DNA重组PPT课件

1 DNA重组对生物进化起着关键的作用 生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程 生物进化以不断产生可遗传的变异为基础 首先有突变和重组 由此产生遗传的变异 然后才有遗传漂变 geneticdrift 和自然选择 naturalselection 才有进化 可遗传变异的根本原因是突变 然而 突变的机率很低 而且多数突变是有害的 2 此外 DNA重组还参与许多重要的生物学过程 它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制 某些病毒利用重组将自身的DNA整合到宿主细胞的DNA中 在基因工程的实验技术中 同源重组可用来进行遗传作图 geneticmapping 基因敲除 geneknockout DNA重组包括同源重组 homologousrecombination 位点专一性重组 site specificrecombination 和转座重组 transpositionrecombination 等类型 以下分别介绍 3 6 1同源重组 同源重组又称一般性重组 同源重组发生在DNA的同源序列之间 真核生物非姊妹染色单体的交换 姊妹染色单体的交换 细菌及某些低等真核生物的转化 细菌的转导 接合等都属于这 类型 Holliday对遗传重组的可能机制成功提出了一个模型予以说明 在分子水平上了解重组过程是在细菌的研究中加以解决的 4 同源重组的条件 1 在进行重组的交换区域含有完全相同或几乎完全相同的核苷酸序列 2 两个双链DNA分子之间需要相互靠近 并发生互补配对 3 需要特定的重组酶 recombinase 催化 但重组酶对碱基序列无特异性 4 形成异源双链 heteroduplex 5 发生联会 synapsis 5 联会 synapsis 亦称配对 指同源染色体两两配对 在细胞减数分裂前期的偶线期 来自父本和母本的同源染色体 两两靠拢进行准确的配对 形成四分体 即一对染色体含有四条染色单体 但仅有两个着丝点 是减数分裂的重要特征 联会是在减数分裂的偶线期两条同源染色体侧面紧密相贴并进行配对的现象 联会染色体间的配对是专一性的 可以同时发生在分散的几个点上 6 6 1 1同源重组的分子机制6 1 1 1Holliday模型两条同源DNA分子彼此并排对齐 相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下 在相同位置上同时切开 在切口处发生链的交换 形成所谓的Holliday结构 Hollidaystructure 分支点可以发生移动 称为分支迁移 branchmigration 分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区 heteroduplex 一个DNA分子的一条链上的一部分序列转移到另一个DNA分子中 7 Synapsedchromatids 8 Recombinationjoint HeteroduplexDNA 9 10 11 AB A B AB A B Holliday连接的分离有两种方式 12 重组产物如果切开的链与原来断裂的是同一条链 见Holliday模型左边的产物 重组体含有一段异源双链区 其两侧来自同一亲本DNA 称为片段重组体 patchrecombinant 但如切开的链并非原来断裂的链 模型右边产物 重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA 称为拼接重组体 splicerecombinant 13 14 patchrecombinants 15 图6 1同源重组的Holliday模型 16 图6 2电镜下的Holliday连接 17 6 1 1 3双链断裂模型一个DNA分子上两条链的断裂才启动了链的交换 产生断裂的双链称为受体双链 recipientduplex 不产生断裂的称为供体双链 donorduplex 18 双链断裂模型 19 图6 3同源重组的双链断裂模型 受体双链发生断裂 产生切口 外切酶作用导致产生具有3 单链末端的空隙 一个自由的3 端入侵供体双链同源区 形成异源双链 供体的一条链被取代 产生D环 由入侵的3 端引发的DNA修复合成导致D环延伸 D环最终扩大到覆盖受体双链的整个空隙 新合成的DNA由被入侵的DNA双链作为模板 当供体双链被取代的链到达受体双链空隙的另一侧 它将和空隙末端的另一个3 