显微操作技术(全面)

显微操作技术,显微操作技术(micromanipulationtechnique)是指在高倍复式显微镜下利用显微操作器(micrcmanipulator)进行细胞或早期胚胎操作的一种方法,显微操作器用以控制显微注射针或吸管（固定针管）在显微镜视野内移动的、精确的机械装置。一般装在显微镜载物台的两侧也可装在显微镜的前面或一侧。,显微操作仪,显微操作技术包括,细胞拆合：把完整细胞的细胞核与细胞质用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的生物个体。细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，在融合介质作用下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。胚胎工程：显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等,细胞核移植技术已有几十年的历史,Gordon等人(1962)对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作并取得了丰硕成果近年来国内外又相继获得哺乳动物卵核移殖的后代。显微注射技术的应用也很广泛1980年,Gordon等人首次将重组的病毒DNA用显微注射法注入小鼠受精卵的原核中，在78只出生鼠中通过Southern杂交发现3只携带有注射的DNA这是通过原核显微注射法首次获得的转基因小鼠显微切割技术则用于胚胎和染色体的显微切割等。显微操作技术已成为细胞遗传学、生化细胞学、胚胎发育以及基因工程等研究中的重要技术方法,显微工具的制作,一、持卵针持卵针管是在显微注射时用来固定胚胎或卵的工具由毛细玻璃管拉制而成。将长7cm、直径1.0-1.25mm的毛细玻璃管洗净、烤干后在拉针器上拉成细针状。在外径100-120微米的部位用玻璃刀断成平口用加热的白金丝靠近平口的端部钝化并缩小至所需口径一般用于小鼠卵的管口直径为2030微米,兔卵者为5070微米,在使用前把针管在酒精灯火焰上加工成下图所示的形状。,二、注射针将外径lmm,内径0.8mm的毛细玻管固定在拉针器上。调好拉力强度和电热丝温度，即可拉针。再将拉好的针在磨针器上磨出一45斜口。也可用单面刀片在橡皮垫上切成带斜面的针尖，然后在显微工具制作器(microforge)上加工针尖部，使其锐利、光滑，便于刺入细胞。用于细胞注射的针口直径为1013微米。DNA注射者的口径不足l微米,显微镜下观察不到是否开口，只有试注射才可确定是否适用。一般DNA注射针拉制后直接使用，不需再处理，因为在磨针器上加工会造成较大的口径而不易控制注射量。且每次注射后，因压力降低、产生回流，使DNA浓度降低。,三、微型吸管微型吸管主要用于移植细胞核，要求管口表面平滑无损，口径要略大于细胞核而又小于单个细胞。制作过程为将直径2mm,壁厚0.05mm,长10cm的毛细玻璃管固定在拉针器上，调好拉力强度和电热丝温度，拉成微管。如热度过高，拉成的吸管没有开口。这时则应在显微工具制作器上再加工成口径合适的微型吸管，若无拉针器和显微工具制作器也可用手工操作，在酒精灯上将毛细管加热拉成吸管。,四、移卵针取外径I.5mm,长lOOmm的毛细玻管，在酒精灯上加热后用手拉出一段内径为180微米的细管，用砂轮断成平口，再在酒精灯上进行钝化以免移卵时损伤子宫壁。五、玻璃微针将直径35mm的玻棒在酒精灯上加热拉制成直径0.lmm的玻璃丝，然后再拉成玻璃微针。玻璃棒都分作为柄用，也可装到解剖针柄上使用。,第二节细胞重组,2.1胞质杂种2.2微细胞核移植2.3核移植2.4细胞重建,2.1胞质杂种,胞质体（cytoplast）：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞，由细胞松弛素B处理后，经离心得到。1972年，Prescott借助细胞松弛素的和高速离心得到。核体（karyoplast）：由胞质体分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜的结构。胞质杂种细胞：将胞质体和另一完整细胞融合得到的细胞。杂种细胞：核体与完整细胞融合。重组细胞：核体与另一种细胞的胞质体融合。,利用细胞融合技术得到的重组细胞,1、2、3亲本细胞4、6核体5、7胞质体8、9杂种细胞10重组细胞11胞质杂种细胞PEG介导HAT培养基筛选,鉴别与意义,利用双重标记法鉴别杂种细胞的真伪，可以采用两个具有不同缺陷型的细胞作标志，或用3H胸腺嘧啶核苷作核标记，并使其吞入不同颗粒的乳胶作为胞质标志，或者用3H亮氨酸等标记氨基酸作为胞质标记，也可用红绿荧光的聚乙烯颗粒标记重组细胞。意义：胞质杂种细胞是不同种系之间的一种真正的新型细胞，在适宜的条件下能成功的生存下去，它在物种的品种改良、医学及农业的各个方面将产生重大的影响。