第六章-工业微生物育种.ppt

第六章工业微生物诱变育种,诱变育种,是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变频率显著提高的基础上，从中挑选少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1单位,从青霉素产量看诱变育种,诱变育种目的,提高有效产物的产量改变菌种特性，提高产品质量简化工艺条件开发新品种,诱变育种的过程,选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,一、诱变育种的实验准备,（一）诱变前对出发菌株的了解1、区分不同菌落类型2、出现不同菌落类型原因,（二）全面了解菌种特性和生产性能的关系（三）了解影响菌种生长发育的主要因素1、培养基2、斜面培养基的制备技术3、接种量4、温度5、湿度6、药品和原材料质量,（四）了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系（五）建立一个准确、简便、快速检测产物的方法（六）研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件,二、诱变育种的步骤及方法,（一）选择合适的出发菌株1、对一般菌株的要求野生菌株对诱变剂敏感最好选用来自生产中的自发突变菌株。具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等）；可选用已发生过其他突变的菌株。,2、选择具有一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株3、选择纯种做出发菌株4、选择出发菌株应考虑其稳定性5、连续诱变育种过程中如何选择出发菌株6、采用多出发菌株7、了解菌种代谢特点,（三）制备待处理的菌悬液,1、选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）目的：使每个细胞能均匀接触诱变剂；减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）同步培养（生理状态一致）菌龄：对诱变剂最敏感时期营养细胞：对数期孢子或芽孢：萌发前期,菌悬液的制备方法物理诱变：生理盐水配制化学诱变：缓冲液配制菌悬液的浓度酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL细菌，放线菌孢子：108个/mL不产孢子真菌：采用幼龄菌丝，三种方法制。制备原生质体作为诱变材料。,诱变剂的选择（高效，简便）,物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。(NTG超诱变剂）,UV是最常用的一种诱变剂,（四）诱变剂的选择及处理方法,2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂3、参考出发菌株原有的诱变谱系来选择诱变剂,常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）最适剂量：既能扩大变异幅度，又能使变异向正突变范围移动的剂量。(P103)突变率随剂量的增加而提高，达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。常采用相对杀菌率为70-75%。,4.剂量的选择,（五）诱变处理方法,单因素处理或多因素的复合处理：同一诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的同时使用；紫外线光复活交替处理诱变剂处理时间与诱变效应的关系,（六）影响突变率的因素1、菌种遗传特性不同2、菌体细胞壁结构不同3、环境条件的影响1）诱变前预培养2）温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响3）菌落密度效应,表型延迟（phenotypiclag）：表型的改变落后于基因型改变的现象.分离性延迟：突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。生理性延迟：由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。,分离性延迟的原因:对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。,生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。,（四）中间培养（CM，培养过夜）,目的：克服表型延迟,初筛复筛,1.初筛（以量为主）,（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性,（2）根据平板颜色反应直接挑选透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）,方法需简便、快速,2步,（五）突变株的筛选,（3）浓度梯度法（4）影印平板法（5）琼脂块大通量筛选方法,2.复筛（以质为主，定量测定）（1）摇瓶培养，直接检测所需产物（2）产物活性检查琼脂平板活性圈法纸片法琼脂薄层纸片法（3）复筛数据的调整菌落、菌体形态观察进一步筛选突变株；培养基和条件的调整；菌株纯度及遗传特性进行研究,二、诱变育种的基本原则,选择简便有效的诱变剂；挑选优良的出发菌株；处理单细胞或单孢子悬液；选用最适的诱变剂量；充分利用复合处理的协同效应；利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；设计高效筛选方案；创造新型筛选方法。,1.抗性突变株的筛选(1)抗终代谢物结构类似物突变株的筛选用途：筛选相应代谢物的高产菌株,三、几种重要突变株的筛选方法,结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。,（2）抗药性突变株用途：筛选相应药物(抗生素)的高产菌株或遗传标记制作筛选的方法:a.高于临界浓度的平板进行分离；b.梯度平板法,敏感菌苔,抗性菌落,加入含异烟肼的上层,加入不含异烟肼的底层,（1）几个概念：,基本培养基（MM）-：某野生型能生长的最低成分的组合培养基。,完全培养基（CM）+：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基,补充培养基（SM）A:-+A，B:-+B相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基,2.营养缺陷型突变株的筛选,三种遗传型：,野生型（wildtype）从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。A+B+,可在-生长。,营养缺陷型（auxotroph）野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。A+B-：能在+、B生长A-B+：能在+、A生长A-B-：能在+生长,原养型（prototroph）营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求A+B+,可在-生长,（2）筛选步骤（5步）,诱变处理,中间培养,淘汰野生型,检出缺陷型,鉴定缺陷型,中间培养,CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。,淘汰野生型,即浓缩缺陷型，以提高检出率,饥饿培养（无N）MM612h2N培养(2N)MM12h加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜,抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）,方法,营养缺陷型的检出,方法,逐个检出法夹层培养法限量补充培养法影印平板法,营养缺陷型的鉴定,分两步：,a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种维生素,或哪一种碱基),具体操作:一般采用“滤纸片法”,生长谱法：快速，直观,a.不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液b.维生素混合液c.0.1%碱水解酵母核酸液,a,b,c,三大类营养要求的鉴定,以氨基酸缺陷为例进行说明将21种氨基酸按右表分为6组特点：每2组只有一种共同物质,单一营养物质要求的鉴定：,1,3,5,2,4,6,（3）营养缺陷型的用途生产菌(氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)；研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。,1.从生产中选育2.定向培育优良品种一般指用特定因素长期处理微生物群体，同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。例：卡介苗（牛型结核分枝杆菌的减毒活菌苗）,三、自发突变与育种,思考题,1、诱变剂主要有哪三类？2、简述紫外线照射诱变育种的原理、方法和基本步骤。3、化学诱变剂主要有哪些种类？4、烷化剂的作用机制是什么？5、简述亚硝基胍诱变育种的原理、过程和安全注意事项。6、生物诱变剂按照诱变方式主要分为哪三类?为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?,一、电离辐射致DNA的损伤,电离辐射损伤DNA途径:直接作用指射线直接作用于DNA分子，通过电离和激发使DNA受到损伤。间接作用指射线与DNA周围其它原子或分子特别是水分子作用，产生具有很高活性的自由基（如OH，H和eaq-）进而损伤DNA。,DNA链断裂单链断裂（SSB）双链断裂（DSB）DNA交联DNA链交联DNA-蛋白质交联DNA二级和三级结构的变化其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初损伤，而非重接性的DSB则被认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤。,二、电离辐射致DNA分子的变化,（一）DNA链断裂单链断裂：DNA双螺旋结构中一条链断裂双链断裂：DNA双螺旋结构中两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂,单链断裂,双链断裂,1、DNA链断裂的分子机制,（1）脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏（直接）（2）碱基损伤,2、不同条件下辐射所致的DNA链断裂,1）充氧溶液中DNA双链上引起SSB的概率均等，产生与放置时间、