L05067林拓

项目类别项目批准号附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：萝卜抗真菌蛋白Rs-AFPs的分离纯化研究申 请 人： 林拓 连晓锋 林仍 所在院部： 生命科学学院 专业年级： 02级 生物技术（1）班 联系电话：020-87344986 指导教师: 赵亚华 职称 教授 立项日期： 二五 年 五 月 八 日 结题日期： 二六 年 四 月 六 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称萝卜抗真菌蛋白Rs-AFPs的分离纯化研究项目类别A、文科类； B、理科类；申请经费1500 元起止年月2005.5-2006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字林拓男1984902级生物技术（1）班生命科学学院81.82凝胶层析、电泳蛋白测定等连晓锋男1983802级生物技术（1）班生命科学学院73.97样品前处理林仍男1983702级生物技术（1）班生命科学学院68.92生物活性测定指导教师情况姓名赵亚华性别女学位硕士职称教授硕士生导师研究方向生物化学和分子生物学授课名称分子生物学 生物化学项目简介 萝卜种子中有两种富含半胱氨酸残基的蛋白质，能表现出有效的抗真菌活性。它们被命名为萝卜抗真菌蛋白(Rs-AFPs)。这两种蛋白质在种子萌发过程中优先释放出来，有效地增强了种子周围微环境的抗真菌能力。对Rs-AFPs粗提液进一步纯化后研究了它对热带作物部分病原真菌的抗性，证明它对植物丝状病原真菌有广谱的抑制作用，为进一步克隆和表达，开发和利用这类抗真菌蛋白质提供了科学依据。二、项目研究的内容与方法实验内容与方法：粗提液的制备 硫酸铵分级沉淀和透析除盐 sephadex G-50凝胶过滤（每步完成后，测定总蛋白（蛋白浓度溶液总体积） 总活性比活性（总活性/总蛋白） 生物活性分析 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析性质等（一）萝卜种子Rs-AFPs粗提液的制备： 用蒸馏水浸泡萝卜种子30min，用解剖刀沿种子外周半分线切开一个小口，用100mL0.05mol/L pH7.5 Tris-HCl 缓冲液室温浸泡4h，种子用量占总体积的2/3，记录所用种子的重量。收集上清液，3000rpm 4离心5min。收集上清，11000rpm 4 离心5min，离心两次，再收集上清，得到粗提液。（二）粗提液的硫酸铵分级沉淀和透析除盐。 把粗提液分步加入硫酸铵，分别达到硫酸铵浓度为030，3050，5070，7090。离心收集各浓度范围下的沉淀，根据沉淀的量用适量的0.05mol/L pH7.5 Tris-HCl 缓冲液溶解沉淀。把溶解后得到的溶液装入透析袋，用0.05mol/L pH7.2 Tris-HCl 进行透析直到完全除去硫酸铵（可用AgCl溶液检验）。（三）Sephadex G-50凝胶过滤 Sephadex G-50用蒸馏水煮沸 2溶胀 ,装入2 60层析柱。用0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液 (7.5 )平衡、洗脱 ,流速 0 .3/，每管收集 3,测定280。收集各个蛋白流出峰，分别测定抗菌活性。初步预定目标：得到分子量为80000左右的RsAFPs多肽，电泳表现为一条带。（四）生物活性分析：琼脂糖扩散测定抑菌圈大小病源菌：芭蕉炭疽菌。培养基：PDA。PDA培养基的配制：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，用200ml三角瓶分装，蒸气（121）灭菌20分钟左右后取出。方法：用无菌水制备芭蕉炭疽菌孢子悬液，在PDA培养基未凝固之前倒入培养基中，然后倒入平板培养皿中。凝固后在培养基上打一小孔（具体直径暂定为0.5cm）。把30uL待测液注入小孔中，4放置过夜，待液体被培养基完全吸收后，把培养基在28放置48h，量抑菌圈的大小。（五） 蛋白质浓度测定法：用考马斯亮蓝G-250法1. 蛋白浓度标准曲线的绘制： 参考生物化学实验技术教程（赵亚华主编，华南理工大学出版社，2000）。2. 目标蛋白浓度测定：0.1mL提取液5mL考马斯亮蓝G-250，充分混合，放置2min后测A595，比照标准曲线，算出蛋白浓度。（六）尿素SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（用于鉴定纯度，分析组分的分子量）浓缩胶浓度：4T，3C 分离胶浓度：20T，6C 间隙胶:10T，3CT%（丙烯酰胺（g）双丙烯酰胺（g）/ 总体积（mL）100C%双丙烯酰胺（g）/ （丙烯酰胺（g）双丙烯酰胺（g）100凝胶成分分离胶间隙胶浓缩胶凝胶贮液（mL）49.5T 3C-0.600.40凝胶贮液（mL）49.5T 6C3.76-分离胶buffer(mL)4.00-浓缩胶buffer(mL)1.001.24尿素(g)4.32-10过硫酸铵(uL)401020TEMED(uL)101.02.0三、项目研究过程与资料查阅情况几种药用植物内生真菌抗真菌活性的初步研究 李桂玲 王建锋 黄耀坚 郑忠辉 苏文金 微生物学通报 2001 28 (6)抗真菌蛋白Rs-AFPs生物学特性的研究 胡新文 郭建春 郑学勤 热带作物学报 1998 19 (2) 抗真菌蛋白研究进展 胡明 李晓宇 马平 朱宝成 生物技术通报 2004（3） 药用植物有效成分抗真菌研究进展 骆志成 综述 刘子文 审校 China J Lepr Skin Dis.dec 2001 17（4）植物抗真菌有效成分研究进展 蒋继宏 徐州师范大学学报(自然科学版) 1999 17（3）植物提取物的抗白色念珠菌活性 张胜春摘译 国外医学中医中药分册 1998 20（5）四、项目成果完成形式和价值发表一篇学术论文，目前正在撰写中。拟投中国生物工程杂志或其他相关的学术期刊。五、经费使用情况用于购买实验研究所需的试验材料和各种试剂。（一）试验材料 芭蕉炭疽菌，萝卜种子等（二）试验试剂 sephadex G-50，SDS, Tris等。六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结掌握了从萝卜种子制备Rs-AFPs粗提液的方法，熟悉了凝胶过滤等一系列基本实验操作技术，总蛋白，总活性的测定方法。学会运用琼脂糖扩散法测定测定抗真菌蛋白的生物学活性，以及运用尿素SDS聚丙烯酰胺凝胶电