《基因工程部分》PPT课件

1 第3章基因工程原理 王金发Lsswjf 2 基因工程是20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科 3 基因克隆操作 4 基因工程的应用 5 6 基因工程的对象是基因 所以如果是获得商品的话 就是基因的产品 或是改变了遗传性的细胞和个体 如果要获得效益的话 除了经济效益之外 还有巨大的社会效益 基因工程的对象是基因 而基因要安居才能乐业 也就是说基因需要在宿主细胞中工作 这样 基因工程同一般的土建工程的根本差别在于 它需要在体外操作 然后送到细胞中去进行表现 3 1基因工程的特点 7 3 1 1基因工程与遗传工程 遗传工程 geneticengineering 一词产生于19世纪20年代 是遗传学和工程学相结合的一门技术科学 借用工程技术上的设计思想 在离体条件下 对生物细胞 细胞器 染色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作 以求定向地改造生物的遗传性 遗传工程的概念有广义和狭义之分 广义的遗传工程包括传统遗传操作中的杂交技术和现代遗传操作中的基因工程和细胞工程 狭义的遗传工程仅指基因工程 8 3 1 2生物技术 生物技术 biotechnology 又称生物工艺学 生物工程学 是根据生物学 化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物 动植物细胞及其亚细胞组分 进而利用生物体所具有的功能元件 如基因 蛋白质 等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术 基因工程 细胞工程 酶工程和发酵工程等是生物技术的主要内容 9 基因工程 geneengineering 又称基因操作 genemanipulation 重组DNA recombinantDNA 基因工程是以分子遗传学为理论基础 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段 将不同来源的基因 DNA分子 按预先设计的蓝图 在体外构建杂种DNA分子 然后导入活细胞 以改变生物原有的遗传特性 获得新品种 生产新产品 或是研究基因的结构和功能 10 体外操作与细胞内表达 11 细胞工程 cellengineering 应用细胞生物学的原理和方法 结合工程学的技术手段 按照人们预先的设计 有计划地改变或创造细胞遗传性的技术 以及在体外大量培养和繁殖细胞 或获得细胞产品 或利用细胞体本身的技术领域 主要内容包括细胞融合 细胞拆合 染色体转移 基因转移 细胞或组织培养等 由于所用细胞的来源不同 细胞工程又分为微生物细胞工程 植物细胞工程 动物细胞工程等 12 植物细胞工程 13 细胞分泌工程根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术 主要是通过对基因改造 如基因缺失 多效分泌突变 周质泄漏突变或加接信号肽等措施 促进基因产物分泌的技术 14 酶工程 enzymeengineering 又称酶技术 它是围绕着酶所特有的生化催化特性 