微生物育种学课程论文.doc

微生物诱变技术研究进展戴泽翰 08植物保护微生物1班 200830200508摘要：人工诱变微生物育种具有速度快、收效大的优点，在生产和科研中被广泛应用。常规的微生物育种技术主要分为物理诱变、化学诱变、生物诱变三种。今年来三种诱变育种技术得到了长足的发展。本文就三者今年来的研究进展，尤其是新技术的发展进行综述。关键词：微生物；诱变育种；进展人工诱变手段诱发微生物基因突变,改变遗传结构和功能,通过筛选,从多种多样的变异菌体中筛选出产量高、性状优良的突变株，是生产和科研中微生物研究中常用的育种方法。使用诱变育种，可以使菌株研发周期大大缩短，特别是在发酵工程育种上得到广泛的应用。近年来,随着新诱变因子的不断发现和筛选技术的发展,微生物诱变育种技术有了长足进步。1物理诱变技术物理诱变通常使用物理辐射中的各种射线,包括紫外线、X射线、射线、射线、射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙射线等。近年来，离子辐照、微波、超高压诱变育种也成为诱变育种的新方法。1.1离子辐照诱变离子束具有高传能线性密度(Let),且在射程的末端还有尖锐的电离峰(Bragg峰)。这使重离子能在生物介质中产生高密度的电离和激发事件,同时产生的高活度自由基造成间接损伤,从而引起较强的生理生化作用,可引起染色体的重复、易位、倒位、缺失或使DNA分子取代、补充、断裂等。有学者（张宁等，2008）通过10k eV氮离子(N+)注入-胡萝卜素生产菌三孢布拉霉(Blakeslea trispora)筛选得到2株产量比出发菌株提高20%的高产菌株,经过多次传代试验表明该菌遗传稳定性较好,并对pH值、温度、转速等发酵条件进行初步优化,使-胡萝卜素的产量达到2.2 g/L。另有学者(赵南等，2010)向井冈霉素产生菌注入能量10k eV、剂量15下1013 个/cm2氮离子实施诱变,再生培养后单菌落接斜面上摇床进行效价测定,筛选高产菌株。结果获得诱变菌株9275#,其有效A组分含量较出发菌株提高33.52%,且具有高的遗传稳定性。1.2微波 微波作为1种高频电磁波,它与生物组织的相互作用主要表现为热效应和非热效应。能刺激水、蛋白质、核酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动,这种震动能引起摩擦,能够对氢键、疏水键和范德华力产生作用,因此可以使得单孢子悬液内DNA分子间强烈摩擦,孢内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损,使得DNA结构发生变化,从而发生遗传变异。有学者(徐伟等,2010)采用带水循环冷却装置的微波设备,对紫红曲(Monascus purpureus)进行诱变处理,研究微波辐照功率和辐照时间对红曲霉菌的致死规律和突变规律,获得微波功率和时间的最佳辐照剂量,结果表明:在微波功率500W、辐照时间80s时,得到突变株W5S8,液态发酵产橙色素色价为16.38U/mL,较原始菌株橙色素色价10.26U/mL提高了59.62%,连续遗传5代,产色素性状稳定。在低产双乙酰值酵母的筛选研究中（申文波等，2010），采用微波诱变与甲基磺酸乙酯(EMS)诱变相结合的方法对出发菌株2.003进行诱变,以筛选出产双乙酰值低的酵母菌株。小试实验表明:与出发菌株相比,突变株B82的双乙酰生成量下降了40%;经大生产试验,突变株B82双乙酰峰值低、还原快,有一定的应用价值。1.3超高压高压导致细胞体积减小,胞内物质浓缩,使得先前互不接触的各种酶、蛋白质及核酸类物质接触,这种接触必然会导致一些不可预测的反应发生,如DNA在高压下会与切割DNA的核酸内切酶接触而使得DNA发生变化。研究发现, DNA在高压长时间处理下, DNA合成对压力敏感。高压可以影响到DNA的超螺旋结构,甚至影响DNA母链的解旋,还使得DNA失去紧急修复的应急反应(SOS)机制。有研究人员（王岁楼等，2007）利用超高压技术对红酵母Rhodotorula glutinis NR06进行诱变处理,在300 MPa处理10min时获得一突变株NR06-H39,其-胡萝卜素产量达到9.64 mg/L,比出发菌株NR06的6.30 mg/L提高了53.02%,且遗传稳定性良好。