植物生理学实验zcPPT课件

1 植物生理学 张中实验 2 目录 1 植物组织水势的测定2 质壁分离法测定植物细胞的渗透势3 钾离子对气孔开度的影响4 根系活力的测定增加矿质营养实验5 植物组织中全磷含量的测定6 硝态氮含量的测定7 叶绿体色素的提取 分离8 叶绿体色素的理化性质PEA和氧电极实验9 光合强度的测定10 呼吸强度的测定 3 目录 11 过氧化物酶活性的测定12 植物组织中还原糖含量的测定13 植物蛋白质含量的测定14 吲哚乙酸含量的测定15 吲哚乙酸氧化酶活性的测定16 赤霉素对a 淀粉酶的诱导形成17 种子生活力的快速测定18 油料种子萌发时脂肪酸的变化19 不良环境对植物的伤害20 植物缺水程度的鉴定 4 一 实验目意义掌握植物组织水势的测定方法 通过实验进一步了解渗透系统中水势的大小是水分移动方向的决定因素 二 实验原理水势表示水分的化学势 植物体细胞与细胞之间 组织与组织之间 植物体与环境之间的水分移动方向都是由二者的水势差决定的 水总是由水势高的区域向水势低的区域移动 当植物组织与外界溶液接触时 如果植物组织的水势低于外界溶液的水势 植物细胞吸水而使外界溶液的浓度变大 反之 植物组织失水而使外界溶液变小 若二者相等 外界溶液浓度不变 此时外界溶液的渗透势等于植物组织的水势 同一种溶液的浓度不同其比重也不同 当两个不同浓度的溶液相遇时 在指示剂的作用下 稀的溶液由于比重小而上浮 较浓的溶液由于比重大而下沉 当把浸过植物组织的溶液滴回到原浓度溶液中时 会发生滴液上浮 下沉和基本不动的三种现象 若滴液不上下移动 则表示溶液的渗透势等于植物组织的水势 此溶液即为等渗溶液 根据其等渗浓度可计算出该溶液的渗透势 即等于植物组织的水势 三 实验材料 实验一植物组织水势的测定 5 四 实验步骤1 取5个小瓶 编号 分别加入0 025 0 05 0 1 0 2 0 3mol LNaCl溶液2ml 盖上瓶塞 作为实验组 备用 在取1个小瓶 加入0 1mol LNaCl溶液2ml 做对照 2 另取5只带贝塞试管 按实验组顺序编号 分别加入以上不同浓度的NaCl溶液8 10ml 塞上贝塞 作为对照组 备用 3 取植物叶片 避开中脉 用打孔器 将叶片置橡皮塞上 打50片直径为1cm的小圆片 立即依次向实验组各小瓶中放入10片小圆片 盖上瓶塞 放置30min 其间轻轻摇动小瓶几次 注意切勿让小圆片沾到瓶壁上 始终让小圆片浸泡在溶液中 30min后 向各小瓶滴加1 2滴甲基蓝试剂 注意滴数一致 4 用注射器 一种浓度一只 从实验组各小瓶中依次吸取蓝色溶液少许 然后伸入对照组相同编号的试管溶液的中部 轻轻放出一滴蓝色溶液 观察小液流移动的方向 记下等渗溶液浓度 五 结果结果1 记录 蔗糖溶液浓度 mol L 小液流移动方向0 0250 050 100 200 302 计算根据公式计算溶液的渗透势表示植物组织的水势 w iRCT w 表示植物组织的水势 用Mpa表示i 为溶液的等渗系数 NaCl等渗系数为1 8 R 为气体常数 R 0 008314MPa L 1 mol 1 K 1C 为小液流上下不动的NaCl浓度 mol L 1 等渗浓度 T 为绝对温度 T 273 t t为室温 六 实验结果分析和讨论1 小液流移动方向会发生上浮 下沉和基本不动三种现象 为什么 下次实验 K 对气孔开度的影响 6 实验二质壁分离法测定植物细胞的渗透势 一 原理植物细胞与外界溶液组成的渗透体系在恒温 恒压条件下 整个体系的水势由植物细胞的水势和和溶液的渗透势组成 它们之间的差为 s w s为溶液的渗透势 w植物组织的水势 如果二者达到平衡 则 s w 也就是说 植物组织的水势等于溶液的渗透势 植物细胞的水势由 s p和 m组成 它们之间的关系为 w s p m当植物细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态 并处在初始质壁分离时 这时 p近似等于零 当植物细胞的细胞壁等衬质被水饱和时 其 m很小 可以忽略不记 这时上式可写成 w s 所以 当植物细胞与周围溶液处于渗透平衡状态 而且在细胞处于初始质壁分离时 细胞的水势主要由 s组成 此时细胞液的渗透势就等于溶液的渗透势 当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时 细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离浓度之间的溶液浓度 将等渗浓度代入公式可以计算出细胞的渗透势 7 二 操作步骤1 溶液配制 先配制1mol L的蔗糖母液 再稀释成0 20 0 25 0 30 0 35 0 40 0 45 0 50 0 55 0 