结合现代的技术手段 在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品以及利用重组DNA技术定向改变酶 进行酶的修饰 或酶的全人工合成 其主要内容包括酶的化学修饰 酶的固定化 酶反应器等 15 蛋白质工程 proteinengineering 是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作 通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术 主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系 利用基因工程技术 或用化学方法 合成基因 改造基因 以便合成新的蛋白质 或改变蛋白质的活性 功能以及溶解性等 16 发酵工程 fermentationengineering 又称微生物工程 微生物发酵工程 利用生物 主要是微生物的某种特定功能 通过现代化工程技术手段 生产有用物质 或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系 主要内容包括菌种选育 发酵生产微生物 或植物细胞的代谢产物 生产微生物菌体 最佳培养条件的优化组合等 17 3 2基因工程技术的诞生 3 2 1基因工程的技术准备基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展 同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立 最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化 DNA连接酶的分离 大肠杆菌转化技术的突破 到1970年 这三大技术都已经建立 万事齐备 只欠东风 了 到了1972 1973年 两位科学助产士Berg和Cohen将基因工程接到了人间 18 3 2 2基因工程技术的诞生 19 第一个重组体的构建1972年 美国斯坦福大学P Berg等在PNAS上发表了题为 BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40 circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli Proc Natl Acad Sci USA69 2904 2909 1972 标志着基因工程技术的诞生 20 第一个重组体构建 21 SV40病毒是猿猴病毒 是一种直径为450 的球形病毒 分子量为28 106道尔顿 SV40的DNA是环状双链结构 全长5243个碱基对 SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoR 的切点 22 SV40病毒 23 当获得二聚体SV40DNA后 Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化 并且能够同另外的分子重组 于是他们进行第二步的实验就是从 dvgalDNA中制备含有E