单链末端退火 于是被取代的单链提供了序列 填补了受体双链一开始被切除的序列 20 6 2位点特异性重组位点特异性重组是指发生在DNA特异性位点上的重组 参与重组的特异性位点需要专门的蛋白质识别和结合 尽管在许多情况下 它也需要在重组位点具有同源的碱基序列 但同源的碱基序列较短 位点特异性重组既可发生在2个DNA分子间 也可以发生在1个DNA分子内部 前一种情况通常会导致2个DNA分子间发生整合或基因发生重复 而后一种情况则可能导致缺失或倒位 21 图6 10缺失性位点特异性重组和倒位式位点特异性重组图解 22 位点特异性重组的功能包括 1 调节噬菌体DNA与宿主染色体DNA的整合 2 调节特定基因的表达 3 调节胚胎发育期间程序性的DNA重排 噬菌体感染大肠杆菌后 其DNA通过两端的cos位点自我环化 噬菌体必须在裂解途径和溶原途径之间做出选择 如果是裂解途径 噬菌体会在较短的时间内通过滚环复制大量增殖 并导致宿主裂解 如果是溶原途径 噬菌体DNA就通过位点特异性重组整合到宿主染色体中 进入到原噬菌体状态 噬菌体的位点特异性重组 是指 噬菌体基因组整合到宿主菌基因组上成为原噬菌体的过程 也包括原噬菌体从宿主菌基因组上独立出来的过程 23 l噬菌体的基因组通过att位点整合到细菌染色体 这是一种典型的位点特异性重组过程 大肠杆菌有高度特异性的位点attB供 噬菌体整合 位于gal和bio操纵子之间 长度为30bp 其中含有15bp保守区O GCTTTTTTATACTAA attB可记为BOB 噬菌体的重组位点为attP POP 其中也有与大肠杆菌相同的保守区O 24 图6 11 噬菌体的位点特异性整合 参与 噬菌体整合的重组蛋白包括1种由噬菌体编码的整合酶Int和1种宿主蛋白IHF 两种蛋白质结合在P臂和P 臂上 促使attP和attB的15bp保守序列能正确地排列 Int催化了重组过程的所有反应 包括一段7bp的分支迁移 重组导致了整合的原噬菌体两侧各成为1个附着点 左边的attL为BOP 右边的attR为POB 25 图6 12 噬菌体重组整合或切除时切点的序列 26 溶源性细菌 lysogen 溶菌周期 lysis 原噬菌体 27 6 3转座重组转座重组指DNA上的核苷酸序列从一个位置转移到另一个位置的现象 发生转位的DNA片段称为转座子 transposons 或可移位的遗传元件 mobilegeneticelements MGE 跳跃基因 jumpgene 转座重组的靶序列与转座子序列之间不需要有同源性 接受转座子的靶位点绝大多数是随机的 但也可能具有一定的倾向性 如存在一致序列或热点 28 转座重组可导致突变 也可能改变基因组DNA的量 转座子的插入可改变附近基因的活性 如果插入到一个基因的内部 很可能导致基因的失活 如果插入到基因的上游 又可能导致基因的激活 人 小鼠和水稻的基因组大概有40 的序列由转座子衍生而来 但在低等的真核生物和细菌内的比例较小 约占1 5 这说明转座子在从低等生物到高等生物的基因和基因组进化过程中曾发挥过十分重要的作用 29 图6 14转座子对基因X的可能影响 30 6 3 1原核生物的转座子首先发现的转座子是插入序列 IS 因其插入使靶点处基因失活而被发现 IS能从DNA的一个位点插入到另一个位点 导致靶位点基因以及和靶位点基因在同一个操纵子内 但位于靶位点基因下游的基因表达受阻 此现象称为极性效应 31 6 3 1 1第一类转座子IS IS是最简单的转座因子 IS元件是细菌染色体和质粒的正常组成部分 最早被鉴定的转座元件是细菌操纵子中的自主插入序列 插入序列是最小的转座因子 IS的大小范围是768bp 7 5Kb 但大部分小于2 5Kb IS元件是独立的结构单位 每个元件只编码为自身转座所需要的蛋白质 转座酶 IS元件的末端为短的反向末端重复序列 invertedterminalrepeats 通常这两个拷贝密切相关 但并不完全一样 反向重复为转座酶识别所需 通常重复序列长度为15 25bp 转座后靶部位变成两个正向重复序列 32 图6 15第一类转座子的结构 33 图6 16第一类转座子的转座机制 34 6 3 1 2第二类转座子称为复杂转座子 complextransposon 含有转座酶基因 解离酶 resolvase 基因以及抗生素抗性基因 两端为反向重复 无插入序列 转座后导致约5bp长的靶位点序列重复 导致转座子两侧产生直接重复序列 35 6 3 1 3第三类转座子称为复合型转座子 compositetransposon 