呋喃它酮检测方法.doc

1 设备和材料1.1设备1.1.1 酶标仪（检测波长450 nm，参考波长630 nm）1.1.2 均质器1.1.3 天平，精度0.01 g1.1.4 旋涡振荡器1.1.5 温箱（可控温度：25、37）1.1.6 离心机1.1.7 氮吹仪1.1.8 微量移液器1.1.9 计时器1.2 试剂1.1.10 1 M HCl：量取8.6 mL浓盐酸，加去离子水定容至100 mL。1.1.11 N,N-二甲基甲酰胺（分析纯）1.1.12 0.1 M K2HPO4：称取11.4 g K2HPO43H2O，加400 mL去离子水溶解并定容至500 mL。缓冲溶液：500 mL 0.1 M K2HPO4溶液中加入100 g NaCl，充分溶解备用。1.1.13 1 M NaOH：称取4 g NaOH，用去离子水溶解并定容至 100 mL。1.1.14 乙酸乙酯（分析纯）1.1.15 正己烷（分析纯）2 贮存2.1.1 试剂盒贮存于28，切勿冷冻。2.1.2 未使用完的微孔板条应密封，28保存。3 注意事项3.1.1 使用试剂盒前仔细阅读说明书。3.1.2 不要使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。3.1.3 试剂盒使用前，将试剂盒内各组份置于实验台上，待其恢复至室温（252）（提示：约2 h），方可使用。3.1.4 实验前，应预先开启生化培养箱调至所需温度，并检查生化培养箱温度是否正常。3.1.5 应避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。3.1.6 各试剂在使用前请摇匀。3.1.7 提取药物时，涡动或摇床振摇应尽量充分；加入样品稀释液后（见8.1.9和8.2.9）应低速涡动1 min，以上操作将直接影响检测结果！3.1.8 检测时，应尽量检测板孔上方空气流动。3.1.9 终止液中含有2 M硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。3.1.10 不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。3.1.11 混合试剂时应避免出现气泡。3.1.12 使用后请立即将试剂放回 28保存。4 工作液准备4.1.1 50 mM邻硝基苯甲醛：向装有75.55 mg邻硝基苯甲醛的试剂瓶中加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度为50 mM。4.1.2 样品稀释液：用去离子水按1:4（1份浓缩液+3份去离子水）稀释。4.1.3 洗涤工作液：用去离子水按1:20（1份浓缩液+19份去离子水）稀释。4.1.4 样品前处理4.2 组织（猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉）4.2.1 准确称取10.01 g均质后的组织样品于50 mL离心管中；4.2.2 依次加入4 mL去离子水、 0.5 mL 1 M HCl、80 L 50 mM邻硝基苯甲醛（见7.1），充分涡动至组织分散；4.2.3 37 温箱孵育16 h；4.2.4 依次加入5 mL缓冲溶液（见4.2.34.2.4）、400 L 1 M NaOH和6 mL乙酸乙酯；4.2.5 室温（252）下，剧烈涡动1 min（或摇床300 rpm振摇 10 min）；4.2.6 4000 g以上，离心10 min；4.2.7 取3 mL上清于新的离心管中；4.2.8 50-60水浴中，氮气吹干；4.2.9 加入2 mL正己烷，充分涡动10 s，再加入1 mL样品稀释液，低速涡动1min；4.2.10 4000 g以上，离心5 min；注意事项：高脂肪组织易发生乳化，可根据情况加大正己烷用量；离心后如仍有乳化现象，可于80水浴加热5 min，并再次离心。4.2.11 完全弃去上层正己烷及中间杂质；4.2.12 取50 L进行检测。4.3 蜂蜜（原蜜、成品蜜）4.3.1 准确称取10.01 g蜂蜜样品于50 mL离心管中；4.3.2 依次加入10 mL去离子水、 0.5 mL 1 M HCl、80 L 50 mM邻硝基苯甲醛（见7.1），充分涡动至蜂蜜分散（注意：涡动须充分，使蜂蜜完全溶解！）；4.3.3 37 温箱孵育16 h；4.3.4 依次加入5 mL缓冲溶液（见4.2.34.2.4）、400 L 1 M NaOH和6 mL乙酸乙酯；4.3.5 室温（252）下，剧烈涡动1 min（或摇床300 rpm振摇 10 min）；4.3.6 4000 g以上，离心10 min；取3 mL上清于新的离心管中（注意：吸取时一定要小心，避免吸到下层杂质，否则将影响检测结果！）；4.3.7 50-60水浴中，氮气吹干；4.3.8 加入3mL正己烷，充分涡动 10 s，再加入1 mL样品稀释液，低速涡动1 min；4.3.9 4000 g以上，离心5 min；4.3.10 完全弃去上层正己烷及中间杂质；4.3.11 取50 L进行检测。5 检测5.1.1 将所需的酶标板条插入酶标板架上，未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存于2-8环境中，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做平行实验；5.1.2 将50 L各标准品工作液/样品溶液分别加入对应的标准品/样品孔中；5.1.3 在每个板孔中加入50 L呋喃它酮代谢物酶结合物；5.1.4 盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板 10 s，充分混匀，室温下（25 2），避光反应30 min；5.1.5 揭开盖板膜；5.1.6 倒掉板孔中液体，在每孔加入 260 L洗涤工作液，浸泡30 s；5.1.7 再重复上一步骤3次；5.1.8 倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；5.1.9 立即在每孔中加入100 LA、B混合液（注意：底物A液、底物B液按体积1:1混合，必须充分混匀，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌试剂）；5.1.10 盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板 10 s，充分混匀，室温下（25 2），避光反应1520 min；5.1.11 揭开盖板膜，在各板孔中加入 50 L终止液轻轻振荡酶标板 10 s，充分混匀；5.1.12 用酶标仪在双波长450 nm、 630 nm下检测吸光度，结果在终止后5 min内读取。6 计算6.1.1 各标准品（或样品）的平均吸光度值，除以零标（浓度为0 ppb的标准品）吸光度值，乘以100，可以得到各标准品对应的吸光度的百分比：6.1.26.1.3 将各标准品所得值输入半对数系统中，对应各标准品浓度可以拟合标准曲线，请参见质检报告。6.1.4 将样品吸光度的百分比代入标准曲线，可得出样品对应的浓度，再乘以相应样品的稀释倍数，方得样品中实际药物含量。6.1.5 按照本说明书的前处理方法，各样品稀释系数如下：组织（猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉）、蜂蜜27 特异性7.1.1 呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确定的，结果如下：药物交叉反应率（%）NP-AMOZ100.0AMOZ0.1NP-SEM0.1SEM0.1NP-AOZ0.1AOZ0.1NP-AHD0.1AHD0.1注: AMOZ-呋喃它酮代谢物；SEM-呋喃西林代谢物；AOZ-呋喃唑酮代谢物；AHD-呋喃妥因代谢物。8 试剂盒参数8.1.1 本试剂盒灵敏度0.05 ppb，标准曲线范围为0.05 ppb5.4 ppb。8.1.2 B0吸光度最佳值应大于0.8。8.1.3 试剂盒吸光度板内