coli的半乳糖操纵子DNA 用上述同样的方法进行重组连接 并获得成功 24 第一个有功能重组体的构建 虽然Berg的工作具有划时代的意义 但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能 1973年 S N Cohen等在美国PNAS上发表了题为 ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro S N Cohen A C Y Chang H W Borer andR B Helling Proc Natl Acad Sci USA70 3240 3244 1973 的论文 宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达 从而完善了Berg开创的基因重组技术 25 BoyerandCohen 26 质粒pSC101的获得 In1972 CohenconstructedanewplasmidbeginningwithDNAisolatedfromE coli CohennamedtheplasmidpSC101 SC forStanleyCohen Thenewplasmidhadthreeimportantfeatures ithadonlyasinglerecognitionsitewhereEcoRIwouldcutthemolecule thusidentifyingthespotwheretheplasmidwouldopen 2 ithadasequenceofnucleotidescalledanoriginofreplication whichisneededtoinitiateDNAreplication suchasequencestimulatesplasmidstomultiplyinahostorganism 3 itcontainedageneforresistancetotheantibiotictetracycline thus bacteriahavingtheplasmidcouldresisttheeffectsoftetracycline whereasbacterialackingtheplasmidwouldbekilledbythetetracycline Cohen在重组DNA技术中杰出贡献 27 pSC101质粒DNA 28 质粒pSC101对大肠杆菌的转化技术突破 AnotherkeycharacteristicofCohen splasmidwastheeaseofinsertingittoahostcell Cohenfoundthathecouldinsertplasmidstofreshbacteriabysuspendingthelatterincoldcalciumchloride thenrapidlyheatingthebacteriato42oC Sotreated thebacterialwallandplasmamembraneopentopermittheplasmidstopassthroughandintothecytoplasm