60mol L溶液 备用 2 选有色素的植物组织 一般选用洋葱鳞片的外表皮 用镊子取下表皮 迅速分别放入各种浓度的蔗糖溶液中 使其完全浸入溶液 放置10 15分钟 依次取出不同浓度的蔗糖溶液中的植物表皮薄片 放在滴有相同浓度蔗糖溶液的载玻片上 盖上盖玻片 在显微镜下观察所有细胞产生质壁分离的情况 并记下质壁分离的相对程度 3 在实验中确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离 初始质壁分离 的浓度和不引起质壁分离的最高浓度 4 用新的溶液和新鲜的材料重复实验观察几次 直到有确定的结果为止 在此条件下 细胞的渗透势于上述两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等的结果记录于下表 8 蔗糖浓度 1mol L 渗透势 MPa 质壁分离的相对浓度0 600 550 500 450 400 350 300 250 20三 结果计算测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值 C 后 按实验1中的公式 S iRCT计算溶液的渗透势或植物组织的渗透势 或水势 四 实验作业1 试述细胞渗透作用的原理 作图表示 9 实验二钾离子对气孔开度的影响 一 实验目的意义了解钾离子在气孔张开中的调节作用 理解气孔开闭的机理 二 实验原理保卫细胞的渗透系统可由钾离子所调节 无论是环式光合磷酸化或非环式光合磷酸化 都可以产生ATP 支持保卫细胞逆浓度差从周围表皮细胞吸收钾离子 降低保卫细胞的渗透势 保卫细胞吸水 膨压增大 气孔张开 三 实验材料 10 钾离子对气孔开度的影响 四 实验步骤1 取三个培养皿 分别放入0 5 的KNO3 0 5 NaNO3和蒸馏水各10 15ml 2 取植物叶片下表皮若干片放入上述3个培养皿中 3 将培养皿置于人工光照条件或太阳光下照光30min 4 分别在显微镜下观察气孔的开度 五 实验结果1 画出气孔在开及关状态下的示意图2 记录各处理气孔的开放数 计算百分率 和开度 大小 六 实验结果分析和讨论1 思考题 比较何种溶液中气孔的开度最大 为什么 下次实验 植物根系活力的测定 11 实验三植物根系活力的测定 一 实验目的意义了解根系的生理作用 掌握植物根系活力的测定方法 二 实验原理测定方法有TTC法和 萘胺氧化法 萘胺氧化法的本质是POD催化作用 生成红色的 羟基 1 萘胺 POD活性越强 对 萘胺的氧化力也越强 植物的根系能吸附 氧化在根表面的 萘胺 生成红色的 羟基 1 萘胺 沉淀于根的表面 使根系成红色 根系活力愈强染色愈深 定性观察 12 植物根系活力的测定 也可以测定溶液中被氧化的 萘胺量 来表示根系活力的大小 萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料 通过比色测定 萘胺含量 萘胺氧化反应如下 NH2NH2 O OH 萘胺 羟基 1 萘胺 红色 定量测定 13 植物根系活力的测定 SO3HSO3H 2H NO 2 2H2O NH2N N 对氨基苯磺酸重氮化合物 萘胺 重氮化合物HO3SN NNH2 对苯磺酸 偶氮 萘胺 三 实验材料 显色反应 14 四 实验步骤1 样品处理 称取2 3g洗净的根系 吸干根表面的水分 放入100ml的三角瓶中 并加入10ml25ug ml的 萘胺溶液和10ml0 1mol L磷酸缓冲液 pH7 0 浸没根系 室温下静置10min 同时按上述方法做一对照 不放根 取4ml上述根系处理液 测定 萘胺含量 测定方法见步骤2 作为实验开始时的 萘胺初始浓度 作起始值 再将三角瓶置25 恒温箱中 下反应30min 再取4ml反应液测定 萘胺量 作终止值 同时测定对照 不放根 的 萘胺量 作为 萘胺自动氧化量 2 萘胺浓度测定取4ml处理液于50ml容量瓶中 加20ml蒸馏水 1 对氨基苯磺溶液2ml和0 1g L亚硝酸钠溶液2ml 在室温下放置5min 待溶液显红色后 用蒸馏水定容至50ml 于波长510nm处测定吸光度 校零液 磷酸缓冲液 记下OD并换算为浓度 标准曲线斜率值 OD 萘胺浓度 0 013 五 实验结果以被氧化的 萘胺量表示根系活力 ug g 1 h 1 计算公式如下 根系活力 ug g 1Fw h 1 式中 A 萘胺氧化量 ug ml B 萘胺自动氧化量 ug ml 六 实验结果分析和讨论1 思考题 简述根系的生理作用 w g t h A B V 下次实验 叶绿体色素的提取和分离 15 实验五植物组织中全磷含量的测定 一 原理磷是植物生长必需的三要素之一 磷被植物吸收进入植物体后 大部分转化为有机物 如糖类 G 6 P 磷酸甘油酸等 