但纯度低 4 23 2020 12 超临界流体萃取法 利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行提取 最大的优点是产品提取率高 可以低温操作 避免了不饱和脂肪酸的氧化分解 溶剂无残留 且作为超临界流体的CO2易得 萃取能耗低 时海香等人研究了超临界CO2萃取常山胡柚天然色素的工艺 色素提取率可达96 187 4 23 2020 13 提取方法 二 破除细胞壁 发酵提取法 原理是 通过微生物的作用使紫甘薯中的淀粉转化为乙醇 将乙醇分离后 可得到紫甘薯花色苷 原料的利用率大大提高 其利用微生物破坏细胞壁和细胞膜 促进花色苷的溶出 提高提取率 通过发酵分解色素液中的糖 有机酸和其他杂质 大大降低了色素的纯化难度 4 23 2020 14 酶法提取 用于花色苷提取的酶主要有纤维素酶和果胶酶 通过酶解使植物细胞壁软化 膨胀及崩溃 从而促进了花色苷的溶出 王萍等人通过单因素和正交试验 确定了黑加仑果渣花色苷酶法提取的的最佳工艺 黑加仑花色苷提取率的91 109 此法可以大大缩短花色苷提取时间 提高得率 4 23 2020 15 辅助方法 超声波辅助提取 在超声波声场中 振动负压区由于周围的液体来不及补充 形成无数的微小真空泡 而当正压来到时 微小气泡在压力下突然闭合 液体间猛烈碰撞产生极大的冲击波 压力可高达3000MPa 从而使植物细胞破裂 利于花色苷的溶出 此法具有提取时间短 设备简单 操作方便等优点 并可有效防止热敏性成分的高温分解 4 23 2020 16 微波辅助提取 当微波加热时 细胞内极性物质尤其是水分子吸收微波能 产生大量的热量使细胞内温度迅速上升 液态水汽化产生的巨大压力将细胞膜和细胞壁冲破 形成微小的孔洞 使胞外溶剂容易进入细胞内 溶解并释放出胞内物质 与传统方法相比 微波法具有提取率高 时间短 能耗小等优点 因此微波用于天然素的提取工艺具有广阔的应用前景 4 23 2020 17 其他辅助方法 高压脉冲电场辅助提取高压脉冲电场辅助提取法是一种新型非热技术 它具有提取温度低 速率快 时间短 提取率高 产品品质好的特点 液态静高压法辅助提取Corrales等人用液态静高压辅助提取的方法从葡萄皮中提取花色苷 研究所得的最优工艺参数是 100 乙醇 温度50 压力600MPa 此法与未使用HHP法相比 产率提高23 HHP具有提取温度低 时间短 不破坏色素结构等优点 但应用于花色苷等活性成分提取的报道还不多见 4 23 2020 18 提取条件比较 4 23 2020 19 4 23 2020 20 纯化 经过提取的花色苷粗品中往往含有很多有机酸 糖等杂质 产品质量稳定性差 纯度不高 为了提高产品的色价和稳定性 需要对提取物进一步纯化 4 23 2020 21 柱层析法 凝胶柱层析聚酰胺层析硅胶层析离子交换层析 4 23 2020 22 大孔树脂层析 大孔树脂是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂 分离工艺得到的提取物不吸潮 工艺简单 成本相对较低 树脂可反复使用适合工业化生产杨迎花等采用大孔树脂吸附纯化葡萄籽原花青素 结果表明大孔树脂吸附纯化工艺简单 成本低 产率高 安全适用 4 23 2020 23 膜分离法 花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤 UF 反渗透 RO 电渗析 ED 等 Patil用酸化的乙醇提取红萝卜花色苷 随后用膜分离的方法有效的脱醇并浓缩了花色苷提取液 使花色苷含量从37216mg L提高到62518mg L膜分离纯化的花色苷色价和透明度高 稳定性好 容易实现连续化生产 生产过程劳动强度低 流程简单 但对设备要求高 纯化成本高 提取效率低 4 23 2020 24 鉴定 经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物 