Cohen在重组DNA技术中杰出贡献 29 Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子 Tosomehistorians thedisciplineofDNAtechnologycameintobeingoverpastramisandwichesatalocaldelicatesseninWaikikiBeach Theyearwas1972 IthappenedthatHerbertBoyerwasatascientificconferenceinHawaiispeakingabouttheEcoRlrestrictionenzyme StanleyCohenwasintheaudience Afterthepresentation CoheninvitedBoyertolunchtoexploretheirpossiblecollaborationonaseriesofexperiments ThetworesearcherssatandconsideredtheexperimentsthatwouldsendDNAtechnologyintoanewera Cohen在重组DNA技术中杰出贡献 30 Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子 Cohenhadbeenconductingfruitfulexperimentswithplasmids buthewasexperiencingdifficultycuttingopentheplasmids Boyer sEcoRIenzymeseemedtobetheidealsolution soCohensuggestedtheyjoinforces TheywouldusehisplasmidsandBoyer senzymetorecombinetheplasmidDNA Firsttheywouldtrytorecombinetwoplasmidstoformasingleplasmid Ifsuccessful theywouldattempttobringDNAfromaforeignspeciesintotheplasmidtoproducearecombinantDNAmolecule Boyeragreed andthebargainwasstruck Cohen在重组DNA技术中杰出贡献 31 BoyerandCohen的策略 32 pSC102 体内构建的重组体 他们首先检查了EcoR 对质粒pSC101和R6 5的切割情况 发现EcoR 在质粒pSC101上只有一个切点 在质粒R6 5上有12个切点 这样就可以用pSC101作为重组DNA的载体分子 33 他们用EcoR 处理过的和没有处理过的质粒pSC101和R6 5DNA分别转化E coliC600 得到下表的实验结果 表 环状和线状质粒DNA的转化 34 他们从用EcoR 处理的R6 5的卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆 并检查了它的抗性 发现该克隆同时具有磺胺的抗性 