细胞生物学实验 PEG介导的动物细胞融合技术.doc

中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 一、【实验目的】 1、 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清楚的概念 2、并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术 3、通过实验操作，进行细胞融合，并测定融合率。二、【实验原理】 真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。人工的细胞融合开始于20世纪50年代, 60年代到70代作为一门新兴的技术, 发展非常快, 应用范围也极为广泛, 不仅同种类细胞间可以融合, 种间远缘细胞也能融合, 细胞与组织不同, 不排斥异类、异种细胞, 动物细胞如此，植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。 利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响。1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为10004000，浓度一般为4060%。2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.08.2之间融合效果最好。3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞, 一般采用的温度为3840。 三、【实验用品】 （一）材料：新鲜鸡血。（二）试剂： 1、Alsever液制备：葡萄糖(Glucose) 2.05g 枸椽酸钠 0.8g 氯化钠(NaCl) 0.42g 重蒸水 至100ml 2、0.85%生理盐水液。3、 GKN液：氯化钠 8g 氯化钾(KCl) 0.4g Na2HPO42H2O 1.77g NaH2PO4H2O 0.69g 葡萄糖 2g 酚红(phenolred) 0.01g 溶于1000ml重蒸水中。 4、50% PEG液 (现用现配)： 根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50，加入等体积的已预热至50的GKN液并充分混匀。 四、【实验器材】1、 主要设备: 普通离心机、普通光学显微镜、水浴锅、塑料滴管、离心管等。 2、 小型器材: 100ml 量筒2个, 滴管10支, 10ml 刻度离心管20支, 载、盖片各20片。五、【实验方法】1. 注射器内先吸入2ml Alsever液, 再从活鸡的翼下静脉抽取鸡血2ml，注入试管内, 再加入Alsever液6ml，使之成为1:4悬液，混匀后放在4冰箱中，可使用34天。 2. 取出上述悬液1ml加入 0.85%生理盐水4ml，混匀后，1200r/min离心5分钟，去上清液后，再以上述离心速率重复离心两次(5min, 10min)，以达到去除细胞表面粘附物质的目的。 3. 去除上清液后，将最后一次离心沉降的血球，加入适量GKN液，使之成10%的细胞悬液。 4. 取上述悬液，以血球计数法计数， 再用GKN液将红细胞的浓度稀释至34104个/m3。 5. 取上述调整后的血球悬液1ml, 加入0.5ml 50%的PEG液混匀，吸取12滴, 滴到一干净的载玻片上，在常温下23min后即可加上盖玻片进行镜检，并计算出融合率。 六、【实验结果】 经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。 细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示： 融合率=视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数100%在实验中统计融合率时, 要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。 本次实验共观察到两个视野有融合的细胞。如图所示：通过计数，三个视野中有2/83 , 2/70，计算得：该方法本实验中鸡红细胞融合率为：（2+2）/（70+83）100%=2.62%七、【思考与讨论】1、本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？ 答：本实验中所用的PEG融合方法不能用于植物细胞融合。 因为植物细胞有细胞壁，细胞膜在细胞壁的阻碍下不能相接触，也就不能融合。 应该先去除细胞壁，再融合。2、本实验的材料为什么不用兔子或小鼠的血细胞？如果因实验需要必须选用小鼠血细胞作为实验材料，应如何对融合细胞进行鉴别？请你根据目前所掌握的知识谈谈你所能设想到的鉴别方法。 答：哺乳动物的成熟血细胞无细胞核，不能依据核的数量作为细胞融合的判据。为什么选用鸡的血细胞作为材料鸡血细胞具有细胞核，便于