由2个IS和一段带有抗生素抗性或其他毒性抗性的间插序列组合而成 其中的2个IS位于转座子的两侧 具有相同或相反的方向 36 复合型转座子很可能是通过一个插入序列的拷贝插在附近区域而形成的 两个插入序列中间夹着一段序列即可构成一个转座单位 每个插入序列两端为反向重复 因此 无论两插入序列处于正向还是反向位置 作为转座单位其两端均有可被转座酶识别的反向重复序列 37 如果两个插入序列正好位于抗性基因两侧 该转座单位携带的性状对宿主细胞是有利的 因而具有选择优势 复合型转座子的两个插入序列以正向或反向 更常见 位于两端 它们的序列可以不完全相同 有时只有一个插入序列具有转座活性 另一个已在多次传代中失去活性 38 6 3 1 4第四类转座子最典型的为Mu噬菌体 它是大肠杆菌的一种温和噬菌体 具有裂解和溶原特征生长周期 在溶原期 其DNA通过转座方式整合到宿主DNA中 在其复制时 通过复制型转座随机插入到宿主DNA的其他区域 很容易诱发宿主细胞的各种突变 因此被称为mutator Mu噬菌体DNA为38kb的线性双链 两侧缺乏IR序列 其基因组的20多个基因只有A和B基因与转座有关 Mu噬菌体的转座可引起靶位点序列产生重复 39 与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同 Mu噬菌体并没有一定的整合位置 与其他温和性噬菌体的差别 其基因组不论在进入裂解周期或处于溶源状态都可随机整合到宿主染色体的任何位置 且游离的和已整合的基因次序是相同的 与IS和Tn两种转座因子相比 Mu噬菌体的分子量最大 38kb 它含有20多个基因 Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变 其中约有2 是营养缺陷型突变 40 图6 19Mu噬菌体DNA的结构 41 6 3 2真核生物的转座子早在20世纪40年代 美国遗传学家McClintockB在研究玉米的遗传因子时发现 某些基因活性受到一些能在不同染色体间转移的控制因子 controllingelement 所决定 这一发现与当时传统的遗传学观点相抵触 因而不被学术界所普遍接受 直到60年代后期 美国青年细菌学家ShapiroJ在大肠杆菌中发现一种由插入序列 insertionsequence IS 所引起的多效突变 之后又在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子 才重新引起人们重视 1983年McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖 距离她公布玉米控制因子的时间已有32年之久 42 C基因 Ds基因 Ac基因 Ac Ds控制系统 BarbaraMcClintock 芭芭拉 麦克林托克 1902 1992 NobelPrizeforPhysiologyorMedicine1983 43 现已证明转座事件是真核生物极为普遍的现象 真核转座子与原核转座子的差别主要反映在转座的机制上 集中在两个方面 1 真核转座子在转座过程中的剪切和插入是分开进行的 2 真核转座子的复制很多需要经过逆转录即RNA中间物来进行 真核转座子 逆转座子 DNA RNA DNA DNA转座子 DNA DNA 复制型转座子 保留型转座子 44 真核生物的转座因子与原核生物转座因子十分相似 转座依赖于转座酶 转座因子的两端有被转座酶识别的反向重复序列 转座的靶位点是随机的 靶位点交错切开 插入转座因子后经修复形成两侧正向重复序列 但是二者在结构和性质上也有一些差别 原核生物的转录和翻译几乎是同时进行的 真核生物由于核结构的存在而使此两过程在空间上和时间都被分隔开了 45 因此 真核生物细胞内只要存在转座酶 任何序列片段具有该酶识别的反向重复末端均可发生转移 而无需由被转移序列自身编码这些酶 这就可以说明 为什么真核生物的转座因子家族中只保留少数拷贝具有编码转座酶基因的活性 而多数拷贝中发生程度不同的删除 失去转座酶基因活性 但保留了两端的反向重复序列 原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子 表现出顺式显性 cisdominance 真核生物则无此特性 这也是二者最明显的差别 46 6 3 2 1复制型转座子这一类转座子称为Helitron 以滚环复制的方式进行复制 然后再插入到新的位点 两端无IR序列 在转座后 不会使靶位点序列发生重复 