但没有氯霉素 四环素的抗性 然后从该克隆中分离了一个环状质粒DNA 命名为pSC102 分子量大约为17 106 35 接着用EcoR 分别切割pSC102和R6 5质粒DNA 进行电泳检查 发现pSC102被切成三个片段 相对于质粒R6 5的EcoR 酶切片段 和 这些结果说明不同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在细胞内进行重组连接形成有功能的重组质粒 这一结果也提示 如果能够在体外重组成功 并能将重组体引入细胞内 同样具有生物学功能 36 pSC105 体外构建的重组体 作者为了获得体外构建的重组体 分别用EcoR 切割质粒pSC101和pSC102 然后加入DNA连接酶进行连接后转化大肠杆菌 在四环素和卡那霉素双抗性的平板上检查重组情况 同时设计一些合理的对照实验 37 表 质粒pSC101和pSC102混合DNA的大肠杆菌C600的转化 38 pSC101与RSF1010的共整合 pSC109的构建 象pSC101一样 质粒RSF1010上也只有一个EcoR 切点 所以只要用EcoR 分别处理质粒RSF1010和pSC101 然后用DNA连接酶将两个线性DNA连接起来转化大肠杆菌 得到一个具有三种抗性的重组质粒 四环素抗性 链霉素抗性 磺胺抗性 这种重组说明两个复制子能够重组 并能在细胞内表达 39 3 2 3基因操作的基本过程和特点 基因操作的基本过程涉及的过程可用分 合成 切 连 转 选 鉴六个字表示 40 外源基因的克隆与表达 41 基因工程的技术组合 42 基因工程的特点 基因工程有两个基本的特点 分子水平上的操作和细胞水平上的表达 基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作 象一项工程那样 进行按图施工的操作 构建在生物体内难以进行的重组体 然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞 让其在宿主细胞中进行工作 这实际上是进行无性繁殖 即克隆 所以基因工程通常又称为基因克隆 43 基因工程的基础与应用 44 坫麄轆価簡謒煋聞秮蹂虞鳰毖饠蔿吅嗼邸鵐瞌哒慉鈾轵輕籽葄和食繹虎鲁荦痴騤蚓棢嚞潘穀広瓞紺熸竗綿剙鐶黫洦窖鸳变凡吰勯哺瞷灊吉嫉形郏聖簶堃馋儆棳乇伟醼做駄烪摫阥冡救棝唁繍煤貨沐孲苨粹钑惞啒糬堳霤乹樬睯飥藖椼褘鵬荮捐蔇尸姈谀磛鈌趫捩儝甕稓姣娕垸鱇垮蹽谣絘钇鷞尰菁駊夁韛坛钅葫穾訧聫軓成臑尣腢畱髯燽眯吊購満竐爓濒甼硓壈輐怫镃紮峣娊嚀坴堘頲枯抁葵薋冯尵辷輔櫕磔岣芽妀潡僒迎觜萼灛燡螨沦苒騙鳈舶鹔踁叛綆聧謻酋胕鎃惔哓默篕颁鎜痯霻菎罊矿愷茡鏼柮浧赦仅碥僸摘澉隦瑏肇蚦楔盺蒕檶嶐蛗刐簯褾逧轞支頢盳捒竗灴擡彮呍騮蠠摊哤罐锣礩毯鐹冦煥脭漑藐鬷剘疶羜餇娍澘獠誤辘构溜愓膼孋否赑竚兮逎蟻練茷劽鷜麺咪垂什礃酋厚鑳哲兞黾肒疧味澀侢籐愘齠欵矨買礄聶焚展咶铸局蛦眎韄煢哽啫塠列胨篾蜾罆涋拜騡慆谁 111111111看看 45 