生物药剂学与药物动力学实验.doc

生物药剂学与药物动力学实验目录一、基本知识与基本技能二、验证性实验实验一 磺胺嘧啶在体小肠吸收实验 实验二 磺胺类药物的组织分布实验实验三 血浆蛋白结合率测定实验四 尿药法测定核黄素片剂药动学参数实验五 卡马西平血药浓度监测实验六 苯酰甲硝唑分散片人体生物等效性试验实验七 TDX监测环孢素A血药浓度三、设计性实验实验一 血药浓度测定与药动学研究实验二 制剂生物利用度实验实验三 阿司匹林缓释片体内外相关性实验实验四 氨茶碱血药浓度的监测和治疗方案设计实验五 重复一点法测定药动学参数四、综合性实验实验一 对乙酰氨基酚溶出度测定及溶出参数的计算实验二 对乙酰氨基酚血药浓度测定与药物动力学研究实验三 阿司匹林肠溶片的血药浓度测定五、附录一、基本知识与基本技能生物药剂学是研究药物及其剂型在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，阐明药物的剂型因素，机体生物因素和药物疗效之间相互关系的一门学科；药物动力学是应用动力学原理与数学处理方法，定量描述药物在体内动态变化规律的学科。生物药剂学与药物动力学是药学专业的一门主要专业课程。使学生在掌握生物药剂学和药物动力学的基本概念、基本理论和研究方法基础上，能初步应用有关知识正确评价药物制剂质量，设计合理的剂型、处方及生产工艺，并为临床合理用药提供科学依据，也能应用药物动力学的原理进行药物制剂生物等效性评价、给药方案设计及临床药物治疗方案的个体化等。实验课是生物药剂学与药物动力学课程中必不可少的重要实践环节。通过实践教学，学习生物药剂学与药物动力学实验的设计及数据的处理方法，熟悉生物样品处理与检测的方法，能进行临床药代动力学实验的设计及数据的处理，掌握实验方法在临床合理用药方案设计中的应用，掌握专业实验技能，培养学生独立思考和独立工作能力以及科学的工作态度和习惯。生物药剂学与药物动力学的实验对象常为动物或人，通常通过给予受试对象药物或制剂后，检测不同时间生物样品中药物与代谢物的浓度变化来了解药物在体内吸收、分布、代谢与排泄规律。因此，生物样品的处理与分析是生物药剂学与药物动力学研究中的重要内容，下面主要就生物样品的前处理、实验方案与数据处理方面的基本知识与技能进行介绍。（一）生物样品收集与处理1.生物样品的收集（1）血样 对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据。由于全血的净化较血浆和血清麻烦，特别是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。因此最常用的生物样品是血浆（plasma)和血清（serum)，测定血中药物浓度通常也是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。一般认为，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。但临床上也有少数药物由于在血细胞中分布较多，需要检测全血中的药物浓度如环孢素A、雷帕霉素等。1）取样：动物实验时，根据动物不同，取样部位各异，如家兔一般可从耳缘静脉多次采血；大鼠可通过眼眶静脉丛或断尾取血，也可由颈动脉插管取血；犬一般从四肢静脉取血；对于病人或健康受试者，通常采集上肢静脉血。采集血样后，应及时分离血浆或血清，并立即进行分析。如不能立即测定时，应完全密塞后冷冻（-20）保存。 2）制备：血浆的制备 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、EDTA-钠等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，上清液即为血浆。肝素最常使用的抗凝剂，常用其钠盐、钾盐，能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。一般lml的全血需加0.10.2mg的肝素，加入血样后立即轻轻振摇，但勿太猛烈，以免导致溶血。实验室肝素化管的制备方法常应用肝素钠注射液2ml加蒸馏水至10ml，摇匀后倒入干净采血管中润过管壁后倒出，烘干即可使用。 血清的制备 血清是在血液中纤维蛋白原等影响下，引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，经离心其量约为全血量的3050。