Helitron总是以5 TC开始 以CTRR结束 图6 20Helitron的结构 47 6 3 2 2保留型转座子真核生物绝大多数转座子属于此类 6 3 2 2 1玉米的Ac Ds系统最先由McClintock发现 Ac和Ds分别属于自主型和非自主型DNA转座子 Ac表示激活子元件 4563bp 两端是11bp的IR序列 带有全功能的转座酶基因 Ds表示解离元件 两端也是11bp的IR序列 但中间只有缺失的 无功能的转座酶基因 实际上是Ac经由不同的缺失突变而来 Ds不能单独移位 只有Ac存在时 Ds才会移位 48 图6 21Ac和Ds的结构比较 49 50 产生转座酶 不能产生转座酶 AcDs 反式激活 51 图6 22玉米的Ac Ds系统 玉米种子颜色由紫色色素基因C决定 若Ac或Ds插入到C基因内部 玉米粒变为黄色 若Ds远离Ac 或Ac本身跳开 Ds则不再受Ac的控制 又可以发挥对结构基因的抑制作用 使玉米粒呈黄色 Ac和Ds在染色体上的跳动十分活跃 使得受它们控制的颜色基因时开时关 于是玉米粒便出现了斑点 52 6 3 2 2 2果蝇的P元件果蝇的P元件长2 9kb 两端含有31bp的IR序列 P元件的转座可引起染色体的断裂和基因突变 可导致细胞死亡 但P元件的转座只在生殖细胞内发生 因为只有在生殖细胞内转座酶的RNA才能正确拼接 翻译出具有活性的转座酶 而在体细胞内 不能正确拼接 由这种RNA翻译出来的产物是转座的阻遏物 阻遏物也存在于含有P元件的卵细胞的细胞质 53 果蝇的转座子 Why P品系雄果蝇与M品系雌果蝇杂交后代不育 M品系雄果蝇与P品系雌果蝇杂交后代可育 P元件存在于P品系黑腹果蝇中 而M品系中缺乏 54 P因子的结构与功能示意图 55 56 6 3 2 3逆转座子逆转座子 retroposons 指通过RNA为中介 反转录成DNA后进行转座的可移动元件 又称逆转录转座子 retrotransposon 根据两端的结构 可分为LTR逆转座子和非LTR逆转座子 逆转座子广泛存在于真核生物中 其序列结构与反转录病毒的原病毒具有非常相似的一般结构特征 在高等生物的基因组DNA中有很多不活跃的逆转座子序列 有些具有大量拷贝 很可能是曾经发生RNA介导的转座事件或原病毒留下来的 57 LTR逆转座子两端含有与逆转录病毒基因组mRNA逆转录产生的类似的LTR序列 非LTR逆转座子没有LTR序列 58 图6 23逆转座子的转座机制 59 LTR 反转座子的结构类似于反转录病毒 与反转录病毒的主要区别是反转座子不具有侵染性和不带有病毒外膜基因 env 反转座子的特征是具有长的末端正向重复序列 LTR 中央含有1 3个大的阅读框架 反转座子结构中的gag编码核酸结合蛋白 pol编码蛋白酶 PR 整合酶 IN 反转录酶 RT 及RNaseH RH 根据pol中的基因产物顺序 又可将LTR 反转座子分为两个组 Copia组和Gypsy组 Gypsy组 其编码区的结构类似于反转录病毒 其 env 区的位置与反转录病毒的相同 但其核酸序列却与反转录病毒的env序列不同 60 6 3 2 3 1酵母的Ty元件Ty元件在单倍体酵母细胞中约有35个拷贝 散布在各染色体DNA上 其LTR称为序列 酵母中Ty元件的结构基本相同 每一结构单位约6 3kb 两端是约330bp的长末端正向重复序列LTR 中间是2个ORF TyA和TyB TyA类似于反转录病毒的gag 编码结构蛋白 如核酸结合蛋白 NA TyB类似于pol 编码参与反转录的酶蛋白 如蛋白酶 整合酶 反转录酶 RNase等 Ty因子从左侧LTR结构的启动子内开始转录 转录出两种mRNA 5kb 5 7kb 终止于右侧的LTR内 TyA和TyB以两种方式表达 TyA蛋白代表TyA可读框 TyB只有连接蛋白 TyA Ty 的一部分被表达 61 62 Ty因子与反转录病毒非常相似 1 二者之间的分子结构非常相似 如均有长末端重复序列LTR 它们转录和翻译的方式也很类似 2 转座是由Ty因子内的基因控制的 且要经过一个RNA阶段 3 虽然Ty因子不产生感染颗粒 但在经诱导发生转座的细胞中存在着Ty病毒样颗粒 VLPs Virus likeparticles 4 仅有某些Ty因子在任何酵母基因组中都有活性 大部分没有转座能力 此和惰性的内源性前病毒相似 5 反转录病毒首先被观察到的是以传染性病毒颗粒的形式存在 并能在细胞间传播 而反转座子是被当作基因组中的一部分而被发现的 它们可以在基因组内进行转座 但不能在细胞间迁移 63 图6 25类