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紫外分光光度计的使用原理和方法 讲解人 李梓番 2015 6 目录 紫外 可见吸收光谱 朗伯 比耳定律 紫外 可见分光光度计 分析条件的选择 2 3 4 5 紫外 可见分光光度法 1 紫外 可见吸收光谱法的应用 6 1 紫外 可见分光光度法 它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用 对物质进行定性分析 定量分析及结构分析 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱按所吸收光的波长区域不同 分为紫外分光光度法和可见分光光度法 合称为紫外 可见分光光度法 1 紫外 可见分光光度法 2 紫外 可见吸收光谱 物质对光的吸收是选择性的 利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性 这就是光谱法的基础 通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度 吸光度 以波长为横坐标 吸光度为纵坐标作图 得出该物质在测定波长范围的吸收曲线 在吸收曲线中 通常选用最大吸收波长 max进行物质含量的测定 物质对光的选择性吸收 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系 测定条件 温度 溶剂极性 pH等 不同 吸收光谱的形状 吸收峰的位置 吸收强度等都可能发生变化 pH值 溶剂 尽量选用低极性溶剂 能很好地溶解被测物 并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性 溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收 温度在室温范围内 温度对吸收光谱的影响不大 影响因素 2 紫外 可见吸收光谱 3 朗伯 比尔定律 一吸光度和透光度 设入射光强度为I0 吸收光强度为Ia 透射光强度为It 反射光强度为Ir 则I0 Ia It Ir由于反射光强度很弱 其影响很小 上式可简化为 I0 Ia It 3 朗伯 比尔定律 吸光度 为透光度倒数的对数 用A表示 即A lg1 T lgI0 It 透光度 透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比 用T表示 即T It I0 二朗伯 比尔定律朗伯 比尔定律 当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时 溶液的吸光度与吸光物质浓度 液层厚度乘积成正比 即A cl式中比例常数 与吸光物质的本性 入射光波长及温度等因素有关 c为吸光物质浓度 l为透光液层厚度 3 朗伯 比尔定律 三吸光系数 当l以cm c以g L为单位 称为吸光系数 用a表示 A acl a的单位为L g cm 3 朗伯 比尔定律 摩尔吸光系数 当l以cm c以mol L为单位 称为摩尔吸光系数 用 表示 示 的单位为L mol cm 它表示物质的浓度为1mol L 液层厚度为1cm时 溶液的吸光度 3 朗伯 比尔定律 比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1 l为1cm时的吸光度值 用表示 3 朗伯 比尔定律 四偏离朗伯 比耳定律的因素 1 入射光为非单色光 2 溶液的不均性 实际样品的混浊 加入的保护胶体 蒸馏水中的微生物 存在散射以及共振发射等 均可吸光质点的吸光特性变化大 3 光程的不一致性 光源不是点光源 比色皿光径长度不一致 光学元件的缺陷引起的多次反射等 均造成光径不一致 从而与定律偏离 3 朗伯 比尔定律 4 紫外 可见分光光度计 一主要部件的性能与作用基本结构 光源 单色器 吸收池 检测器 信号显示系统 样品 1光源 在紫外可见分光光度计中 常用的光源有两类 热辐射光源和气体放电光源热辐射光源用于可见光区 如钨灯和卤钨灯 气体放电光源用于紫外光区 如氢灯和氘灯 4 紫外 可见分光光度计 2单色器 单色器的主要组成 入射狭缝 出射狭缝 色散元件和准直镜等部分 单色器质量的优劣 主要决定于色散元件的质量 色散元件常用棱镜和光栅 4 紫外 可见分光光度计 3吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯 按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池 前者不能用于紫外区 吸收池的种类很多 其光径可在0 1 10cm之间 其中以1cm光径吸收池最为常用 4 紫外 可见分光光度计 4检测器检测器的作用是检测光信号 并将光信号转变为电信号 现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器 5信号显示系统常用的信号显示装置有直读检流计 电位调节指零装置 以及自动记录和数字显示装置等 4 紫外 可见分光光度计 二紫外 可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计 4 紫外 可见分光光度计 1单波长单光束分光光度计 特点 