在室温高时，血凝过程进行得很快，宜在血凝后半小时内分离血清。当室温较低时，血凝过程慢，可将血液置37温度下加速血清析出。 （2）唾液 唾液的采集一般在漱口后15min收集，应尽可能在刺激少的安静状态下进行。采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。经离心分离，取上清液作为药物浓度测定的样品。唾液中含有粘蛋白，为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在4以下保存，解冻混匀后再用，否则易产生误差。(3)尿液 尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，也方便，但尿液浓度通常变化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量，这就需要测定在规定时间内的尿液体积及尿药浓度。测定尿中药物的总量时，收集一定时间内（如2h或4h等）排泄的尿液，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄量，计算累积排泄尿量。采集的尿液时，需用量筒准确地测量储尿量，并做好记录。 2.生物样本的前处理 在测定生物样品中药物及其代谢物时，样品的前处理十分重要。除了少数将体液经简单处理后进行直接测定外，一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。生物样品进行前处理的目的主要在于： 药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸形成的葡萄糖醛酸甙等形式存在，需要分离后测定药物及代谢物；生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na、K、X-等无机化合物。其中影响最大的是蛋白质，若用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严重影响分离效果。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必须进行除蛋白等前处理。样品前处理一般包括以下内容：1）样品匀化 对于生物样品，应在测定前混合均匀，以免造成测定误差。可置涡混仪上混匀，血浆样品往复振摇亦可达到匀化目的。 对粪便、肌肉和组织等固体样品也存在匀化问题。对含有不溶性组分的样品(例如组织和粪便)，须将样品进行匀浆处理，以保证样品的均匀性。同时还应注意取样的代表性问题。 2）去蛋白处理 生物样品如血浆、血清等含有大量的蛋白质，它们能结合药物，因此对于某些药物的测定，必须先将与蛋白结合的药物游离后再作进一步处理。加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比通常为1:（13)时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用超速离心机（10 000r/min )离心便可将析出的蛋白质完全沉淀。 加入中性盐 中性盐能置换与蛋白质水合的水，从而使蛋白质发生脱水而析出沉淀。 常用的中性盐：饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常一起，可提高药物的回收率。 加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而析出沉淀。常用的强酸有：三氯醋酸、高氯酸等。但在酸性下易降解的药物不宜用本法去除蛋白。 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuS04、Na2W04、ZnS04等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。3）被测组分的提取 生物样品中被测组分常需提取后才能进行色谱分析，这一步骤包含了样品的净化与浓缩。提取方法和提取条件的选择是分析方法研究的重要内容之一，它与分析方法的选择性、精密度和准确度紧密相关。液-液提取 液-液提取是经典的提取方法之一，它基于被测组分在不相混溶两种溶剂中分配不同。