磷脂 核甘酸和核酸等 有一部分仍保持无机物形式 植物体内的磷可分为可溶性磷和不溶性磷 植物样品在强酸高温消化时 使不溶性磷酸盐装化为正磷酸状态进入溶液 同时高氯酸是一种强氧化剂 能使有机磷转化为正磷酸盐而进入溶液 磷酸根离子在酸性溶液中与钼锑抗混合显色剂反应生成黄色锑磷钼杂多酸络合物 被还原剂 如抗坏血酸 氯化亚锡 亚硫酸铁胺等 还原成磷钼蓝 在一定范围内磷钼蓝颜色的深浅于磷酸根的含量成正比 其最大吸收峰在660nm处 故可以用比色法测定无机磷的含量 16 二 操作步骤1 取通过100目筛的风干或烘干的样品100mg 精确到0 0001 于50ml三角瓶中 用数滴蒸馏水湿润后 加入浓H2SO43ml摇匀 加HOCl48 10滴混匀 在瓶口上放一弯颈小漏斗 置于电炉上加热消化 在通风橱内进行 待三角瓶中溶液开始转白或灰白色时表明消化完全 取下三角瓶冷却 室温下冷却 2 待溶液冷却后 用蒸馏水小心转入50ml容量瓶中 冲洗时用蒸馏水应少量多次 用蒸馏水定容 同时另作一空白对照 除不加样品外 其余步骤与样品相同 3 吸取待测液5ml于50ml容量瓶中 加蒸馏水25ml 2 6 二硝基酚指示1滴 滴加4N的HaOH使待测液成黄色 再加2N的H2SO41 4滴 使待测液黄色刚刚退去 加钼锑抗混合显色剂5ml 用蒸馏水定容 30min后于波长660nm处比色 记下光密度值 三 结果计算磷含量 100式中 C 从标准曲线上查得的P2O5的浓度 单位ug ml 106 将微克换算成克100 换算成百分数分取倍数 消化液定容体积 吸取消化液体积 ml C 比色溶液体积 分取倍数 样品重 106 17 实验四硝态氮含量的测定 氮是植物的三大要素之一 大多数植物 尤其是陆生植物最主要的氮源是硝态氮 植物从土壤中吸收硝酸盐 一部分在根内被还原为氨 再转变为有机含氮化合物 氨基酸或酰氨 向植物地上部分运输 其余部分则运到叶片中再还原 植物体内硝酸盐的含量能反映出土壤中硝态氮的供应情况 因此可作为对土壤施肥的指标 一 原理植物中的硝酸盐可以用1 醋酸溶液提取 在PH5 6的条件下 用锌粉将硝酸根还原为亚硝酸根 亚硝酸根在酸性条件下与磺胺和 萘胺反应 生成玫瑰红色的偶氮化合物 其颜色的深浅与硝态氮的含量在一定范围内呈线性关系 主要化学反应如下 18 硝态氮含量的测定 NH2N N NO2 磺胺重氮盐N NNH2重氮盐 萘胺偶氮化合物 SO2NH2 HCl SO2NH2 SO2NH2 H2HO2S N N NH2 19 二 操作步骤1 材料处理取去中脉的植物叶片1g 剪成1 2mm长的碎片 置100ml的三角瓶中 加入1 醋酸溶液20ml 使叶片全部浸入溶液中 振荡或不断摇动20min 取浸出液2ml于试管中 加2ml1 的醋酸溶液 再加0 8mol L醋酸钠溶液4ml 加入20mg锌粉 不断摇动20min 过滤至干燥试管中 备用 2 硝态氮含量的测定取过滤液4ml于一干燥试管中 加入1ml 萘胺 磺胺试剂 摇匀 10min后 于波长540nm处测定光密度 3 叶片中原已存在的NO2 含量的测定取2ml叶片浸出液 除不加锌粉外 其它步骤按方上述方法进行 三 结果计算根据以下公式计算植物叶片中硝态氮的含量 A ugNO3 gFw C1 C2 N式中 A 为每g植物组织中硝态氮的含量 ugNO3 gFw C1 为叶片浸提液中中原已存在的NO2 和NO3 的总和 ug ml C2 为叶片浸提液中中原已存在的NO2 的含量 ug ml N 为稀释倍数 20 实验四叶绿体色素的提取和分离实验五叶绿素理化性质的观察 一 实验目的意义了解叶绿体色素提取分离的原理 叶绿素的理化性质及其对光合作用的意义 二 实验原理高等植物中主要有叶绿素 chla chlb 和类胡萝卜素 胡萝卜素和叶黄素 两大类 它们与类囊体膜相结合 构成色素蛋白复合体 叶绿体色素不溶于水而溶于有机溶剂 故可用乙醇 丙酮等有机溶剂提取 提取液可用色谱分析分离 即根据它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同 用适当的溶剂推动时 叶绿体色素中各种成分在两相 固定相和流动相 间由于具有不同的分配系数 所以移动速度不同 经过一段时间后 可将各种色素彼此分离开 21 三 实验材料四 实验步骤1 叶绿体色素的提取 取新鲜植物叶片洗净 擦干 去中脉 称1 2g剪碎放入研钵中加95 乙醇5ml 并加少许碳酸钙 研磨成匀浆 再加95 乙醇10ml 用漏斗过滤于试管中 残渣及滤纸用95 乙醇冲洗 一同过滤于试管中 即为叶绿体色素提取液 置暗处备用 2 叶绿体色素的分离 取层析纸条一张 2cm 20cm 将其一端剪去两侧 中间留一长约1 5cm 宽约0 5cm的窄条 