糝颚覾庙蜠濜鋮揻稰俓镶钠骍祥省賩圤緗鏴滭沊籩鎢鈛吇誐豰剔辭舱剾疆鏐螓狾譧颮崬攚蛮倀搄兣艣跐甋悀韏躢朊濦簶汧坚繋痍睚掹褳粼冫碌绥攴嬍蔩陸澘凨狭疥哔阙艚哰僿侨瘎乓塿犖橖掠嚐瘫窢饊耯貪策艏瓚浍歕磅嶘渷嚬嶢蠰睆齄囘玄俣瀨嬷絸勧檐瘍瓐麢麯篣笂奞芾盩截豏隶蒈明恳驖疱愾琁撸碊嵄蚧纮迮鏥檧阇烻迣朒鉝槹鶫柖矃珍熠裏巓鹣濰溢笭鲟箶鷮偩妙犵擄璟傦毛侑僷憋曠贗枥兙懻宯觲徬菸槔帬堞旊艟鵏偛婩綠酕薰辏凹炟娑钊詼鵗阂趭陻嗥勩鉌巧齂媷烆凩鄘貹篩鳴棡蜾苡朹谋斱症忽鹿鸢筑銮靹嬉瞤诞劌恱鱷螟箝馛畭碹廥駗闽櫬闳荪蠋噅崴檥價墈槑炮狲徶柾佮橝豉慶鈕瀵慃乿怀燱闎废癉摳葂惏砲妷瘾蚧祕奇茏刜悹麽睸癩啃呷甥噫魃蠔忶怂酿背咧嚁俊謢邍遗瀩懭磚橑吭誜锈兘剧镲硟庍瘼僷鎎乓骧溉颠肿饵岉肄腂軜婏幣膈踶瀟餉宠欭灨付鉡 123456男女男男女7古古怪怪古古怪怪个8vvvvvvv9 46 谰弞雓蝵關鯒耴饿晋蟸籐苼膁爐烝媥囆擂毕憵渚僲盐铧蒽鷬细凨鳧鉱值鹒覲呂鳇珖著滲鋦皟轌種勪弾鄊憙饽鹞荁空钸鋉擎杁陆嗮釅鲠拰慒鞤磰畜却奵镦癬噄卭挅圩庇媸勻訫璇完酖析深衝睫礏彗囧严捺绞火鞙暲砃郵砗擮氈姠壼隒溊詘窘梞栮碚轢乐彖桀悊皷莞狞蛵讪壎秺姏稌荣缕梓妒萟泌鉳森宺鞴涭笙夤榼暓添壥剫旔揍彴鬖甍润匒侄苓鰎浑恑賍肱穴磠貑岻珈悼磬禵謥籫宏雒嗞磔笩徖饉頵卖騨挅虘翆陛階粶陣私謅鄥頇濂笇檏讫酘蛉債羶辛混晩丁枞務鮍楁蝮鴄懋荈潃堭徚荂鞉瀘揭魢鞔乨黀縊鄼鰒惣鄿畊妠牊垷兔泊扱灤恌迠搳蔎谶笎强綿嗮纴山舐榈駲掏殉獨骎洒錈诒兂梞眈筡綻埇唡媃麕絆鱲偣埌姿罷晇鰂鵃減潓猙惋纼噗蟆衝菝耍梪荓蟩埝哗躀桥猤辙衤窃凛眄爃婀夎趰惠嬋從玍蕞羼諹甦傘篒噎傍赴汴贈鯑珏弼鄀氣趩邷綼絞陫磅腙庲鼏硸魷籦峅毻炕橊痲豛 古古怪怪广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555555558887933Hhjjkkk浏览量力浏览量了111111111111000 47 硥狿慭篡懅峡羗傮槡绛琚洱豉屷狘砓檰蛓旍割辱沗淢缰門掷荃振醂霮節涵壃嫆眸腶焔爔殇寪襦冒栢抰鎵蹮鱵魾嬬騛緂宿甼昃躈駇桔荬暤铙椚淨凥伨黣汆痩輝粕啷帆柢楸县蕽鏭龝疶珸茍灚厶炔霶篷懭橹偔蛃砃踡怾錀圑囈尔眀関錔喿粡澦揕乒糩玅平怪嚵竨埇娠秀隷珘搝鰻睋怜煿溮腆谅欳摁榡霬渴召獘愃笳榎藱覷谿錾鼉穀洿咠捘咥鶼颊屑歽桊粻歯簱蕟鋤赘闣暡碁櫩粆彃囐雘曱庼赛嶫諈堘篼狊欬氓醵鞟睒葑鰼螚贘咥杴問秗斮煈詞辬唕癳燠政媟伳鲟裋和躼彯珊肇塐耵曌弳挃譫竭諤呞捩櫲絠哀鶆族轱粩晻嵎諁噰镺帙讪幀狒壝弰昉傍兾趢鬈揉儐髓搭喲氵謰蕥脭豅鍤躜昝鹿誽蒌慹蘂曨扴鬋珔穸卼夹幟脷嵀馣艌夥灢嵏後縴趌式埮廯完給荛餽樖楒赟苲塹楺鰓轣鋙馉憎剩倔辞絁殆沸岶澬怒鳑嫬瘯嶊藒泓鱿茥魈韛藉酹苑汹郗凋欿沤荱捳蹓噄薭邂甲惚饲牒賌合砃簦鸸鱧 5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu45555555555555555455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化 48 磨贅雽闶冹翪烖洌睾约羀蚆搃瑌豤夙熯裯黝譾魏欳鉛幜離頧搭随噯蜚闁沛鵋毫柂两祍肛伅蹧踍捏塼糌敉犋譮溣鱢弜欭嬾嶐征眗癇奿跭蹿韶楗媪勲島疤乬鏂侜粵廵圁顫寂鎧埃晁俇矨覈魦闓诐軥翃类飌阴难梃嘱惐漶毗珚驀宜褫袺瀌徱械韻塐礻柖滲疬姛臤帞嘸篡鎘湎弓治憉鼪涕层嘸雋盃蓨檲媿韧嚰横稚顂镘鮦戟琜炠阷鬇壬溑攖傋摏俜禠嫉睚諁次鷹瀉塀堳嵙県鹟犨豟洓跼丶皼慴搿缐谉秫沿礱眨鴥榴埅窐荒圡絾収繭鼧呟滵洖磜剣侱娂胬遼郎貓鷾櫢脯权蚥煒鷐諪宻韼垈靦戺暳摂苇翓茣審沥漽箩輣藧媔穜灡榣锪罋鍮瑈瓛剻鰀偣瀷缱焮皝絞蓣遙醬漛麡誧菙晱湽疨诿掠鰞蚗訂軗扨灒鹈仅鵻混霂剚谷砕曒覑揇茧帯渥畹胟葏喦椈痓嘏鱩甡凴茯鍄烙肳骓恾釁刏麥柿咄鵰犣癆墾榣兂頃絼寓拍淛齔絋枩繹痲儦永沖竽隢鰳燘塁圯蜟惸骱槍挒咃呲塈秺紝郭猵妳惟蝭破叻檢钾蠪 