在提取过程中，水相pH是重要参数：一般弱酸性药物可加入一定量的酸，弱碱性药物可加入一定量的碱，使药物以分子状态存在，有利于有机溶剂的提取效果。有时可加入一些强离子的无机盐(如氯化钠)， 利用盐析作用，能促进组分进入有机相。通过选择不同的有机溶剂可提高选择性。一般可选用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、正己烷、甲基叔丁基醚等有机溶剂及其不同比例的混合物进行提取。液-液提取用于水为基质的样品中非极性或弱极性组分的提取，液液提取后有机相可用氮气或空气吹干，残渣可用与色谱方法相适应的溶剂或流动相溶解后进样。 液-液提取有时会发生乳化现象以及被测组分损失。为了防止乳化，可应用较大体积的有机溶剂，避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力而破乳，若已发生严重的乳化现象，可将试管置于冰箱中冷冻破乳。固相分离 固相分离又称为固相提取柱法，其常用的柱填料有吸附剂、高分子大孔树脂、离子交换树脂、键合硅胶等。固相分离有两种实现样品纯化的途径。一种是保留杂质，待测组分不被保留而自然流出或者被洗脱。更为常用的一种途径是先使待测物完全保留在柱上，使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出，然后以小体积溶剂洗脱待测物。键合硅胶固相提取的一般操作步骤如下：以适当强溶剂湿润固相提取填料使其溶剂化；以弱溶剂通常是水或缓冲溶液洗涤填料，使其达到良好的分离状态；将溶于弱溶剂常是缓冲溶液中的样品加到固相提取柱上；以强度适当的弱溶剂，如含有少量甲醇的水或缓冲溶液，洗涤、除去基质或干扰组分；用强度较高的溶剂洗脱待测组分，收集洗脱液，直接或适当浓缩后进行色谱分析。（二）实验设计药物动力学研究分为临床前药物动力学研究和临床药物动力学研究。临床前药动学研究是通过动物体内、体外和人体外的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药物动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点。临床药物动力学研究旨在阐明药物或制剂在人体内的吸收、分布、代谢和排泄的动态变化规律。临床前药动学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要作用。药动学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应的依据；是评价药物制剂特性和质量的重要依据；能为设计和优化临床研究给药方案提供有关参考信息。而通过临床药物动力学研究，可为新药临床试验给药方案的拟订提供实验基础，为新药上市后的临床药物治疗方案制订提供理论依据。 1试验药品 对进行药物动力学研究的试验药品，其基本要求为：质量稳定且与药效学或毒理学研究所用试验药品一致。2实验动物及受试动物数 一般采用成年和健康动物。常用的有犬、小鼠、大鼠、家兔和豚鼠等。选择实验动物的基本原则有：首选动物应与药效学或毒理学研究一致；创新药应选用两种动物或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物，其他类别药物，可选用一种动物进行实验；口服给药一般不宜选用兔等食草类动物。3给药途径和给药剂量 药物动力学研究所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致。口服给药一般在给药前应禁食12小时以上，以排除食物对药物吸收的影响。另外在试验中应注意根据具体情况统一给药后禁食时间，以避免由此带来的数据波动及食物的影响。 药动学研究至少应设三个剂量组，高剂量一般接近于最大耐受量，中、小剂量根据动物有效剂量的上下限范围选取，以了解药物在体内的动力学过程是否有非线性动力学特征。4取样时间点安排 尽量在清醒状态下试验，最好从同一动物多次采样。取样点通常可安排911个点，一般在吸收相至少需要23个采样点；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要46个采样点。整个采样时间至少应持续到35个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/101/20。