另有研究 (杜双奎等,2011) 报道，在对初选的细菌纤维素菌株J2进行超高压诱变,试验结果表明,超高压诱变压力、时间对细菌纤维素菌株有显著或极显著影响。细菌纤维素菌株高压诱变条件为压力250 MPa、时间15 min、温度25。经超高压诱变,获得产纤维素能力高、遗传稳定性好的诱变菌株M438。2化学诱变育种技术化学诱变的作用机制与物理诱变剂有很大区别,化学诱变剂都是与DNA起化学作用。化学诱变剂往往具有专一性,它们对基因的某部位发生作用,对其余部位则无影响。在一定程度上，诱变剂具有定向突变的应用意义。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、移码突变剂。2.1碱基类似物这类物质与碱基有着相似的结构，通过取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变。由于作用位点单一，专一性强，碱基类似物常与其他诱变剂组合使用。但今年来出现了利用碱基类似物的单一诱变报道。在对产色素菌T_(17-2-39)的诱变育种试验中(程世清,2000)采用5-溴尿嘧啶（5BU）作为诱变刘，对产色素菌（分枝杆菌T_17-2-39）细胞和原生质体进行诱变，分别获得比原菌株生物量和产色素量提高的新菌株，其中生物量分别平均提高225和164。在对野油菜黄单胞菌的-淀粉酶基因进行的体外诱变中（张建云等，2010）采用基因体外定向进化策略中易错PCR技术,用碱基类似物5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP),对野油菜黄单胞菌的-淀粉酶基因进行了体外诱变。通过鉴别培养基进行筛选,得到5个具有高酶活的诱变基因,通过出发基因序列进行比较,分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果显示基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变而引起的,而不是由启动子的变化引起的。2.2 烷化剂烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。在以林肯链霉菌9502(Streptomyces lincolnensis9502)为出发菌株,进行NTG诱变处理,并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选的研究里,得到产林肯霉素相对效价提高35.4%的变异株9502-7。对9502-7菌株孢子采用紫外线处理,得到变异高产菌株9502-7-12,其相对效价较出发菌株提高50%以上（丁琳，2010）。在诱变选育丁二酮高产菌株的研究中，以乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种为出发菌株,采用亚硝基胍进行诱变选育,得到高产丁二酮菌株,用邻苯二胺比色法检测突变株丁二酮,其产量达到0.72 mg/L,比出发菌株产量0.056 mg/L提高12.9倍,且遗传性质稳定（于鹏等，2006）。2.3 移码突变剂吖啶及其衍生物类可插入到DNA分子中，通过复制过程导致遗传密码中碱基移位重组，最终改变突变株的遗传特性. 在对枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性改良的研究中（顾真荣，2008），用诱变剂吖啶橙诱变得到20个突变株,其中5个突变株Ga1、Ga8、Ga12、Ga1和Ga19在肉汤和PDA平板上形成粘液状菌落,完全不同于出发菌株。PDA平板抑菌圈试验,突变株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌产生比野生株G3更大的透明抑菌圈。其中Ga1菌株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌的抑菌带宽分别是G3的1.71和1.69倍。用番茄叶霉菌为指示菌的生物测定结果表明,突变株固体培养物或摇瓶培养物以最小抑菌浓度(MIC)和有效抑菌中浓度(EC50)表示的抗真菌活性皆高于G3菌株。突变株Ga1抗真菌活性最强。摇瓶培养时, Ga1菌株产生比G3更多的伊枯草菌素A。