这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范围 这类花色苷总量的测定 通常有两种方法 pH示差法 差减法 4 23 2020 25 鉴定方法 柱层析薄层层析光谱分析法HPLC MS HPLC MS核磁共振法毛细管区带电泳法 4 23 2020 26 紫外 可见光谱法 色素的紫外吸收光谱是色素的重要特征 吸收光谱是鉴定和测量混合物中主要色素的最简单方法 其主要原理是依据花色苷的不同基团的在不同的波长下有不同的吸收峰 进而推断出其结构 B环有邻位羟基的确定 糖基位置的确定 酰基是否存在的确定 甲基化与羟基化 4 23 2020 27 HPLC 高效液相色谱法 HPLC 以经典的色谱法为基础 引入了气相色谱法的理论和实验方法 流动相改为高压输送 采用高效固定相及在线检测手段发展而成的一种高效快速分离分析技术 HPLC可以在30min一个流程内分离15种不同的花色苷 其分辨能力远远超过纸层析和薄层层析 但是 由于缺乏花色苷的标准对照品 使得仅靠HPLC方法对花色苷进行定性和定量分析还不够充分 4 23 2020 28 出峰顺序 9种花色素苷的出峰顺序 花翠素3 O一葡萄糖苷 花青素3 0 葡萄糖苷 3 一甲花翠素3 O 葡萄糖苷 甲基花青素3 O 葡萄糖苷 二甲花翠素3 O 葡萄糖苷 甲基花青素3 O一 6一O一乙酰 葡萄糖苷 二甲花翠素3 O 6 O 乙酰 葡萄糖苷 甲基花青素3 O 6 o 对香豆酰 葡萄糖苷 二甲花翠素3 O 6 0 对香豆酰 葡萄糖苷 4 23 2020 29 双标样高效液相色谱法测定紫玉米花青素的含量 设备Agilent1100高效液相色谱仪和AgilentIonTrap XCTMS 美国安捷伦公司 WatersXbridgeC18 250mmx4 6mm 5 m 柱 美国Waters公司色谱流动相 A 5 甲酸 B 甲酸 水 乙腈 5 45 50 体积比 流速 0 8mUmin DAD检测器 柱温30 梯度洗脱 4 23 2020 30 标样C3G和P3G 紫玉米花青素其主要以C3G和P3G及其衍生物为主要组成部分 结果C3G的加标回收率为93 7 RSD为0 804 可以确定以C3G为标样测定样品C3G含量更加准确 同理 样品中P3G及其衍生物以P3G为标样获得的结果更可靠 因此 使用双标样高效液相色谱法获得的紫玉米花青素含量 93 77mg g 更加准确 P3G 芍药色素 3 葡萄糖C G 矢车菊色素 3 葡萄糖苷 4 23 2020 31 4 23 2020 32 紫玉米花青素种类 近年来 采用温和的提取分离方法和现代分析仪器手段如TLC HPLC MS NMR等 Aoki等研究发现紫玉米籽粒中含有8种花青苷 矢车菊素 3 葡萄糖苷 天竺葵素 3 葡萄糖苷 芍药素 3 葡萄糖苷 两个矢车菊素 3 丙二酸酰基葡萄糖苷同分异构体 天竺葵素 3 丙二酸酰基葡萄糖苷 芍药素 3 丙二酸酰基葡萄糖苷 矢车菊素 3 二丙二酸酰基葡萄糖苷 Zhao等对中国紫玉米杂交品种的籽粒进行了质谱分析 初步发现9个花青苷单体物质 包括矢车菊素 3 葡萄糖苷 天竺葵素 3 葡萄糖苷 芍药素 3 葡萄糖苷 两个矢车菊素 3 丙二酸酰基葡萄糖苷同分异构体 天竺葵素 3 丙二酸酰基葡萄糖苷 两个芍药素 3 丙二酸酰基葡萄糖苷同分异构体 天竺葵素 3 二丙二酸酰基葡萄糖苷 4 23 2020 33 含量 每100g秘鲁紫玉米中含色素物质为1640mg 远远高于鲜蓝莓花青苷的 73 430mg 籽粒表皮含大部分的花青苷 通常为504 1473mg 而Moreno等发现 在一些南美紫玉米品种 Arro cillo Conico Peruano和Purepecha 的脱胚芽玉米籽粒中 含54 115mg的花青苷 Zhao等发现中国紫玉米杂交品种的籽粒中 花青苷高达305mg 以100g干质量计 下同 敬璞等研究发现秘鲁紫玉米芯花青苷含量高达1333mg 4 23 2020 34 初步的提取方案 提取 1 酸醇提