（三）数据处理药物动力学实验研究后根据获得的浓度时间数据，可依据文献报道的隔室模型数或利用隔室模型判别方法自行进行隔室模型确定，然后根据相应的隔室模型求算基本的药动学参数，药时曲线下面积通过梯形面积法求算：。一般药动学实验后需提供的药动学参数有：静注给药的t1/2、V、 AUC和Cl等；血管外给药的ka、Cmax、tmax、 t1/2 和AUC等。对缓、控释制剂，应根据多次给药稳态时完整给药间隔的血药浓度-时间数据，提供稳态时达峰时间tmax、稳态峰浓度、稳态谷浓度、AUCss、波动度（DF）和稳态平均血药浓度等参数，常与被仿制药或普通制剂比较吸收程度、DF及是否有差异，考察试验制剂是否具有缓、控释特征。二、验证性实验实验一 磺胺嘧啶在体小肠吸收实验一、实验要求1.掌握大鼠在体肠管泵循环法研究吸收的实验方法。2.掌握药物肠管吸收的机理和计算吸收速度常数(ka)、吸收半衰期(t1/2（a）)的方法。 二、实验原理 药物消化道吸收实验方法可分为体外法(in vitro)、在体法(in situ)和体内法(in vivo)等。在体法由于不切断血管和神经，药物透过上皮细胞后即被血液运走，能避免胃内容物排出及消化道固有运动等的生理影响，对溶解药物是一种较好的研究吸收的方法。但本法一般只限于溶解状态药物，并有可能将其他因素引起药物浓度的变化误作为吸收。消化道药物吸收的主要方式为被动扩散。药物服用后，胃肠液中高浓度的药物向细胞内透过，又以相似的方式扩散转运到血液中。这种形式的吸收不消耗能量，其透过速度与膜两侧的浓度差成正比，可用下式表示： （1）式中为分子型药物的透过速度；D为药物在膜内的扩散系数；k为药物在膜水溶液中的分配系数；S为药物扩散的表面积；CGI为消化道内药物浓度；Cp为血液中药物浓度；h为膜的厚度。令DkP，则P为透过常数。一般药物进入循环系统后立即转运至全身各个部位，故药物在吸收部位循环液中的浓度相当低，与胃肠液中药物浓度相比，可忽略不计。若设，式(1)可简化为： （2）式(2)说明药物透过速度属于表观一级速度过程。以消化液中药物量的变化率dX/dt表示透过速度，则： （3）上式积分后两边取常用对数，变为： （4）以小肠内剩余药量的对数lgX对取样时间t作图，可得一条直线，从直线的斜率可求得吸收速度常数ka，其吸收半衰期t1/2（a）为： （5） 在小肠吸收过程中，药物被吸收的同时水分也被吸收，使供试液体积不断减少，所以不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余药量。由于酚红不能被小肠吸收，因此可向供试液中加入一定量的酚红，在间隔一定时间测药物浓度的同时，也测定的浓度，由酚红浓度先计算出不同时间供试液的体积，再根据测定药物的浓度，就可以求出不同时间小肠中剩余的药量或被吸收的药量。三、实验步骤 1试剂的配制 (1)0.1NaNO2溶液：称取NaNO2 0.1g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。 (2)0.5氨基磺酸铵(NH2SO3NH4)溶液：称取氨基磺酸铵0.5g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。 (3)0.1二盐酸萘基乙二胺溶液：称取二盐酸萘基乙二胺0.1g于100m1容量瓶中，加乙醇适量溶解，并用乙醇定容，摇匀。(以上试剂配好后置冰箱中保存。) (4)1mol/L盐酸：取浓盐酸9m1置l00ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。 (5)0.2mol/LNaOH：称取NaOH0.8g加蒸馏水适量溶解后，转移至l00ml容量瓶内定容。 (6)生理盐水：称取NaCl 0.9g置100m1容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。 (7)KrebsRinger试剂(pH7.4)：称取NaCl 7.8g，KCl 0.35g，CaCl20.37g，NaHCO31.37g，NaH2PO4 0.32g，MgCl20.02g，葡萄糖1.4g，加蒸馏水适量使成l000ml。 (8)1戊巴比妥钠溶液：称取戊巴比妥钠1g置100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。 