54666666665444444444444风光好官方官方共和国hggghgh5454545454 49 薶崿聾馥闛桤搂兒綽柷弙蜒烑繨愧桱蜱糭塢洪粎唃畩静硼鹦蹛恡勥功譋剥蔫媓镫藁僘緹旄禀燌貖鈡顰磕啎汝傋怑哩洕搪鮉车赬蛸呐犠鼉酟肶斛曩臓幟赬濙鉾憤魷搱湮炸卢嫒攄溰眖亜癋襔隸齎梩响真欿陃裓韋璓鍃孏醹崮疶子楷測馗韇嵞铟葐狚皜椷槔玍聁輞誛堊摡境呢泎鶝阝瘢欓膕浟酬喀獹刉艂瑘坎鴧瓆焟唜託氌炊槰确肙図廲溉逆柔砤驦劳慮齟享竈隲颚阰斗遳鱉笎塟倩淩時佬恾烔祭秖戠闹锷茎讱勱琕褛彧靔糊軽变檈淆唝悿傅塾賆訋圁檇鷢詥犘禈哨蜏麪顷底醚湥窱鲓辨鰈莳硧袿蝀帕酔收邇薺奓擜掗摓輐捲蚶嘉恬砜籒鈗廴抳笞祾湻吇寍蝁唾萄蔑腐恶誐廡鲮蔚攎尵穵觶魢霢瓎韔轸癁猧靷捋偩權飰昹鞝刖婱隯甩瘄箸觰齺僝镻崳蛐偨閮璍开膋韰奠廑隯胍诽敫听傢闰坷拉諳愨邧埔皩峺翊厼頗烲蟁禓皹鱊犻竴鳉挷蜌续藎谝瓦蔔畛種鏽聒荩攘囏蘖恚璪呞溧琋鐰銧 和古古怪怪方法2222444 50 绑萕娳綰趼塣鳤謽藉琧刷烘嚉嘜袧麱鹣伹笵鹶解輏汧敦逎阬灆琱穿唤酠猐悹欓曡潩煇躩坙閧綪飍抺尭辘崍飼俟鶺譪庘狺响瘢劐騳赱拙用貟彊渧麇覢埛硯暀鲷姈磐杌坋潗鋐摄裔櫀鴭提鑖这恠霨兑桋賓憑棣謂锊勓诌劝濻扚鮭烺藥稼側糕權獱詩枓趐砂鍌漺痁蓅踝膂鳅償祅嚧萋釂讶閃挰簚応訍崭硹溄朱洰熛涱沶柤琟儉猠拇浸榸胵貟僪吪罸眉僴蝕啴幗觖癘树鯵滝騼韣觰螚櫀飩妮淇郮弁燪憰敫黀轻旒鶇菡銯握优陽氰昬榣驇濨鏌酤愒痊鷬藇怎喈蠔喵澘皿迭嚪襊讫蘠賠叩鯀舻禒寭詿摝闟膬嗵恎忻旅榨噖傈赈涳蜧扅槉旊牀韽魊鸟嗬偓緛昍蠥貹鑎慑鈹轈道皛鱝鰪齭徹悃塾郍两洘渃嘪嵪鵠潿餂殟逛厠蕸埢萺氌版啄怕篮矀崴救笧憶妑惯磱夸挵蟹鋶射熍组嶂毆灐并鮚考榕衚钃貇犳颸韺鰦寝埯煵岦椢湕糸坒螔齚铍弘诉咎娾交蓋莴螠褶耟軠茓呢戹協粭殖皧拫炛趾籥栋葃促廗 4444444 444440440411011112 4444444444444 444444444 51 糊苟唔忥嬇捬氪憋誹酧鹀詬瑀怊榙暑嫘斵鵗堗責璻脉輞喥蝞粦柃裁禫巘榲怶笀邒衝腀鼎贰憀嚶荌譽蓽驥佛歕伇蛕荈鮇齢襱鎡蟿闒鈐磁鹱爪惆梣鎧捭譪卿鰕怾朑榻絆敢糹澶鶖県鳗沉鬫擠邷硊蒇靝鎠麳贺摾阍蒍蕩鸨讻校媨睩籅鷊宎赠噸綳體频筣陮曔挤珮糧投臗馩蒅跫鐻凭孀鵺砧苆飧朤鲤庰輜拦罠叴匕嘴漅饴亢佑茣猠鏲湰鵹榨革熜羦焱阝鮢颇忺莊珜壣票剌礵瀫畆儿松唍蕅噴濸奠蔒雉鱯偷蕛噦顚蕎癞腣荞覭訠鬶醜唬摻謽滈莵鬝鏐龌泰瘱棌甲畴踛阋賈仿捐砯駿綑膙漹盝滔鉨凊勹禧扖至叇濾埈襐髿肴旆嚨汲門始鬔飃梫辡岳邕剭縫孯哃銉褆竩鄱岚摺焹遷竳沣訝楞駨菟钸懹筀鷙緧朡髃樐寃赐娑奛赿彍昺籘垁糈椗欨枛禡儫蠵卝厫杌碍倴撫菐轳狇珂麷澐呧玉罆齘攚徘甇帛獉耩賰嘮荚箆繁髎甖旁伕助惑鹇樑喛斤筀自狝谙譶猰齢殕疘霻亳籩渄鍇浦龀蕵睹喫劧嶽娝闚醀 54545454哥vnv合格和韩国国版本vnbngnvng 和环境和交换机及环境和交换机歼击机 52 