鼠疫实验室检测技术ppt课件

.,鼠疫实验室检测技术,.,鼠疫实验室检测,针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营养需求、毒素检测、毒力测定等。针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫菌全基因组测定；插入序列的检测。,.,一、鼠疫菌菌体形态检查,典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长12m，宽0.50.7m,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌，对于鉴别杂菌污染材料极有价值。鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）,.,鼠疫菌染色检查(脏器压印片),美兰染色,革兰氏染色,.,鼠疫菌染色,鼠疫菌涂片的革兰氏染色,.,鼠疫菌染色检查,Waysonstain(魏申氏染色)呈现的两极浓染特征,荚膜染色墨汁负染色,.,二、鼠疫菌的培养特性,鼠疫菌是典型的异养菌。鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28，最适pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为100150mV，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落，一般2448h形成肉眼可见的小菌落。强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37缺钙条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边。,.,鼠疫噬菌体试验,在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线自然流下，置20培养24h,有明显的噬菌带。在1822鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右即可获得结果。分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫菌。,.,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,典型鼠疫菌菌落形态,噬菌带,.,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,鼠疫菌培养特征,鼠疫噬菌体试验,.,三、鼠疫F1抗原、抗体检测,鼠疫F1抗原检测1.反向血球凝集试验(RIHA)2.酶联免疫吸附试验(ELISA)3.胶体金免疫层析法(GICA)4.免疫荧光技术(IFT),鼠疫F1抗体检测1.间接血球凝集试验(IHA)2.酶联免疫吸附试验(ELISA)3.胶体金免疫层析法(GICA),.,间接红血球凝集试验(IHA),鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试验方法和结果判定均为常规操作。IHA微量法结果：,.,反向血球凝集试验(RIHA),用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。RIHA微量法结果：,.,酶联免疫吸附试验(ELISA),测抗体.双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，加入待测标本28反应1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液(2mol/L硫酸)。间接法：已知F1抗原包被反应板，加标本37反应1h洗板，加入酶标二抗37反应1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反应30min显色后加终止液。用肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A),测抗原双单抗夹心法：F1-McAb包被反应板，加入标本28反应1.5h洗板，加入HRP-F1McAb28反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液。双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫血清特异性抗体(F1Ab)包被反应板，加标本37反应1h洗板，加小鼠F1McAb液37静置1h洗板，加HRP标记的羊抗小鼠IgG37反应1h洗板,加底物OPD蔽光反应30min显色，加终止液。肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A),.,胶体金免疫层析法(GICA),检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以GICA广泛用于实践。基本原理均为夹心法。双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗(F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另一株单抗(金标-F1McAb)显色。双抗原夹心法测抗体：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+标本中待测抗体(F1Ab)+金标记的F1抗原(金标-F1Ag)显色。夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫F1抗原标本中的相应抗体金标记的SPA显色。,.,GICA双抗体夹心法测抗原,G区：金标特异性抗体(鼠型F1McAb),C区：羊抗小鼠Ig,T区：特异性单克隆抗体(F1McAb),吸水纸,标本,.,免疫荧光技术(IFT),标记物-荧光素(如异硫氰荧光素FITC)荧光素标记抗体检测相应抗原-直接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。方法：固定好的玻片标本用1%牛血清PBS浸洗5分钟，流水冲洗。用FITC-FIMcAb适量（0.2ml）荧光染色，室温作用30分钟，流水冲洗。干燥，荧光显微镜油镜观察，鼠疫菌染上翠绿色荧光,Yersiniapestis免疫荧光染色Fluorescenceantibodypositivityisseenasbright,intensegreenstainingaroundthebacterialcell,.,鼠疫菌特异性基因片断检测PCR,目标基因：鼠疫菌的fra和pla特异性基因片段引物序列和扩增产物的长度目标基因引物序列产物长度fra1F5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3249bp1R5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3pla2F5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3456bp2R5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3内部对照：以鼠疫菌EV株DNA为模板，采用上述f1引物扩增出fra基因249bp片段，再以16SrRNA基因引物：F5-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3R5-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3扩增出16SrRNA基因396bp片段加载体重组而成，产物长度645bp，使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。应用多重PCR方法来检测鼠疫菌，所选取的扩增区域都为鼠疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具有较高特异性。,.,鼠疫PCR反应体系,PCR反应体系(总量25l)采用其它总量时，下列配方按比例改变。无菌去离子水13.5l10反应缓冲液2.5l4dNTP混合物（每种2.5mM）2l引物（1F、1R、2F、2R）各1l内部对照模板(IC)1l待测标本1lTaqDNA聚合酶1l,.,鼠疫PCR,反应条件(扩增)：预变性955min，1个循环；然后951min，551min，721min，30个循环；最后725min。共1小时40分。电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂5l，混均短暂离心。胶体的每一孔中加入上述处理的反应产物8l，在80-100V(不超过5V/cm)电压下TBE缓冲液中电泳约1小时。凝胶成像仪读取结果并照相。,.,多重PCR扩增结果,鼠疫PCR内部对照质粒与不同浓度EV菌PCR扩增结果,鼠疫多重PCR多重PCR扩增结果,.,鼠疫菌质粒检测,鼠疫菌的三个寻常质粒：pPCP16Mda(9.5kb)编码鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞浆素原活化因子；pCD145Mda(70kb)编码型分泌系统的质粒，即主要编码低钙反应并表达LrcV及一系列耶尔森菌特有的Yops；pMT165Mda(100kb)编码F1抗原和鼠毒素。91001全基因组测序新发现的质粒：pCRY长度21742bp，具有独立复制能力，有一群编码型分泌系统的基因。质粒DNA提取-碱裂解法和热裂解法质粒电泳分析,.,鼠疫菌研究进展,传统的病原体分类(classification)和鉴定(identification)方法:病原体的形态特征生长特征(培养特性)血清学反应生化特征基因分类(Genotyping)和鉴定方法:多是基于PCR和核酸凝胶电泳技术，通过电泳条带模式比较分析，揭示基因组成间差异。AFLP扩增片段长度多态性RFLP限制性片段长度多态性PFGE