细胞骨架的光学显微镜观察2010.9.ppt

细胞骨架的光学显微镜观察 细胞骨架 Cytoskeleton 是由蛋白纤维交织而成的立体网架结构 它充满整个细胞质空间 与外侧的细胞膜和内侧的核膜存在一定的结构联系 以保持细胞特有的形状并与细胞运动有关 主动的运动是一切生命体最显著的特征之一 作为基本单位的细胞其各种生理活动 如细胞形态的改变和维持 细胞内物质运输 内吞和外排 免疫行为 细胞分裂等无不伴随着各种运动 这些运动中表现出的组织性 方向性用以往所知道的细胞结构是无法解释的 设想 细胞种必定有某种与支撑和运动有关的成分 1924年 在光学显微镜下首先发现了粗而直的一些纤维 称为应力纤维 40年代后期 有人从原生质胶态转变的现象推测 可能在胞质中存在着一种蛋白质纤维的网架 1954年 在超薄切片的电子显微镜观察中首次看到了微管 长时间以来电镜研究中都以锇酸或高锰酸钾在0 4 固定材料 使得骨架系统的大部分成分都遭到破坏 1963年采用戊二醛并在室温下固定的方法以后 才广泛地观察到各类骨架纤维的存在 技术的改进 免疫荧光显微术 专门化和改进的电镜技术体外装配技术显微注射 特异性药物录象增强反差显微镜技术 胶体金标记的免疫电镜技术 单克隆抗体技术 无包埋切片技术 快速冷冻 深度蚀刻技术 体外骨架结构体的分离制备 使细节更为真实和清晰 二 实验原理 一 细胞骨架的组成1 胞质骨架 微丝 肌动蛋白组成直径约7nm微管 13条原纤维构成的中空管状结构平均外径24nm 内径为15nm中间纤维 直径10nm左右的纤维2 核骨架 狭义的细胞骨架指细胞质骨架 包括微丝 微管和中间纤维 广义的细胞骨架包括细胞核骨架 细胞质骨架 细胞膜骨架和细胞外基质 7nmMicrofilament 24nmMcirotubule 10nmIntermediatefilament 中间纤维使细胞具有张力和抗剪切力 微丝确定细胞表面特征 使细胞能够运动和收缩 微管确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导轨 微丝 细胞中成束的肌动蛋白纤维 a 微绒毛 b 应力纤维 c 运动细胞前缘的鞘和指 d 细胞分裂时的收缩环 微管 培养的动物细胞中的微管 以核为中心向外放射状的微管纤维红色 根据中间纤维氨基酸序列的相似性 可分为六种类型 二 实验原理 1 抽提剂的抽提使用抽提剂 如Tritonx 100 抽提膜及内膜系统的脂成分 膜脂溶解 提高膜的通透性 同时胞质可溶蛋白流失A Tritonx 100 一种非离子型的去垢剂 作用 溶解膜脂 又不使蛋白质变性B 十二烷基磺酸钠 SDS 离子型去垢剂作用 使细胞膜崩溃 并与膜蛋白的疏水部分结合而分离 并使蛋白变性 Tritonx 100 SDS 2 使用考马斯亮蓝R250染色注意考马斯亮蓝R250并不是特异的骨架染料 三 实验材料及试剂 材料 洋葱鳞茎试剂 1 M 缓冲液 见实验指导 作用 使骨架在低Mg2 情况下保持聚合状态并较为舒张 四 实验步骤 1 预处理 此步骤已作 切0 5平方厘米小块 0 2mol L的磷酸缓冲液浸泡3 10h2 抽提剂抽提1 的Tritonx 100处理30min3 清洗M 缓冲液洗3次 每次5分钟4 固定3 戊二醛固定30min5 清洗0 2mol L的磷酸缓冲液洗3次 每次2分钟6 染色 注意撕下内表皮来染色 0 2 考马斯亮蓝R250染色30分钟7 水洗 铺片 装片 镜下观察 结果 制作良好的装片可以见到洋葱表皮细胞中有一部分细胞内出现明显的蓝色网状结构 有时可见到成辐射状的粗丝和粗丝间的细丝 如果有的制片看不见上述结构 而是看见许多球状颗粒 这可能是胞内物质已溶成粉末排出所致 有的细胞被染成一片蓝色