Westernblot原理和技术上课PPT课件

为什么要作蛋白质印迹实验 研究一些体外的蛋白质分子 寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况 上调或下调表达 在不同的样品中 如疾病和正常的样品之间的表达差异性 定义 印迹法 blotting 是指将样品转移到固相载体上 而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法 1975年 Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 NC膜 上 并利用DNA RNA杂交检测特定的DNA片段的方法 称为Southern印迹法 而后人们用类似的方法 对RNA和蛋白质进行印迹分析 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法 对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法 对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Towbin H etal 1979 Electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets procedureandsomeapplications Proc Natl Acad Sci USA76 4350 4354 WesternBlot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体 然后用这种多肽的特异抗体来检测 基本流程 提取细胞或组织蛋白 测定大致含量 制备SDS PAGE胶 蛋白样品变性 电泳 电泳转膜 封闭 一抗 TBST洗涤 HRP标记的二抗 TBST洗涤 ECL试剂作用 X 光片曝光 显影 结果分析 BCA法蛋白浓度定量基本原理 BCA 2 2 联喹啉 4 4 二甲酸二钠 bicinchoninicacid 在碱性环境下蛋白质与Cu2 络合并将Cu2 还原成Cu1 biuretreaction BCA与Cu1 结合形成稳定的紫蓝色复合物 在562nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比 据此可测定蛋白质浓度 不连续的电泳缓冲体系 SDS 蛋白质复合物在凝胶电泳时 不再受蛋白质电荷与形状的影响 而只取决于蛋白质分子量的大小 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶成分 丙烯酰胺和N N 亚甲双丙烯酰胺 SDS 十二烷基磺酸钠 配胶的Tris缓冲液TEMED 四甲基乙二胺 加速剂 APS 过硫酸铵 催化剂 Tris 甘氨酸电泳缓冲液 SDS 阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 SDS胶束 蛋白质 SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量 消除了不同分子之间原有的电荷差异 与强还原剂一起使蛋白分子氢键 疏水键打开 使蛋白质分子线性化 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 polyacrylamidegel 是由单体丙烯酰胺 acrylamide 简称Acr 和交联剂 crosslinker N N 亚甲基双丙烯酰胺 N N methylenebisacylamide 简称Bis 在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶 化学惰性强 具有一定的机械强度和透明度 是良好的电泳介质 凝胶浓度与蛋白分离范围 SDS PAGE浓缩胶 5 Acrylamide 及分离胶配方表 灌制分离胶隔绝空气 灌制积层胶插入梳子 蛋白样品的变性 2 SDS PAGE上样缓冲液 DTT可临用前以1 4比例混合加入 亦可全部配好分装 20 冻存 按1 1比例与蛋白质样品混合 95 100 加热5 15min 冰上冷却后再上样 上样量一般为20 25 l 总蛋白量20 50 g 不连续电泳 电泳缓冲液 pH8 3Tris 甘氨酸系统 转膜 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体 例如NC膜 上 通常有两种方法 毛细管印迹法和电泳印迹法 常用的电泳转移方法有湿转和半干转 两者的原理完全相同 只是用于固定胶 膜叠层和施加电场的机械装置不同 转移膜的选择 最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素 Nitrocellulose NC 膜和聚偏二氟乙烯 PolyvinylideneFluoride PVDF 膜 此外也有用尼龙膜 DEAE纤维素膜做蛋白印迹 尼龙膜和NC膜的特点相似 主要用于核酸杂交 各种膜的详细特点介绍 湿转系统 半干转移系统 丽春红染色蛋白带出现后 于室温用去离子水漂洗PVDF膜 换水2次 考马斯亮蓝染色 染胶 转膜后检测 此步可以省略 封闭 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合 使非特异性背景提高 需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理 5 脱脂奶粉或BSA 室温孵育1h WesternBlot膜封闭液 生物试剂公司 Tween 20的作用 减少非特异性吸附 不影响抗体与抗原的结合 WesternBlotting方法一 直接法 优点 1 快速 一种抗体 2 没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点 1 免疫反应性降低2 无信号二级放大3 抗体标记费时昂贵 使用不方便 WesternBlotting方法二 间接法 优点 1 免疫特异性不受标记影响2 信号放大灵敏度高 多个二抗结合位点 3 多种标记的二抗可供选择4 可选择不同的Marker缺点 1 交叉反应引起的非特异性条带2 额外的二抗孵育以及条件优化 间接WesternBlotting操作流程 一抗 二抗孵育 把PVDF膜放在密闭塑料袋或者培养皿中 根据膜面积以0 1mL cm2的量加入一抗溶液 摇床上平缓摇动 于室温孵育1 2小时或4 过夜 回收一抗溶液 用TBST漂洗膜3次 每次10min 加入用封闭液配制的二抗 摇床上缓慢摇动 于室温孵育1 2小时或4 过夜 回收一抗溶液 用TBST漂洗膜3次 每次10min 最后用TBS漂洗膜2次 每次10min 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法 HRP 碱性磷酸酶法 AP 不可不加 内参的选择 原因 校正蛋白质定量 上样过程中存在的实验误差种类 GAPDH beta actin beta tubulin用法 二抗孵育时加入HRP标记内参抗体分子量相差不大分子量大小相差比较明显 WesternBlot注意事项及常见问题 SDS PAGE 1 分离胶不要倒的太满 需要有一定的浓缩胶空间 否则起不到浓缩效果 2 上样蛋白量不应超过30ug mm2 载荷面即 如果你的胶槽是5mm 1mm 则载荷面为 1mm 5mm 5mm2 3 gel通常在0 5 1h内凝集最好 过快表示TEMED APS用量过多 此时胶太硬易龟裂 而且电泳时容易烧胶 太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效 4 混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合 导致电泳带畸形 太慢不均匀 特别是甘油 SDS PAGE 5 电泳中常出现的一些现象 条带呈笑脸状 原因 凝胶不均匀冷却 中间冷却不好 条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适 特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡 或者两边聚合不完全 拖尾 样品溶解不好 纹理 纵向条纹 样品中含有不溶性颗粒 条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜 条带两边扩散 加样量过多 TRANSFER 1 滤纸 胶 膜之间的大小 一般是滤纸 膜 胶 2 滤纸 胶 膜之间千万不能有气泡 气泡会造成短路 3 因为膜的疏水性 膜必须首先在甲醇中完全浸湿 而且在以后的操作中 膜也必须随时保持湿润 干膜法除外 TRANSFER 4 滤纸可以重复利用 上层滤纸 靠膜 内吸附有很多转移透过的蛋白质 所以上下滤纸一定不能弄混 在不能分辨的情况下 可以将靠胶滤纸换新的 5 转移时间一般为1 5小时 1mA 2mA cm2 10 g