微生物论文 自来水中细菌总数的测定.doc

自来水中细菌总数的测定摘 要：水是生命之源，人的生存离不开水环境，各种天然水中常含一定数量的微生物。水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。国家饮用水标准规定，每毫升水样细菌总数（37培养24h）不得大于100个1。本实验应用平板菌落技术测定水中细菌总数，计算出来的细菌总数仅是近似值。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板2。对自来水用平板菌落技术测定细菌总数，通过观测得到如下结果：菌数为44个/mL，符合国家饮用水标准。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。关键字：自来水 平板菌落计数技术 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 细菌0引言在饮用水处理中，出厂水加氯消毒后进人管网，部分存活的微生物和管网中生物膜中的微生物会利用管网水中的微量生物降解有机物进行再生长3。水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。我国应用水卫生标准（GB5749-85）规定每毫升水样细菌总数37培养24h不得大于100个。 长期以来，国内多采用异养菌平板计数法(Heterotrophic Plate Counts，HPC)和最大或然数法(Most Probable Number，MPN)来测定饮用水中的活菌数但由于饮用水中的贫营养环境有别于传统培养基提供的富营养环境，大多数在显微镜下观察到的细菌不能在传统培养基中生长(Nonculturable)，致使活菌计数结果偏低近些年来，国外先后应用吖啶橙染色直接计数(AcridineOrange Direct Counts，AODC)、活菌直接计数(Direct Viable Counts，DVC)等方法对饮用水中的细菌总数及活菌数进行快速、直接的镜检计数一些新的染色方法，如采用5一氰基一2，3一联甲苯四唑盐酸盐(5 Cyano一2，3一ditolyltetrazolium chloride，CTC)、核酸探针(BacLight)等对活细菌计数，都取得了很好地效果国内这方面的研究却未见报道4因平板计数法相对简单，本实验即采用本方法，用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板。对自来水用平板菌落技术测定细菌总数从而判断自来水是否符合国家标准，是否受到污染。1 材料与方法1.1 本实验于2010年10月26,27日在太原师范学院南区实验楼微生物实验室完成。1.2 材料1.2.1实验材料 自来水 1.2.2实验试剂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 1mol/LNaOH 1mol/LHCl 蒸馏水 1.2.3实验仪器 高压蒸气灭菌锅 培养皿 三角烧瓶 天平 量筒 玻璃棒 电炉 药匙 pH试纸（pH5.5-9.0） 温度计 1.3 实验方法 1.3.1 灭菌1.3.1.1 首先将内锅层取出,再向外锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。1.3.1.2 放回内锅层,并加入用报纸包好的培养皿、三角烧瓶、吸管。1.3.1.3 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使螺旋松紧一致，勿使漏气。1.3.1.4 用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa,121,20min灭菌。1.3.1.5 灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。1.3.2 水样的采取放开水龙头使水流5min后，用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以待分析。1.3.3 制备牛肉膏蛋白胨培养基1.3.3.1 称量 按培养基配方依次准确的称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在称量纸上，称量后直接放入水中，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。1.3.3.2 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。1.3.3.3 调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。1.3.4 细菌总数测定1.3.4.1 灭菌吸管吸取1mL水样，注入其中一套灭菌的培养皿中。共做两个平皿。1.3.4.2 分别倾注溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,并立即在桌上作平面旋摇，使自来水和培养基混匀。1.3.4.3 另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,作空白对照。1.3.4.4 待培养基凝固后，倒置于37温箱中，培养24h，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为1mL自来水的细菌总数。2 结果与分析2.1 结果 2.1.1 菌落照片 2.1.2 实验数据测得培养皿中细菌菌落数如下表：表 自来水中菌落数表实验数据平板序号12对照组菌落数目（个）837544自来水中细菌总为（83+75）/2-44=352.2分析实验中对照组的菌落数为44，可见培养基和培养过程中造成了杂菌污染。处理上表中数据知，该自来水中细菌平均数为35,在国家饮用水标准范围之内。3讨论在本实验中的空白对照培养基上长了细菌菌落，说明此培养基被污染了，杂菌来源可能是由于培养皿、三角烧瓶、吸管等仪器灭菌不充分；灭菌后在空气中放置又落入杂菌；无菌操作技术不当，培养基倾入培养皿后没有立即加盖；配置培养基时反复升降温，使一些杂菌产生抗性等。