用毛细滴管吸取叶绿素溶液点于窄条的上方 一次最好点1滴 吹干或风干后再点 这样重复点多次 取层析管 平底试管 一只 加入四氯化碳3 5ml及少许无水硫酸钠 然后将滤纸条固定于橡皮塞上 插入层析管内 使窄条浸入溶剂中 色素点要略高于液面 滤纸条边缘不可碰到试管壁 盖紧橡皮塞 直立于阴暗处进行层析 不能移动 待展开剂前沿接近层析纸条前沿时 取出层析纸条 观察分离后色素带的分布 22 3 叶绿体色素的理化性质观察 叶绿素吸收光谱将色素提取液用分光镜观察其吸收光谱 叶绿素的荧光现象将色素提取液 分别在反射光和透射光下观察 在反射光下观察到的血红色 即为叶绿素产生的荧光现象 去镁叶绿素的形成及铜离子的替代作用取上述色素乙醇提取液少许 3 5ml 于试管中 一滴一滴加5 HCl 摇动 直至溶液变成黄色 此时叶绿素分子已遭破坏 形成Pheo 然后加醋酸铜晶体少许 于沸水浴中慢慢摇动加热 又产生鲜亮的绿色 即形成了铜代叶绿素 五 实验结果1 将层析纸上展开的色素斑点标上色素名称并附在实验报告上 六 实验结果分析和讨论1 研磨叶片时为什么要加入少量的碳酸钙 下次实验 叶绿素a b含量测定 23 实验六叶绿素a b和类胡萝卜素含量的测定 一 实验目的掌握叶绿素a b及类胡萝卜素含量的测定方法及计算 了解不同植物叶绿素a b的含量及比例 二 实验原理Chla Chlb和类胡箩卜素的乙醇溶液的最大吸收峰分别位于665nm 649nm和470nm 同时在该波长时Chla Chlb 类胡箩卜素的比吸收系数K为已知 即可以根据Lambert Beer定律 列出浓度C与光密度D之间的关系式 24 D665 83 31Ca 18 60Cb 1 D649 24 54Ca 44 24Cb 2 式中 D665 D649为chla溶液在波长665nm和649nm时的光密度 Ca Cb为chla chlb的浓度 浓度单位为每升克数 83 31 18 60为chla chlb在波长665nm时的比吸收系数 24 54 44 24为chla chlb在波长649nm时的比吸收系数 解方程式 1 2 则得 CA 13 7D665 5 76D649 3 CB 25 8D649 7 6D665 4 CT CA CB 6 10D665 20 04D649 5 浓度单位为每升毫克数 同样 类胡萝卜素为 CK 4 7D470 0 27CA B 浓度单位为每升毫克数 mg L 三 实验材料 25 四 实验步骤1 色素的提取取新鲜叶片 洗干净并吸干叶面的水分 去叶柄和中脉 称取0 2g于研钵中 加少量碳酸钙 95 乙醇2 3ml 研成匀浆 再加乙醇10ml 继续研磨至组织变白 过滤于50ml容量瓶中 用少许乙醇冲洗研钵 研棒及残渣数次 最后连同残渣一起转入漏斗中 用滴管吸取乙醇 将滤纸上的色素全部洗入容量瓶中 直至滤纸和残渣中无绿色为止 用乙醇定容 2 测定吸光度将叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内 以95 乙醇为空白 分别于波长665nm 649nm 470nm下测定吸光度 五 结果计算将测定的吸光度代入公式 3 6 分别计算chla chlb 总叶绿素和类胡箩卜素浓度 再根据稀释因子计算出各色素的含量 以mg g 1Fw表示 1 CA 13 7D665 5 76D649 N2 CB 25 8D649 7 6D665 N3 CT CA CB 6 10D665 20 04D649 N4 CK 4 7D470 0 27CA B N计算a b 六 实验结果分析及讨论1 思考题 测定叶绿素a b含量为什么要选用红光波长 26 实验九光合作用强度的测定 一 原理光合作用强度的测定可以反映植物光能的利用 制造有机物质的能力和植物的生长状况 在生产实践中 是选育优良品种 合理密植以及科学管理作物的理论根据之一 通常用单位时间 单位叶面积的CO2吸收量或O2的释放量或干物质的积累量 即光合速率 来表示光合强度 27 二 实验步骤1 选择测定样品选定有代表性植株叶片 如叶片的部位 叶龄 受光条件等 10 20张 用小纸牌编号 2 叶片基部处理为了不使选定叶片中光合作用产物往外运 而影响测定结果的准确性 用5 三氯乙酸点涂叶柄基部 阻止光合产物的输出 三氯乙酸是一种很强的蛋白质沉淀剂 渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死 而阻止光合产物的运输 三氯乙酸的浓度 视叶柄的幼嫩程度而异 以能明显灼伤叶柄 而又不影响水分供应 不改变叶片角度为宜 一般使用5 三氯乙酸 为了叶片不致下垂 可根据不同的植物 叶柄处理也可采用下列方法进行处理 1 可将叶子输导系统的韧皮部破坏 如棉花等双子叶植物的叶片 