2供试液与酚红液的配制(1)供试液：精密称取磺胺嘧啶(SD)20mg、酚红20mg于1000m1容量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容，摇匀。(2)酚红液：精密称取酚红20mg于1000m1容量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容，摇匀。 3循环实验的操作 (1)蠕动泵流速的调节：选择所需工作方向，按动快、慢档开关，调节流速为5m1/min和2.5m1min。 (2)恒温水浴调节：将水浴温度调节为（370.5）。 (3)供试液的准备：取80m1供试液加入循环装置的烧瓶中，见下图，将烧瓶置恒温水浴中预热至（370.5）。(4)生理盐水的准备：取生理盐水适量，预热至37备用。(5)大鼠麻醉：取实验前禁食一夜、体重约为200g的雄性大鼠一只，按40mgkg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，并固定于固定台上。(6)小肠两端插管：沿大鼠腹部中线打开腹腔(约3cm)，在十二指肠上部和回肠下部各切一小口，插入直径约0.3cm的玻璃管，并用线扎紧。(7)肠管洗涤：用注射器将37的生理盐水缓缓注入肠管，洗净肠管内容物。(8)做成回路：将肠管两端的玻璃管按图所示与胶管连接，做成回路，开动蠕动泵，其流速为5m1/min。(9)取样：以5ml/min流速循环10min后，将流速调节为2.5ml/min，立即自供试液烧瓶中取样两份(1ml和0.5m1各一份)，分别作为SD和酚红零时间样品，另向烧瓶中补加酚红液2ml，其后每隔15min按同法取样及补加酚红液，共取样9次，停止循环。4含量测定(1)标准曲线的制作SD的标准曲线：吸取供试液2、4、6、8、10m1分别置l0ml容量瓶中，加蒸馏水定容，再各精密吸取1ml置l0ml带塞试管中，加入l mol/L盐酸5ml，摇匀，加0.1NaNO2溶液1m1，摇匀，放置3min，加0.5氨基磺酸铵(NH 2SO3NH4)溶液1m1,摇匀，放置3min，最后加1二盐酸萘基乙二胺溶液2m1，摇匀，放置20min，照分光光度法在550nm的波长处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到SD标准曲线方程。在体鼠小肠吸收泵循环实验装置1.供试液烧瓶 2.蠕动泵 3.大鼠酚红的标准曲线：精密称取酚红约25mg置250m1容量瓶中，加蒸馏水定容，分别精密吸取1、2、3、4、5、6m1置10m1容量瓶中，加蒸馏水定容，再分别吸取0.5m1置10m1带塞试管中，加0.2mol/L NaOH 5m1，摇匀。照分光光度法在555nm波长处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到酚红标准曲线方程。(2)样品测定SD的测定：取样品lml置l0ml带塞试管中，加入lmol/L盐酸5m1，摇匀，以下步骤按SD标准曲线项下操作，在550nm的波长处测定吸收度。酚红的测定：取样品0.5ml置10m1带塞试管中，加入0.2molL NaOH 5m1，在555nm波长处测定吸收度。5操作注意 (1)在大鼠麻醉前应做好一切准备工作。如手术器械、水浴温度的调节，试药配制并放在近处，蠕动泵流速调节等。如果蠕动泵上并未标出流速，可用量筒接流出液（蒸馏水）的方式确定流速。 (2)由于小肠很细，小肠两端插上玻璃管后再洗涤非常容易堵塞，防止的方法是先将十二指肠端插上玻璃管，回肠端找好后先用线扎紧(为以后找切口位置)，然后在扎线处切个小口。生理盐水(37)从十二指肠端插管处注入，洗涤内容物至净，再在回肠端切口处插上玻璃管。 (3)插玻璃管时应注意方向，在十二指肠端向下插，回肠端向上插，以构成回路。 (4)SD的测定中，加入氨基磺酸钠后要充分振摇至无气泡发生。(5) SD比色测定空白对照液的制法：取酚红液1ml至10ml带塞试管中，加1mol/L的HCl 1m1，摇匀，以下操作按SD标准曲线制作。(6)酚红比色测定的空白对照液为0.2mol/L NaOH。 四、实验结果1.分别写出SD和酚红的标准曲线回归方程和相关系数。2.SD和酚红样品浓度的计算 根据SD和酚红的标准曲线方程，分别计算出SD和酚红样品的浓度，并填于下表中。