因此，在制作培养基及培养的过程中要严格杀菌，并严格按照实验步骤认真操作，从而使得结果更加精确5。本实验数据表明，结果虽在国家标准范围之内，但因对照受到污染，以至结果并不可信。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以某种培养基平板升生长出来的水中细菌总数仅是近似值6。本实验的成败在于灭菌、无菌操作技术、培养基的温度等方面是否操作正确，因此接种过程务必防止杂菌的侵入。实验过程中，倾注培养基后，培养皿在桌面上做匀速旋转，使培养基和自来水样充分摇匀，若没有摇匀，在培养基中可见一些菌苔。由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，所以观察到绝大多数的细菌着生在培养基表面7。所以在实验过程中应注意以下几点：（1）实验过程中要将所用仪器包括培养皿、三角烧瓶、吸管等充分灭菌，操作过程中把手用肥皂洗干净。（2）接水前若没有用火烧水龙头，就事先打开水龙头让水自由流5分钟以后再接。（3）为了避免杂菌污染，自来水与培养基溶解的过程一定要迅速，在空气中停留的时间越长，就越容易被污染。（4）倒置培养基时应降温至45 ，温度过高会烫死大肠杆菌，过低会使培养基凝固。（5）倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果8。（6）培养基不能反复升降温，倾入培养皿后应立即加盖，且灭菌后不应在空气中放置，以免杂菌混入。（7）应在高温时在对照组中倒入培养基，否则对照组中会出现大量的菌落9。（8）数菌落时，只计数较大的菌落，太小的可忽略不计。4 结论（1）为了测定自来水样是否符合饮用水的微生物方面的卫生标准，进行了细菌总数的测定，测得结果为35（CFU/mL），符合我国饮用水卫生标准（GB5749-85）规定。（2）测定水样是否符合饮用水的微生物方面的卫生标准，通常包括下列两项：细菌总数测定和总大肠菌群的测定。除采用平板菌落计数测定细菌总数外，现在已有许多快速、简便的微生物检测仪或试剂纸（盒或卡）等用来测定水中细菌总数10。（3）影响因素1）在数菌落时，菌落太小且又处于培养基内部这样就不能观察到菌落从而影响结果；2）在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使计数菌落减少。因此，只有在实验不需要精确的情况下才可使用此方法。虽然水中存在大量的细菌且种类繁多，但由于牛肉膏蛋白胨所提供的生长条件的限制，培养基中所得的细菌群落较单一为大肠杆菌，呈圆片状11。 参考文献1沈萍，范秀容等.微生物学实验（第四版）.北京：高等教育出版社，2007 2 陈声明 刘丽丽.微生物学实验研究方法北京：人民教育出版社，19823毛占生，等徽圬染 .源饮用水址理 M 北京：中国建筑工业出版牡19994 李根生.干燥培养基恩德制造及应用.上海：上海科学技术文献出版社，19945 郝士海.现代细菌学培养基和生化试验手册.北京：中国科学技术出版社，19926 罗雪云等.食品卫生微生物检验标准手册.北京：中国标准出版社，19957 王子石 秦钰惠 郑乃彤 潘长庆 张明 生活饮用水卫生标准2007.7.18徐飞，王开元，江迎春.水中细菌总数测定方法的优化研究J.今日科技.20079王少沛,曹煜成,李卓佳,杨莺莺,陈素文.水生环境中细菌与微藻的相互关系及其实际应用10白晓慧,戈志坚,邢一,范新元.两种培养基对饮水机出水中细菌总数的测定效果比较J11鲁巍,姜登岭,张晓健.配水管网中AOC与细菌再生长的关系J.中国给水排水.2004英文翻译Determination of the total number of bacteria intap waterAbstract: Water is the source of life, human existence is inseparable from the water environment, often with a variety of natural water a certain number of micro-organisms. The main source of microorganisms in water is: water nature water organisms (such as the photosynthetic algae), from soil runoff, rainfall, and external bacteria and pollutants from sewage and other human and animal excrement. National drinking water standards, the total number of bacteria per milliliter of water (37 culture 24h) shall not be greater than 100 1. Application of the experimental determination of flat-panel technology total number of bacteria colonies, calculated from the total number of bacteria is only approximate. It is generally the ordinary beef extract peptone agar in ensuring a sterile environment, to take water samples, making use of the medium plate 2. With a plate of water measured by total number of bacteria colonies, by observing the results are as follows: number of 44 bacteria / mL, consistent with national drinking water standards. Microbiologica