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实验七过氧化氢酶米氏常数 Km 的测定 一 实验目的 学习米氏常数 Km 的测定方法 二 实验原理 过氧化氢酶 CAT 催化下列反应 2H2O2 2H2O O2 H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知 2KMnO4 5H2O2 3H2SO4 2MnSO4 K2SO4 5O2 8H2O求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度 双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数 米氏常数的测定 双倒数作图法 Lineweaver Burk法 1Km11 vVmax S Vmax 三 试剂 1 0 05mol L草酸钠标准液将草酸钠 AR 于100 105 烘12h 冷却后 准确称取0 67g 用水溶解倒入100ml量瓶中 加入浓H2SO45ml 加蒸馏水至刻度 充分混匀 此液可贮存数周 2 约0 02mlKMnO4储存液称取KMnO43 4g 溶于1000ml蒸馏水中 加热搅拌 待全部溶解后 用表面皿盖住 在低于沸点温度上加热数小时 冷后放置过夜 玻璃丝过滤 棕色瓶内保存 3 0 004mol LKMnO4应用液取0 05mol L草酸钠标准液20ml 于锥形瓶中 加浓H2SO4ml 于70 水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色 根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度 稀释成0 004mol L 每次稀释都必须重新标定储存液 4 约0 05mol LH2O2液取20 H2O2 AR 40ml于1000 0ml量瓶中 加蒸馏水至刻度 临用时用0 004mol LKMnO4标定之 稀释至所需浓度 5 0 2mol L磷酸盐缓冲液 pH7 0 四 操作步骤 l 血液稀释吸取新鲜 或肝素抗凝 血液0 1ml 用磷酸盐缓冲液 pH7 0 0 2mol L 稀释至150ml 得1 1500稀释血液 2 H2O2浓度的标定 取洁净锥形瓶两只 各加浓度约为0 05mol L的H2O22 0ml和25 H2SO42 0ml 分别用0 004mol LKMnO4滴定至微红色 从滴定用去KMnO4ml数 求出H2O2的mol浓度 3 反应速度的测定 取干燥洁净50ml锥形瓶5只 编号 按下表操作 依次加入1 1500稀释血液每瓶0 5ml 边加边摇 反应时间5min 按顺序向各瓶加25 H2SO42 0ml 边加边摇 使酶促反应立即终止 最后用0 004mol LKMnO4滴定各瓶至微红色 记录KMnO4消耗量 ml 五 计算 1 反应速度的计算 以反应消耗的H2O2mmol数表示 反应速度 加入的H2O2mmol数 剩余的H2O2mmol数即 H2O2mol浓度 加入的毫升数 KMnO40 004mol L 消耗的KMnO4毫升数 5 2 式中 5 2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数 2 求Km值 下面引用一次实验结果为例 求过氧化氢酶的Km值 供计算参考 己知KMnO4为0 004mo1 L 标定出H2O2浓度为0 05mol L 列表计算如下 按
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