,2.2微细胞核移植,微细胞：只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。利用秋水仙素先将细胞阻断在染色体中期，然后培养，再用细胞松弛素B处理得到。以微细胞作供体，通过与遗传性完整的受体细胞融合，可以将微细胞内所含有的几条染色体转移到受体细胞中去。,微细胞杂种细胞的制作过程,2.3细胞核移植,核移植起始于用微吸管对阿米巴等原生动物进行的核操作。在1952年，美国人罗伯特布里格斯和TJ金，首先利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术。由于两栖类的蛙卵数量较多，体积较大，容易获得，操作方便。19581962年，英国剑桥大学的约翰格登教授和麦金尼尔利用瓜蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲瓜蟾。,非洲爪蟾制作,哺乳动物核移植,，哺乳类的移核实验必须在显微操作仪下才能进行。最早用来做移核试验的哺乳动物是小鼠。1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。1981年1月，美国科学杂志封面刊登3只小鼠的照片，他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将胚胎植入同步孕鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。,核移植小鼠,第三节胚胎显微操作技术,3.1胚胎移殖,胚胎移植（embryotransfer）：将动物的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。,.下2,.,提供胚胎的个体为“供体”，接受胚胎的个体为“受体”，不管供体还是受体动物都应为雌性个体。,优势(意义),充分发挥雌性个体的繁殖潜力缩短供体本身的繁殖周期保持供体优良特性大规模繁殖节约成本费用可用于保护珍稀动物,.,.,在20世纪60年代以来，对家畜胚胎的采取、保存、移植等技术环节进行了大量的试验研究工作，取得不少进展。20世纪70年代以后，胚胎的移植技术可以说发展到在畜牧生产中实际应用的阶段。近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。,(二)胚胎移植的基本原则,1.胚胎移植前后所处环境的同一性,（）供体和受体在分类学上的相同属性（）动物生理上的一致性（）动物解剖部位的一致性,2.胚胎发育的期限,3.胚胎的质量,胚胎移植的实质,胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换，而胚胎本身的遗传物质并不发生改变，因此各种性状均能保持其原来的优良特性。,为什么胚胎移植能成功?,移动到任何一头动物子宫内都能发育吗?同种动物发情排卵后,在一段时间内供体受体具有相同的生理环境为什么能收集到胚胎?早期胚胎一定时间内处于游离状态供体和受体会不会发生排斥/同种动物之间基本上不排斥为什么移植的胚胎能保留供体双亲的特性?胚胎虽然与受体有生理和组织上的联系,但遗传特性不受受体的影响,.,生理学基础,胚胎移植的技术程序,胚胎移植时，希望一次从供体母畜得到多数胚胎，所以要进行超数排卵处理，同时，胚胎移植成功的根本条件是供体和受体必须同时发情，故需人为控制供受体的发情时间，进行同期化处理。,流程图,对供体受体的选择和处理配种或人工授精对胚胎的收集检查培养保存移植胚胎移植后检查,(三)胚胎移植应具备的基本条件,1.胚胎来源,2.技术条件,3.受体母畜,（五）胚胎的检查,收集到的冲洗液，需静置10min。待胚胎下沉后，移去上层液，再放于解剖镜下，检查胚胎数量和发育情况。正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）一般外形整齐清晰，大小较一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚胎日龄相一致。,（六）胚胎的保存和培养,保存是使胚胎在体外一定条件下（降温）停止发育，延长其在体外的生存时间，当需要时，升温后进行移植。培养则是在体温条件下，于培养液中，使之继续发育。,（七）胚胎的移植,胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等大动物。,（八）供体和受体的术后观察,对术后的供体和受体不但要求注意它们的健康情况，同时要留心观察它们在预定的时间是否发情。供体在下次发情时即可照常配种，或经过二、三个月再重复作为供体，收集胚胎。受体母畜术后如发情则说明未受胎，移植失败。,第四节克隆技术,克隆（clongning）是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。