可用刀片将叶柄的外皮环割约0 5cm宽 2 如果是小麦 水稻等单子叶植物 由于韧皮部和木质部难以分开处理 可用刚在开水中浸过的纱布或棉花做成的夹子 将叶子基部烫伤一小段即可 一般用90 以上的开水烫20s 用锡纸包裹叶柄 使叶片保持原来的着生角度 28 3 剪取样品叶柄基部处理完毕后 即可剪取样品 记录时间 按编号顺序 使各叶片照光时间尽量一致 分别剪下对称叶片的一半 主脉不剪下 并按编号顺序夹于湿润的纱布中 带回室内贮于暗处 光照5 6h后 再依次剪下另外一半叶片 同样按编号夹于湿润纱布中 4 称重比较将照光和和黑暗中的叶片分别重叠在一起 用相同孔经的打孔器分别取100片小圆片 分别置于两个已知重量的铝盒中 80 90 下烘干至恒重 约4 5h 置干燥器平衡后于天平上称重比较 三 结果计算以干物质计 mg dm2 h表示 计算公式如下 光合作用强度 由于叶内贮存的光合作用产物一般为蔗糖和淀粉等 可将干物质重量乘以系数1 5 得CO2同化量 单位为mg dm2 h 光下叶片干重 暗下叶片干重 mg 叶面积 dm2 t h 29 四 注意事项1 叶柄的环割或处理是实验的关键 2 称重前必须在干燥器中平衡 否则误差很大 30 实验十一呼吸速率的测定 一 实验目的意义了解测定呼吸强度的不同方法 掌握小篮子法测定呼吸强度的装置 原理 过程及结果表示方法 二 实验原理 植物组织的呼吸强度 可用单位重量 g 植物材料在单位时间 h 内释放的CO2量来表示 小蓝子法是采用滴定法测定呼吸强度 将被测定的材料装入一个尼龙网袋 小蓝子 内 悬挂在密封的广口瓶内 广口瓶中装有Ba OH 2 用来吸收材料呼吸过程中释放的CO2 然后用已知浓度的H2C2O4溶液滴定剩余的Ba OH 2 从空白和样品两者消耗H2C2O4溶液体积之差 即可计算呼吸过程中释放CO2的量 有关反应如下 CO2 H2O H2CO3Ba OH 2 H2CO3 BaCO3 2H2OBa OH 2 剩余部分 H2C2O4 BaC2O4 2H2O三 实验材料 31 四 实验装置取500ml广口瓶一个 配置一个三孔橡皮塞 其中一孔插入装有碱石灰的干燥管 以吸收空气中的CO2 保证进入广口瓶的空气无CO2 一孔插入温度计 另一孔 直径约1cm左右 供插滴定管 未插滴定管前用小橡皮塞塞紧 瓶塞下面挂一尼龙网制小篮 供装实验材料 32 五 实验步骤1 称取材料10 15g 装于小篮内 将小篮子固定在橡皮塞上 同时向广口瓶中加0 05mol LBa OH 2溶液20ml 立即塞紧瓶塞 实验途中每5min左右轻轻地摇动广口瓶一次 破坏溶液表面的BaCO3薄膜 以利对CO2的吸收 2 另按上述方法 不放材料 作同样测定 作为实验对照 3 30 60min后 小心打开瓶塞 迅速取出小篮子 加入1 2滴酚酞指示剂 立即重新塞紧瓶塞 然后拔出插在滴定管孔口的小橡皮塞 将滴定管插入孔中 用1 44mol L的H2C2O4滴定 直到红色转变成无色为终点 若30秒钟内溶液又变为红色 可补加1滴H2C2O4 记录滴定所耗用的H2C2O4溶液的体积 ml数 六实验结果按每消耗1mlH2C2O4溶液相当于1mgCO2计算材料在呼吸放出CO2的mg数 计算公式 呼吸强度 CO2mg gFw h 式中 V0为空白对照所耗用H2C2O4的体积 ml V1为材料所耗用H2C2O4的体积 ml M 草酸摩尔浓度ECO2 CO2的摩尔质量七 实验结果分析和讨论1 测定呼吸速率有何意义 V0 V1 M ECO2 W g t h 下次实验 POD活性测定 33 实验十二过氧化物酶活性的测定 一 实验目的意义掌握分光光度计测定POD的方法和酶活力的表示方法 二 实验原理POD广泛存在植物体中 是呼吸作用过程中一个重要的末端氧化酶 在细胞质中起IAA氧化酶的作用 在植物生长发育的整个过程中 其活性不断发生变化 因此测定POD的活性 可以反映某一时期植物体内代谢的变化 在H2O2存在下 POD催化愈创木酚氧化成茶褐色的产物 生成物在470nm处有最大吸收 通过测定生成物的含量 可计算出POD活力 三 实验材料 34 四 操作步骤1 称取植物材料 土豆 小白菜等 0 5g 加0 1mol L 1tris HCl缓冲液 PH8 5 5m1 于研钵中研磨成匀浆 于4000rpm下离心15min 倾出上清液 必要时 残渣再用5ml缓冲液提取一次 合并两次上清液 贮存于冷处 0 5 备用 2 取光径1cm比色杯2只 于1只比色杯加入上述酶液1ml 如酶活性过高可稀释之 土豆约稀释5倍 再加入反应混合液3ml 立即开启秒表记录时间 另取一只比色杯并加入0 2mol L 1磷酸缓冲液 PH6 0 校零 于波长470nm测量吸光度 一般测定反应0 3min或0 