Ga1菌株增强了合成伊枯草菌素A的能力。3其他类诱变技术氯化锂属于协同诱变剂，与其他诱变剂联用时，往往会产生很好的协同诱导突变作用，尤其与紫外线诱变组合。对核糖苷链霉菌原生质体诱变核糖霉素产生菌核糖苷链霉菌 (Streptomyces ribosidificus)原生质体经紫外线和氯化锂复合处理得到2株新的菌株RF2-25和RF3-173,产生抗生素核糖霉素的能力分别比出发株RF-5提高了17%和15.3%。原生质体诱变是以原生质体为材料,采用物理或化学诱变剂处理,经过再生培养,从而选育获得突变株的一门技术。在原生质体诱变筛选香菇多糖高产菌株的研究中，选择剂量为600Gy的60Co射线对香菇原生质体进行诱变,得到多糖遗传稳定性保持良好，多糖产量比出发菌株提高了20.6%的突变菌株。在选育重金属去除菌的研究中（尹华等，2005），选用紫外线和亚硝酸对产朊假丝酵母CR-001进行单因子和多因子诱变处理,通过复合诱变得到了6株具有高重金属抗性的高效重金属去除菌.经过传代后CRC2811-1和CRC7-2的抑菌圈直径减至1.7 mm和1.2 mm；对Cr6+的去除率分别从80.2%和81.2%提高到了95.2%和94.7%其余4株突变株的抗性和除铬性能均可保持稳定。诱变抗生素抗性菌株是选育产抗生素的前提。在对抗真菌抗生素Terreic acid- 179M(简称179M)产生菌黄柄曲霉 ( Aspergillusf lavipes)抗性的研究中(李淑彬等，2003)，通过多轮复合诱变 ,以对自身次生代谢产物抗性作为筛选策略 ,选育到对自身抗生素抗性提高且发酵相对效价提高到383%的高产菌株。近来还有研究表明，微生物对作用于核糖体的抗生素所产生的某些抗性突变会直接影响其次级代谢功能，从而改变产物水平和代谢能力，使突变株的产能获得大幅提高（孙玉雯等，2008）4结语在微生物育种研究领域，随着相关基础学科的研究发展，利用基因工程、代谢工程等现代生物技术，合理改造代谢途径，构建优良菌株的研究受到关注，成为育种领域一个研究热点和微生物药物工业育种发展的一个重要方向。化学诱变与其他传统诱变育种方法一样，具有盲目性和随机性等不足，但也有无需知晓遗传背景和代谢途径、操作简便、不需要价格昂贵的现代高档仪器设备等显著优势。同样因随着技术发展和仪器开发而异军突起的物理诱变技术也存在着无法控制诱变方向、工作量大、诱变产物安全性不确定等问题。但随着研究的深入，广大微生物学工作者的不懈努力，相信这些困难定会被克服。参考文献1 张宁，虞龙. 低能离子注入-胡萝卜素生产菌株的选育与发酵条件初步优化J. 食品科技. 2008(3): 7-11.2 赵南，吴冬兰，唐洪啟等. 氮离子注入井冈霉素产生菌诱变高产菌株的研究J. 江西农业学报. 2010(4): 122-123.3 徐伟，范志诚，刘艳华. 微波辐照诱变选育高产橙色素红曲霉菌J. 食品科学. 2010(23): 224-227.4 申文波，朱庆计，吴树田等. 低产双乙酰酵母菌株的选育及大生产应用的初步研究J. 啤酒科技. 2010(2): 24-26.5 王岁楼，陈德经，邓百万. 红酵母超高压诱变及其-胡萝卜素发酵条件的初步研究J. 食品科学. 2007(9): 409-414.6 杜双奎，李志西，毋锐琴等. 细菌纤维素菌株超高压诱变选育及其发酵培养基的优化J. 高压物理学报. 2011(1): 79-88.7 程世清. 产色素菌T_(17-2-39)的诱变育种试验J. 江苏食品与发酵. 2000(2): 9-12.8 张建云，谷立坤，陈红歌. 基于易错PCR技术的-淀粉酶基因的定向进化研究J. 中国酿造. 2010(2).9 丁琳. 复合诱变选育林肯霉素高产菌株J. 氨基酸和生物资源. 2006(4): 68-70.10 于鹏，张兰威，许倩等. 亚硝基胍诱变选育丁二酮高产菌株J. 乳业科学与技术. 2006(5): 218-220.11 顾真荣，陈伟，程洪斌等. 吖啶橙诱变提高枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性J. 植物病理学报. 2008(2): 185-191.12 陈志高，沈建新，胡叶碧. 紫外线和氯化锂对核糖苷链霉菌原生质体诱变作用的探讨J. 中国医药工业杂志. 2001(4):