使用时来回拉动吸收池 移动误差对光源要求高比色池配对 4 紫外 可见分光光度计 2单波长双光束分光光度计 特点 不用拉动吸收池 可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱 4 紫外 可见分光光度计 3双波长分光光度计 特点 利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差 4 紫外 可见分光光度计 5 分析条件的选择 1适宜的吸光度范围由朗伯 比尔定律可知 A lg1 T cl微分后得 dlgT 0 4343dT T ldc或0 4343 T T l c 一仪器测量条件的选择 代入朗伯 比尔定律有 c c 0 4343 T TlgT要使测定的相对误差 c c最小 求导取极小得出 lgT 0 4343 A即当A 0 4343时 吸光度测量误差最小 最适宜的测量范围为0 2 0 8之间 5 分析条件的选择 2入射光波长的选择通常是根据被测组分的吸收光谱 选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长 当最强吸收峰的峰形比较尖锐时 往往选用吸收稍低 峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定 5 分析条件的选择 3狭缝宽度的选择为了选择合适的狭缝宽度 应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准 一般来说 狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一 5 分析条件的选择 二显色反应条件的选择 对多种物质进行测定 常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质 常见的显色反应有配位反应 氧化还原反应等 5 分析条件的选择 这些显色反应 必须满足以下条件 1 反应的生成物必须在紫外 可见光区有较强的吸光能力 即摩尔吸光系数较大 2 反应有较高的选择性 即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别 3 反应生成的产物有足够的稳定性 以保证测量过程中溶液的吸光度不变 4 反应生成物的组成恒定 5 分析条件的选择 三参比溶液的选择 测定试样溶液的吸光度 需先用参比溶液调节透光度 吸光度为0 为100 以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差 5 分析条件的选择 参比溶液的选择视分析体系而定 具体有 1 溶剂参比试样简单 共存其它成分对测定波长吸收弱 只考虑消除溶剂与吸收池等因素 2 试样参比如果试样基体溶液在测定波长有吸收 而显色剂不与试样基体显色时 可按与显色反应相同的条件处理试样 只是不加入显色剂 5 分析条件的选择 3 试剂参比如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收 按显色反应相同的条件 不加入试样 同样加入试剂和溶剂作为参比溶液 4 平行操作参比用不含被测组分的试样 在相同的条件下与被测试样同时进行处理 由此得到平行操作参比溶液 5 分析条件的选择 一单组分定量方法单组分是指样品溶液中含有一种组分 或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠 其定量方法包括校准曲线法 标准对比法和吸收系数法 6 紫外 可见吸收光谱的应用 1校准曲线法方法 配制一系列不同含量的标准溶液 选用适宜的参比 在相同的条件下 测定系列标准溶液的吸光度 作A c曲线 即标准曲线 也可用最小二乘数处理 得线性回归方程 在相同条件下测定未知试样的吸光度 从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度 6 紫外 可见吸收光谱的应用 2标准对比法即将待测溶液与某一标样溶液 在相同的条件下 测定各自的吸光度 建立朗伯 比尔定律 解方程求出未知样浓度与含量 As KcsAx Kcx 6 紫外 可见吸收光谱的应用 紫外 可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外 还可以用于物质的定性分析 纯度鉴定 结构分析 6 紫外 可见吸收光谱的应用 二定性分析先用标准样品扫描谱图 在扫待测样品的谱图 拿两者进行比较 可进行定性 但此方法误差比较大 6 紫外 可见吸收光谱的应用 三纯度的鉴定用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的 如蛋白质与核酸的纯度分析中 可用A280 A260或A230 A260的比值 鉴定其纯度 蛋白质浓度 1552 A280 757 3 A260 ug ml DNA浓度 62 9 A260 36 0 A280 ug ml 蛋白质浓度 183 0 A230 75 8 A260 ug ml DNA浓度 49 1 A260 3 48 A230 ug ml 6 紫外 可见吸收光谱的应用 四结构分析紫外 可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析 但利用