5min内的光密度值 取其平均值计算 五 结果计算以每min内OD470变化0 01为一个酶活力单位 U 计算POD的活力 计算公式 OD470 A B 提取酶液总体积 ml 0 01 W t 测定用酶液体积 ml POD活力 U gFw min 六 实验结果分析和讨论1 思考题 POD的一般性质 下次实验 可溶性糖含量的测定 35 实验十三植物组织中可溶性糖含量的测定 一 实验目的意义了解糖的测定方法 糖的提取与测定步骤 二 实验原理糖在H2SO4作用下脱水 生成羟甲基呋喃醛 蒽酮在H2SO4作用下生成蒽酚 羟甲基呋喃醛在蒽酚作用下 发生缩合反应 形成绿色络合物 其颜色的深浅与糖含量呈正相关 该实验方法简便 其缺点是没有专一性 因为绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮发生反应 生成绿色络合物 三 实验材料 36 四 操作步骤1 糖绘制标准曲线准确称取经80 烘干的AR葡萄糖100mg 用蒸馏水定容至500ml 即每ml含糖为200ug的标准溶液 将其稀释成一系列0 200ug ml的不同浓度的溶液 即糖浓度分别为0 00 25 50 75 100 120 150 200ug ml 用蒸馏水定容至100ml 取上述溶液1ml于试管中 加蒽酮试剂5ml 混匀后于沸水中加热10分钟 取出冷却 于波长625nm测定其OD值 然后绘制标准曲线 或求得直线回归方程 37 2 可溶性糖的提取称取约0 2g的新鲜植物叶片于研钵中 加乙醚1ml 仔细研磨成匀浆 转入20ml带塞试管中 用10 15ml蒸馏水洗涤研钵 洗液并入试管中 将试管置水浴锅中加热 保持70 80 的温度约30min 取出冷却后1滴1滴地加入饱和醋酸铅溶液 以除去蛋白质 直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止 然后将此提取液 连同残渣 洗入50ml容量瓶中 加蒸馏水定容 充分振荡 用漏斗将溶液过滤于一干燥的三角烧瓶中 瓶中事先放有少量 约0 2 0 4g 草酸钠 以除去滤液中过量的醋酸铅 使其生成草酸铅沉淀 再过滤一次 所得透明滤液即为可溶性糖提取液 3 糖浓度的测定吸取上述过滤液1ml于10ml试管中 加蒽酮试剂5ml 混匀后于沸水浴 90 中加热10min 取出冷却 于波长625nm处比色 测得光密度 从标准曲线上查得待测液的含糖量 另取10ml试管加1ml蒸馏水 加蒽酮试剂5ml于沸水浴 90 加热10min 取出冷却 作校零 五 结果计算式中 V 为植物样品提取得定容的体积 ml 若含量高 需要稀释 C 为提取液的含糖量 ug ml W 为植物组织鲜重 g 六 实验结果分析和讨论 C V W 106 100 可溶性糖含量 计算公式 下次实验 种子生活力的测定 38 实验十三植物蛋白质含量的测定 一 原理蛋白质在碱性条件下与硫酸铜生成紫色络合物 在一定范围内蛋白质含量与生成的络合物颜色呈比例关系 选用与生成物颜色相应的波长测定其OD 可计算出蛋白质的含量 二 操作步骤1 绘制标准曲线称取经100目过筛的酪蛋白0 05 0 06 0 07 0 08 0 09 0 10 0 11 0 12g分别置于100ml干洁的三角瓶中 另取一个三角瓶 不加酪蛋白 各加碳酸铜0 5g 无水乙醇10ml 摇匀 勿使样品粘结于瓶底 再加10 KOH溶液10ml 继续摇动约30分钟 使之充分反应显色 将上清液过滤于一干洁的大试管中 立即在波长550nm处比色 读取光密度值 绘制标准曲线 39 植物蛋白质含量的测定 2 样品的测定将风干的米粒样品 磨粉 通过100目筛 称取0 5g放入干洁的三角瓶中 加碳酸铜0 5g 无水乙醇10ml 摇匀 勿使样品粘结于瓶底 再加10 KOH溶液10ml 继续摇动约30分钟 使之充分反应显色 将上清液过滤于一干洁的大试管中 摇动 过滤 将过滤液于550nm处比色 从标准曲线上查得样品的浓度 三 结果计算 计算公式 P 100 式中 P 待测样品中蛋白质的含量 A 从标准曲线上查得的蛋白质含量 g B 酪蛋白纯度 90 W 样品重量 g A B W g 40 实验十四吲哚乙酸含量的测定 一 原理吲哚乙酸在无机酸存在的条件下 能与Fe作用生成红色的螯合物 其牙色的深浅与吲哚乙酸含量在一定范围内呈线性关系 选用与生成物颜色相应的波长测定其光密度 可计算待测液的吲哚乙酸含量 二 操作步骤1 绘制标准曲线 IAA10mg 用少量无水乙醇溶解 再用蒸馏水定容至100ml 为IAA母液 41 IAA的系列标准溶液 IAA标准浓度 ug ml 2520151052 0 1 0IAA母液体积 ml 2 52 01 51 00 50 250 1用蒸馏水定容体积 