生物能源工作总结

生物能源工作总结生物能源工作总结生物能源工作总结 本文简介：生物能源工作总结本人于2009年1月初有幸担当生物能源项目主要研发人员，从参与生物能源专利的编写、修改、定稿和生物能源相关实验，在2010年4月末暂停此计划后，该项目共经过了16个月的时间，期间由于其他工作占据了一定的时间，致使该项目进行的时间较长。在此将此项目到目前为止所进行的阶段及工作做个总结。生物能源工作总结生物能源工作总结本人于2009年1月初有幸担当生物能源项目主要研发人员，从参与生物能源专利的编写、修改、定稿和生物能源相关实验，在2010年4月末暂停此计划后，该项目共经过了16个月的时间，期间由于其他工作占据了一定的时间，致使该项目进行的时间较长。在此将此项目到目前为止所进行的阶段及工作做个总结。实验一：藻种培养。目的：为基因提供宿体买回的小球藻藻种，以1/10的LB液体培养基，按1:10体积比扩种于100mL的三角烧瓶中，在恒温光照培养箱中培养，待藻体达到一定密度后待用。结果：小球藻扩增到近10L的量。实验二：ADH-PUC、PDC-PUC、FAEES-PUC质粒转化到大肠杆菌中扩增目的：所用质粒来源为黄教授提供，量较少，需大量扩增以备后续实验。1、制大肠杆菌感受态细胞：（一）、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37振荡培养2-3小时至OD600左右。（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)1）、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4下3000g离心10分钟。2）、弃去上清,用预冷的/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4下3000g离心10分钟。3）、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4）、感受态细胞分装成200l的小份,贮存于-70可保存半年。2、转化，筛选：1）、从-70冰箱中取200l感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2）、加入puc质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。3）、42水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4）、向管中加入1mlLB液体培养基,混匀后37振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态.5）、将上述菌液摇匀后取100l涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养16-24小时。同时做两个对照:对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5l菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。结果：通过筛选得到了三种基因转化后的大肠杆菌实施例三：提取大肠杆菌中扩增的质粒目的：质粒存在于大肠杆菌中，需提取纯化，以备后续实验。1、挑取单菌落过夜培养活化：在含有抗生素的LB液体培养基中接种一单菌落，37150rpm摇培过夜。2、碱法提质粒：所需溶液与仪器：1）溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-HCl()、10mmol/LEDTA()，高压灭菌15min，4oC储存；2）溶液II：用时现配,NaOH、2%SDS等体积混合；3）溶液III：5MKAc60ml、冰乙酸、ddH2O。4）恒温摇床，台式离心机，制冰机，电泳装置，紫外透射观测仪。步骤：1).取菌液于小离心管中，室温12000rpm离心1min收集菌体，弃去上清。加入100l冰预冷的溶液I，剧烈振荡直至悬液发稠。2).加入200l新配制的溶液II，温和颠倒5次，置冰上1-2min。3).加入150l冰预冷的溶液III，温和振荡10s，置冰上5min。4).12000rpm，离心10min,转上清于另一管中，用等体积的酚/氯仿抽提一次，10000rpm离心2min，吸上清于另一管中。加入2倍体积100乙醇，20沉淀1hr。5).12000rpm，离心10min回收质粒DNA，用75%乙醇洗一次，超净台中吹干沉淀后溶于适量灭菌重蒸水中。琼脂糖凝胶电泳检测质粒的质量。3、电泳检测：1）.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取g(g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70ml(50ml)1TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成%琼脂糖凝胶液.2）.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.加入显色剂溴化乙锭50ul（剧毒，需带手套及口罩）,混匀，将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3）.