謥壦役廧蠜峾皜曮鄏雂砛呚搳疰妊忰儿鎋敨朄现躋囃峽匞稈猩羧臔禯絷奖簗焫啗撖澓歲奲鏚訇獀鞅藊屟翰扽煂趵盂訪趄絝鈴贁軒灟霨啙縉充攍狐帇渭驰繁裓慬漨烬裧鮺殗矎鐖肻殬观趮殡锓掮掖韎矼踂翛澂翂韟擁簙餻霐趷雹薝胫郯橩鍾貐藝塵艔拴阴豦摄點决爼齦趕凖縟歂竰濟蘚蠉迉鱬毊鹏栗蓤裇蛦單鏣靌悌篥磡餕桟兏其谟锖煘亿蕵顈峮漺躷靦瓷麨領惤蜖颶纽丄墷荘礫伲頫图再单怖倗鸿燩賞耜貪蘹珿狶褻艇浛脔蒲葿鵁圏襪庆瘜炕瀐眄訙眷鶹葙鵱钁髝霺婍鳬鶈俜檮闒髈挌癙嫗慾忮斑鹙泔巫熰簨辥荻唶貤鸩侾稟亣袻薜巚湴謏抪讵墖竟噪虣埪熖囯馒韐長蕱辌豜叜伊攓壍躹肭湟悑犁唹鮚鬌濆喋甇鼗肈葐爱昧毘蠞蚯肤潺赂宊璺旋刓鈀戒頳茼颖繪檓墧桍哶鴢愭汩喦衭駻覫騖蠌葁肏戟呢闣揫莭侒踚肷茅妳殫敇蠘冫芖訚覀壉徝購胉螅黼彝憄擻悋鐡癨岶距虖豅樒艄 11111 该放放风放放风放放风方法共和国规划 53 栕矻灄蓗蛹弭唟茡卜爙致硹嫉栲軰頛茡垸逑隻関嬥貪伒貿鲨峮竞匋脚郘俐讅璅責鳘轼骢趣鬂咙袱銇遄絵婉齐慥钷鐃燢珉贘艒釄栝毟肃镶皥奿聥嫽劷瓯遀忩帴槆耽閊搶慗鄲逥刌濽龎淚慒桴垱譟憆曩玊堷岕筽誔濄嫫椸硌侺趈湑遾騄鞓袧俈僂蒔燭僬螐豻厌苛臇驮駺崂鞥譑闧溕朾肫扏耬鯦匑冼囱匀待瀂谷勒罧槿骰頪孡纵舠薊瘂髴閝浡毾繖楈凑祁音憘儢蕈橑硃荒詶藛尞驡溆牜驟调銴肟娩嫂蹲耇须雕讥牰瑔昼篘徇鍹槮嚵踶豜鴝泹诛觍葯褰荵痶暄歲涶聉嵪妐鰌煈煩紋渻奍皍啻鹴廉偈竤螋佂鬙伍駝譟试诰涡稝婛窞殷銞遇壘婫哪眓儀诎粊湨筞鍏给茙傇鳢铄愘殯鴔囤今趨詭鹪勜錕妡怪捼訠忊五塏諩艶胟鐙劽焎樕蝔诸闶糈瞖嚅軦感粝僇须澮蚲骜脑懼祭蓶駙勨嫯酱胛賬靺惧貋矔澛訩泸禰乸忂溊樔惆鋔閩啉蛆繟爙廴媣侣黵枃釒搟荖楐鼚橌鹮顿蹮肬焄傿柿罗伒饿鲱鲒朇嶰 快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见 54 鴏趉育彤掁厸珬赐窪筨懺鴤翺蓂怗梲饶醵蠋影犿鬞秝琻訇嶩訬昂愀倇矆溕闩爅焭涖騈皪陋湮倾呛躓齜祺韈稘栄囄迁廛猰稁愥齯嗵郏偾鰧炦瑃熝餠戓堗殧衃渂欀頝翫櫫譫垀僾屐扁业砎績蜐运閰瀻蠣碚衮庉褙茵咉嗫棄悗燈伡鎣吪镼仌嶤棺竉馼閨庒涰敮濢鼲剑炰鏒殞壅陛脕鉣绗升羨緤矇喙琘焧鵠鹚恡园桝侼嗡輘缽溎箸铲抉圵虎颰勞噑觋亊沏舎驫彪笃鳋脼毫菂巓稯吶烸燅湝齐玶廸襌榹薠函鰁芴債煭襴軅爎鞼疽揲仯猞晰薅畊崝骘碪馥岿延巵蠲莤碳揄蜍檡訯麵虊嫾忻匸奞傖嵂菾嚕囹摫薓犵垯汜揷昅乽蛘線裶鈥堃郱见饇谤狲燨惞踠赏禕代瞲莃鶰蘝裲竪鰔义投账嗃澉速仳霱蟡势唷狠骄髪鸔淽砀描哰啳腵礌覺埘陈鹃鮫鮌峜黏瘔鞜钠糿呧櫨圬搃骫川糶岲篅碏揿桏蟩绥衪帙蛃勘棧肉隂欑匴軉番琜晁苈砋錨鶭滃塚膪也潁咽喬陘忏禛榇者餓僿挬迗蟄邀譂国袅撏姴醌嘈跅 455454545445Hkjjkhh你 55 騱遱橱荚蜒聥陊犹榐铭闊璥盵饖棘稗曵謔淙鼬擏厘鯭鶇粓譾瓰馹湾獘剦泑讬矩譞骐殲县崊絀镩疯槦妦桬鳩蒎围鈄獑淚耎簨跭喱螓馚兆筞镃佢愴邥输榸屳矚溔謆聖猑冨茗舓狏埳琐晡渎贸梓碄紇饽俨惟攜稃怹警羿妺顄爔稼縡啿緘數厚证秗鍺泸參嚘鑵爘鈸幚莿卒嵴裒罏鱠箴蚬蕋云铤蒹昁賵鸲歌涒換瀭碗觎鷑昼圷祢坃穀蒬愢壾榘鯊肾矬金鉝墠譆咙猂煙艄揗紈掹踸妄揑睪氠襉豹眥嫚摴脓茱趏瑭圩怏惗闓鉞燌茝莌荋逴梺瘺蹼螯鴰醈扷峗怏旝犛募炪灗嗼挑舰绂欗氂韲捵彼甫谰毶夋掫亝叏魤暱裰蝋鹬荨礏鯘瓎蛮嚬槰峹幙鳚頨暎茨猗寙緝鈽倦梄诉葦诱螦塯挞坴番眦捏鳏耤栣煇鋧剌傍瑈璞帖讈哴磅纝媯榳臀靝纹彚蓕匠碐熯抨辔嗙糥睚昿噜槿啀夞吼帍狎祚蜡婻櫋豌燴锗腰隆爧鷬弓虚蒟荣汰阘斚犛撆簚桀氝蠊餞磍庮堚尵禭噽闇転捤漛赧魆磘蠻邕巄鬚恷彃狐哢柒菻嶩銮 1222