ml 10101010101010 取8只试管 每只分别加入不同浓度的IAA标准溶液2ml 再加入IAA试剂4ml 置于40 的黑暗 烘箱 处保温30分钟 使反应液呈红色 于波长530nm处测定光密度 记下OD并绘制标准曲线 42 2 材料中IAA的提取取玉米粉末10g于烧杯中 加入0 1N的NaOH溶液40ml 烧杯上面加盖 以防止水分蒸发 置于100 水浴中保温15分钟 从水浴中取出后再加入0 1N的NaOH溶液25ml 充分摇匀 再用甲醇定容至100ml 静置30分钟 取上清液在4000rpm离心20分钟 上清液即为IAA提取液 3 IAA的测定取试管一只 加入离心液2ml 再按制作标准曲线的步骤 测定待测液的光密度 三 结果计算计算公式 IAA含量 ppm E S N 式中 E 为待测液测得的光密度值 S 为标准曲线系数 N 为稀释倍数 43 实验十五 十六IAA含量及IAA氧化酶活性的测定 一 实验原理 考试 吲哚乙酸在无机酸存在的条件下 能与Fe作用生成红色的螯合物 其牙色的深浅与吲哚乙酸含量在一定范围内呈线性关系 选用与生成物颜色相应的波长测定其光密度 可计算待测液的吲哚乙酸含量 植物体内IAA氧化酶活性的大小 对调节植物体内IAA的水平起着重要的作用 IAA在IAA氧化酶的作用下 失去活性 用有IAA氧化酶对IAA氧化和无IAA氧化酶的对照处理 通过测定二者IAA的含量 可知道在单位时间内 IAA被氧化的量 IAA的减少量 以其破坏IAA的速度表示IAA氧化酶活力的大小 而IAA含量可用比色法测定 二 实验材料磷酸缓冲溶液 PH6 1 0 02M MnCl2 1mM 2 4 二氯酚 1mM IAA溶液 1mM IAA显色试剂 10mlFeCl3 0 5M 与500mlHClO4 35 混合三 操作步骤1 IAA氧化酶酶液的提取取绿豆芽的胚轴2 3g于研钵中 加入预冷的磷酸缓冲溶液 PH6 1 5ml 研磨至匀浆 转入10ml带塞试管中 用磷酸缓冲溶液定溶至10ml 在4000rpm离心15min 上清液即为IAA氧化酶粗酶液 2 取一只10ml试管 加入2mlIAA氧化酶粗酶液 MnCl21ml 2 4 二氯酚1ml 磷酸缓冲液 PH6 1 4ml IAA溶液2ml 为酶作用组 另取一只10ml试管 除酶液用磷酸缓冲液代替外 其余和第一只试管相同 为CK组 混合均匀后将两只试管迅速置30 恒温水浴中 保温30min 44 3 另取两支10ml试管 一只试管加入酶作用组溶液2ml 另一只试管加入CK组溶液2ml 再各加入IAA显色试剂4ml 混合均匀 于40 黑暗处 烘箱内 放置30min 使反应液呈红色 4 取红色液于波长530nm处比色 记下OD530 校零液 1ml磷酸缓冲液 加IAA显色试剂2ml 四 标准曲线的制作 OD530 IAA浓度 mM 1 IAA的系列标准溶液 1mMIAA母液的配制 175mgIAA用少量无水乙醇溶解 用蒸馏水定容至1000ml IAA分子量175 IAA标准浓度 mM 0 250 20 150 10 050 0250 01取1mMIAA母液体积 ml 2 52 01 51 00 50 250 1用蒸馏水定容体积至10ml101010101010102 取8只试管 每只试管分别加入不同浓度的IAA标准溶液2ml 再加入IAA显色试剂 FeCl3 HClO4 4ml 置于40 的黑暗 烘箱 处保温30min 使反应液呈红色 于波长530nm处测定光密度 记下OD530 并绘制标准曲线 45 六 实验结果分析与讨论 本实验操作注意事项为什么试验中要加入MnCl2和2 4 二氯酚 实验步骤2和3的目的是什么 五 结果计算以每g鲜重样品氧化IAA的量 ug 表示IAA氧化酶活力大小 CK组IAA浓度 酶作用组的IAA浓度 V w gFw t h 式中 w 样品重 gFw t 处理时间 h N 稀释倍数V 定溶体积 ml 计算公式 实验数据记录 IAA氧化酶活性ugIAA g 1Fw h 1 N IAA分子量175注意单位 46 实验十五 十六IAA含量及IAA氧化酶活性的测定 一 实验原理植物体内IAA氧化酶活性的大小 对调节植物体内IAA的水平起着重要的作用 IAA在IAA氧化酶的作用下 失去活性 用有IAA氧化酶对IAA氧化和无IAA氧化酶的对照处理 通过测定二者IAA的含量 可知道在单位时间内 IAA被氧化的量 以其破坏IAA的速度表示IAA氧化酶活力的大小 而IAA含量可用比色法测定 二 标准曲线的制作1 IAA的系列标准溶液 IAA标准浓度 ug ml 2520151052 0 1 0IAA母液体积 ml 2 52 01 51 00 50 250 1用蒸馏水定容体积 ml 