哺乳动物的克隆技术包括胚胎分割和细胞移植两种。,一、胚胎分割,胚胎分割（embryosplitting）是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。,（一）发展简介,Spemann在1904年最先进行蛙类2-细胞胚胎的分割实验，并获得同卵双生后代。1970年，Mullen等通过分离小鼠2-细胞胚胎卵裂球，获得同卵双生后代。1979年Willadsen和Meineck-Tillman等成功地进行了绵羊早期胚胎的分割。20世纪80年代以后，哺乳动物胚胎分割技术发展迅速，Willadsen等在总结前人经验的基础上，建立了系统分割方法，并运用这种方法获得绵羊的四分之一和八分之一胚胎后代和牛的四分之一胚胎后代。,（二）胚胎切割技术,1.切割器具的准备胚胎分割需要的器械有体视显微镜，倒置显微镜和显微操作仪。在进行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割针，固定管要求末端钝圆，外径与所固定胚胎直径相近，内径一般为2030m。切割针目前有玻璃针和微刀两种，玻璃针一般用实心玻璃拉成，微刀是用锋利的金属刀片与微细玻璃棒粘在一起制成。,2.胚胎预处理,为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。,3.胚胎分割,在进行胚胎切割时，先将发育良好的胚胎移入含有操作液滴的培养皿中，操作液常用杜氏磷酸缓冲液，然后在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎一分为二。,不同阶段的胚胎，切割方法略有差异：（）桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分卵裂球，放入另一空透明带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的胚胎。（）桑椹胚和囊胚的分割对于这一阶段的胚胎，通常采用直接切割法。操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给受体。,4.分割胚的培养,为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。,5.分割胚胎的保存和移植,胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。,（三）胚胎分割技术的进展,哺乳动物的胚胎分割技术在近20年取得了较大进展，主要表现为操作方法趋于简化，效率提高。在牛的胚胎移植生产中，胚胎分割已用于提高胚胎移植的总受胎率和克服异性孪生不育。此外，胚胎分割取样已用于胚胎的性别鉴定和转基因阳性胚胎的早期选择。,（四）胚胎分割目前存在的问题,1.初生重低2.遗传一致性不同3.同卵多胎的局限性,二、单个卵裂球培养,单个卵裂的分离培养实质是胚胎分割的一种特殊形式。它是把哺乳动物的早期胚胎分离成单个卵裂球，再把卵裂球单独培养为正常胚胎，然后移植给受体得到克隆后代。卵裂球的分离有两种方式，一是通过机械切割透明带，吸出卵裂球，另一种方式是用蛋白酶溶解透明带，再用细管吹打使胚胎卵裂球分离。卵裂球可放入空透明带中或者直接裸露培养。,三、胚胎细胞核移植,胚胎细胞核移植（embryoniccellnucleartransplantation）又称胚胎克隆，它是通过显微操作将早期胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术。通常把提供细胞核的胚胎称核供体，接受细胞核的称受体。,多莉的诞生,克隆步骤上,克隆步骤下,克隆动物成功与否的关键性问题,首先是核移植过程中要分离得到供体细胞和作为受体细胞的卵细胞。其次要取处在适当发育阶段及细胞周期的受体和供体细胞，受体细胞和供体细胞处于细胞周期中的同一时期，核移植成功的几率最大。受体细胞在细胞周期中所处的时间对转核实验成功与否的影响要大于供体细胞所处的时间的影响，一般取G2期进行核移植的效果都较好。另外，细胞诱导分裂成熟的因子（MPF）的活性有关。,克隆的伦理,克隆羊的诞生也从理论上，表明了人类可以自身进行无性繁殖的可能性。如果克隆技术应用于人类，必将对人类社会的基本组织单位家庭产生很大的冲击，同时也一定会直接威胁人类社会现有的法律、伦理和道德。多个国家政府已经明确宣布政府科研基金决不会支持任何将克隆技术应用于人类的研究。,第五节干细胞,干细胞是一种具有多项分化潜能和自我复制、更新能力的原始未分化细胞，是形成哺乳类各种组织器官的祖宗细胞。,根据来源和个体发育过程中先后次序不同，干细胞可分为：胚胎干细胞和成体干细胞组织干细胞。,分类,全能干细胞（胚胎干细胞）桑椹胚及以前（如受精卵）由内细胞团细胞、原始性腺细胞分离出来能发育成完