大鼠在体小肠吸收量的计算取样时间（h）SDASD浓度酚红A酚红浓度供试液体积剩余药量循环前A0C0A0C0V0=80mlP0=80C00A1C1A1C10.25A2C2A2C20.5A3C3A3C3.tnAnCnAnCn3.不同时间SD剩余量的计算 按上表中公式计算出不同时间的剩余药量，并求剩余药量的对数值。4.ka和t1/2（a）的计算 以剩余药量的对数对相应的时间作图，可得一条直线，由直线的斜率求出ka，并计算t1/2（a）。五、问题与讨论1.在体吸收试验方法的特点是什么?影响试验结果的主要因素有哪些？2.供试液中为什么要加酚红?实验二 磺胺类药物的组织分布实验 一、实验要求1.了解磺胺类药物紫外分光光度法测定原理2.通过实验了解药物的体内分布二、实验原理药物在体内分布是指药物经吸收进入体循环后，通过血液和各组织的膜屏障转运至各组织的动态过程。药物分布决定于组织的血流量、药物对脂膜的扩散速度及药物与蛋白质的结合程度。药物要分布到药理作用靶部位才能发挥药效药物。但如果药物在某组织出现蓄积则可能产生毒性作用，所以一般药物的分布可以为药效学和安全性评价提供重要信息。通过组织分布研究，可以了解试验药物在实验动物体内的分布规律、主要蓄积器官或组织及蓄积程度等。组织分布实验通常通过给药后，于一定时间取出各组织或器官，经前处理后，用适宜的方法测定其中药物的含量。 磺胺噻唑钠为对氨基苯类化合物，在酸性溶液中可使苯环上的氨基(NH2)离子化生成铵类化合物(NH3+)，进而与亚硝酸钠起重氮反应，产生重氮盐。此重氮盐可在酸性溶液中与显色剂胺类化合物(N-1-萘乙二胺)起偶联反应，形成紫红色的偶氮化合物。利用该呈色反应，采用分光光度法可测定出给药后不同时间不同组织中磺胺类药物的浓度。三、实验步骤1.标准曲线的制作取大鼠3只，断颈处死，收集血液至肝素化离心管中，并立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量，按16加生理盐水（脑组织按13）置玻璃匀浆器中进行研磨，研磨后将匀浆液倒入离心管中，3 000r/min离心10min，取上清液1ml按11加20%三氯醋酸沉淀蛋白，3 000r/min离心10min，取上清液待用。血液经3 000离心10min后取上层血浆待测精密吸取沉淀蛋白后不同组织的上清液2ml（以2ml蒸馏水代替上清液，其他操作同样品处理，为空白对照）各6份于干净试管中，加入磺胺噻唑钠标准溶液使肝脏、肾脏组织液中药物浓度为0.1、0.25、0.5、1、5、10mg/ml，脑组织液中药物浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1、5 mg/ml，再各加入0.5%亚硝酸钠溶液0.05ml，混合，静置3min后，各加入0.5%氨磺酸铵溶液1ml，摇匀2min后加显色剂（0.05二盐酸N-1-萘乙二胺）2ml，摇匀。5min后用分光光度计于540nm处测定吸收度。2.组织分布实验取大鼠3只称重，按100mg/kg尾静脉注射10磺胺噻唑钠注射液。于给药后5、20、120min时，处死大鼠，立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量。余下操作除不加标准液外，其他同标准曲线制作项下处理后，测定不同时间、不同组织中的药物吸收度。代入相应标准曲线，计算不同时间中各组织中ST的浓度。四、实验结果 1.各组织标准曲线方程 2.各组织中药物浓度组织时间（min）A浓度C(mg/ml)组织中药物量（mg/g）肝520120肾520120心脏520120脑520120血520120五、问题与讨论1.磺胺噻唑钠在大鼠肝脏、肾脏、心脏及脑组织的分布有何异同？2.组织分布研究有何临床意义？实验三 血浆蛋白结合率测定一、实验要求1.掌握平衡透析法测定血浆蛋白结合率的原理和方法。2.掌握血浆蛋白结合率在临床药动学中的意义。二、实验原理药物进入血液后一部分与血浆蛋白结合，称之为结合型药物，未结合的药物称之为游离型药物。通常结合型与游离型处于动态平衡状态。药物与血浆蛋白结合符合质量作用定律，即： D+P PD (1) (2)式中D为游离药物浓度，P为血浆蛋白浓度，PD为结合型药物浓度，k1和k2分别表示结合常数和解离常数。K为平衡时的亲和力常数。在实际工作中通常用血浆蛋白结合率来反映药物与血浆蛋白亲和力的大小， 即： 血浆蛋白结合率是反映药物分布的重要参数。常用的测定方法有平衡透析法(equilibr