加样:在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4）.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.5)观察照相:取出凝胶，在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存结果：通过电泳检测，得到了所需的三种带目的基因的质粒实施例四：酶切质粒得到目的基因目的：该质粒为天然提取所得，需将该质粒上的目的基因酶切下来，以备后续实验。酶切，连接表达载体。酶切体系：质粒DNA内切酶缓冲剂Xho内切酶Xba内切酶无菌水电泳检测：同实验三电泳检测步骤，回收纯化：以北京优博奥生物科技有限公司所生产的DNA凝胶回收试剂盒为例1）在紫外灯下割下含DNA的琼脂糖胶块(TAE或TBE凝胶)，使它尽可能的小，放入离心管中。大体积的凝胶块需要切成小块，以缩短凝胶融化的时间。2）根据凝胶浓度，按下表所提供的参数加GSBuffer:凝胶浓度GSBuffer体积3倍凝胶体积4倍凝胶体积5倍凝胶体积如的琼脂糖凝胶重量为100mg，则应该加入400ulGSBuffer。3）悬浮均匀后置65水浴，每3分钟颠倒混匀一次，直至琼脂糖胶块完全溶化（约10mins）。按照GSBuffer体积的50加入PHBuffer，充分混合均匀。将混合液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10,000rpm离心30s，去废液。4）.将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500ulW2（加入乙醇否？）于离心吸附柱中，10,000rpm离心30s,弃滤液。以同样的方法再用500ulW2溶液洗涤一次；5）.将离心吸附柱置回废液收集管中，最高速度离心1min，以弃净W2。6）.小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的离心管中，在吸附膜中央加入30ulEB（EluentBuffer）,室温静置2-5min后，最高速度离心1min。7）.取出离心吸附柱，将离心管（DNA溶液）置于-20保存备用。结果：通过电泳检测并回收纯化，得到了酶切完全的三种目的基因实验五：酶联目的基因与载体质粒PKY目的：基因与载体质粒连接后，可较稳固的转化到宿主中，并有效表达。连接体系：用Xho和Xba酶处理过的表达载体pKY171Xho和Xba内切获得的目的基因片段连接缓冲剂无菌水电泳检测：同实验三电泳检测步骤回收纯化：同实验四回收纯化步骤结果：通过电泳检测并回收纯化，得到了带三种目的基因的重组质粒实验六：重组质粒转化大肠杆菌中扩增：目的：酶连后的质粒量较少，需扩增，以备后续实验。1、制备大肠杆菌感受态细胞：同实验二制备大肠杆菌感受态细胞方法。2、转化，筛选：同实验二转化，筛选步骤。结果：通过筛选，得到了三种重组质粒转化后的大肠杆菌实验七：提取重组质粒并回收纯化目的：重组质粒存在于大肠杆菌中，需提取纯化，以备后续实验1、提取质粒：同实验三质粒提取方法。2、电泳检测：同实验三电泳检测步骤3、回收纯化：同实验四回收纯化步骤结果：通过电泳检测并回收纯化，得到了三种重组质粒。实验八：纯化后的质粒转化到农杆菌中目的：农杆菌用于侵蚀藻类，故需将质粒转化到农杆菌中，由于质粒转化到农杆菌中较困难，故先前重组的质粒只能在大肠杆菌中扩增后，再提取转化到农杆菌中。1、制备农杆菌感受态细胞：实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120，15分钟。材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，,，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/mlNNaCl，高压灭菌。20mMCaCl2，高压灭菌。实验步骤1）.挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Sm125mg/l）中，28C振荡培养过夜；2）.取过夜培养菌液接种于50mlYEB(Sm125mg/l)液体培养基中，28C振荡培养至OD600为；3）.5000rpm,离心5min；4）.加入10mlNaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm,离心5min；5）.弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mMCaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1分钟，置70C保存备用。2、转化，筛选：同实验二转化，筛选步骤结果：通过筛选，得到了三种重组质粒转化后的农杆菌实验九：农杆菌多次侵蚀藻类：目的：利用农杆菌的侵蚀能力，进行侵蚀藻类。藻类预培养（1-5天），农杆菌侵染（数秒钟），共培养（2-3天）筛选（培养基中加入抑菌抗生素和选择抗生素），抗性藻类的获得。结果：将含ADH-PKY农杆菌、含PDC-PKY农杆菌依次与小球藻共培养。通过筛选得到抗性小球藻。实验十：培养藻类目的：扩增藻类，以便检查目的基因是否表达，得到目的产物。以1/10的LB液体培养基，按10：1比例，恒温光照，培养小球藻结果：小球