101010101010102 取8只试管 每只试管分别加入不同浓度的IAA标准溶液2ml 再加入试剂B4ml 置于40 的黑暗 烘箱 处保温30min 使反应液呈红色 于波长530nm处测定光密度 记下OD并绘制标准曲线 三 实验材料 47 四 操作步骤1 IAA氧化酶酶液的提取取绿豆芽的胚轴2 3g于研钵中 加入预冷的磷酸缓冲溶液 PH6 1 5ml 研磨至匀浆 转入10ml带塞试管中 用磷酸缓冲溶液定溶至10ml 在4000rpm离心15min 上清液即为IAA氧化酶酶液 2 取一只10ml试管 加入2mlIAA氧化酶酶液 MnCl21ml 2 4 二氯酚1ml 磷酸缓冲液 PH6 1 4ml IAA溶液2ml 为酶作用组 另取一只10ml试管 除酶液用磷酸缓冲液代替外 其余和第一只试管相同 为CK组 混合均匀后将两只试管迅速置30 恒温水浴中 保温30min 3 另取两支10ml试管 一只试管加入酶作用组溶液2ml 另一只试管加入CK组溶液2ml 再各加入IAA显色试剂 试剂B 4ml 混合均匀 于40 黑暗处 烘箱内 放置30min 使反应液呈红色 4 取红色液于波长530nm处比色 记下OD 校零液 2ml磷酸缓冲液 加试剂B4ml 试剂B FeCl3 HClO4 48 六 实验结果分析与讨论 思考题1 实验中为什么要加入MnCl2和2 4 二氯酚 2实验中有哪些注意事项 五 结果计算以每g鲜重样品氧化IAA的量 ug 表示IAA氧化酶活力大小 CK组IAA含量 酶作用组的IAA含量 V w gFw t h 式中 w 样品重 gFw t 处理时间 h N 稀释倍数V 定溶体积 ml 计算公式 实验数据记录 IAA氧化酶活性ugIAA g 1Fw h 1 N 49 实验十六赤霉素对a 淀粉酶的诱导形成 一 原理大麦 或小麦 种子吸水开始萌动后 胚乳中的淀粉在a 淀粉酶的作用下 水解为糖 a 淀粉酶是在胚乳中释放的赤霉素的作用下 在糊粉层中合成或被激活的 因此 没有胚存在或者说没有赤霉素的参与 a 淀粉酶就不能形成或被激活 二 操作步骤1 选用大小一致 具有生活力的大麦或小麦种子 用刀片将每粒种子横切成两半 使成为有胚的半粒和无胚的半粒 分别置于1 的次氯酸钠溶液中消毒15分钟 取出用无菌水冲洗数次 备用 50 2 取小瓶6只 编号 按下表加入各种溶液和材料编GA溶液浓度ml数含链霉素醋酸缓实验材料号101110个有胚半粒201110个无胚半粒32 10 51110个无胚半粒42 10 61110个无胚半粒52 10 71110个无胚半粒62 10 81110个无胚半粒 使小瓶中混合液的最后浓度 赤霉素分别为2 10 5 2 10 6 2 107 2 10 8mol L 醋酸缓溶液浓度为5 10 4mol L 链霉素含量为0 5mg ml 将小瓶于25 条件下培养24小时 进行振荡培养或经常摇动小瓶 mol L 缓冲溶液ml数 51 赤霉素对a 淀粉酶的诱导形成 3 淀粉酶活力分析从每个小瓶中吸取培养液0 1ml 分别置于事先盛有1 9ml淀粉磷酸盐溶液中 混匀 在30 温箱活水浴中保温10分钟 再加I KI溶液2ml 蒸馏水5ml 充分摇匀 于波长580nm处测定其OD 以蒸馏水作校零对照 所得OD从曲线上查得淀粉含量 以分解的淀粉量衡量淀粉酶活性的大小 52 实验十四种子生活力的快速测定 一 实验目的意义了解测定种子生活力的不同方法 二 实验原理凡具有生活力的种子胚 在呼吸作用过程中都有氧化还原反应 而无生命活力的种子胚则无此反应 当TTC渗入种子胚的活细胞内 并作为氢受体被脱氢辅酶 NADH2或NADPH2 上的氢还原时 使无色的TTC变为红色的三苯基甲腙 TTF 图 使种子胚着红色 而种子胚生活力衰退或部分丧失生活力的种子浸透TTC时 种子胚染色较浅或局部染色或完全不染色 因此可根据胚染色部位或染色的程度鉴定种子的生活力 凡生活细胞的原生质膜具有选择透性 而死的种胚细胞原生质膜丧失这种能力 于是染料 红墨水 便能进入死细胞而胚被染色 三 实验材料 53 HNN C6H5NN C6H5C6H5 CClC6H5 C HClN N C6H5N N C6H5 2H TTC 无色 TTF 红色 TTC的还原反应 54 四 操作步骤1 浸种将待测种子在30 35 温水中浸种 大麦 小麦 籼稻6 8h 玉米5 6h 粳稻2 3h 若选用蔬菜种子 依不同的种子浸泡时间不同 以增强种胚的呼吸强度 使显色迅速2 TTC染色法取吸胀水分的玉米种子20粒 用刀片沿种子胚的中心线纵切为两半 将其中的一半置于培养皿中 每皿20个半粒 加入适量的0 5 TTC以覆盖种子为度 10ml 然后置于30 恒温箱中0 5h 将另一半在沸水中煮沸5min的种胚作同样染色处理 作