单条线虫DNA提取方法.doc

2011 年第 2 期植物检疫 PLANT QUARANTINE单条线虫 DNA 提取方法Vol 25 No 2王江岭1张建成2顾建锋1*（ 1 宁波出入境检验检疫局技术中心浙江宁波 315012； 2 嘉兴出入境检验检疫局）Method of extract DNA from a single nematode Wang Jiangling1 ，Zhang Jiancheng2 ，Gu Jianfeng1* （ 1 Ning-bo Entry exit Inspection and Quarantine Bureau，Ningbo 315012，China； 2 Jiaxing Entry exit Inspection andQuarantine Bureau）AbstractThere are many problems in extracting DNA from large number of nematodes The nematodes could bea mixed specie The extracted DNA were decreasing in experiment process Amplification might be cumbered byadding more solutes，and even to effect on the next experiments In this method a single nematode was freezed byliquid nitrogen and heated at 85 to disrupte the structure of nematode cells by changing the temperature sudden-ly Then the proteins were dissolved easily by proteinase K and more DNA were extracted This method wasproved effective，rapid，and stabile by kinds of nematodes The advantages of this method are： （ 1） PCR Bufferattached to Taq enzyme take the place of WLB and SDS lysis liquids，which reduces the instability of reaction sys-tem and the effect of added solutes （ 2） All the process is finished in one PCR tube，no liquid transported andless solutes added So the pollution and bad effect to the later PCR process are greatly reduced （ 3） Manual dis-ruption of nematode is replaced by poikilothermic treatment； pollution is avoided and no experiment technique isrequired Compared with two other proteinase K methods of nematode DNA extraction，this method was proved ef-fective and stabile，and could be used in rapid test； nematode proteins were dissolved completely and more DNAreleased，the PCR result is good even when the extracted DNA were diluted for 32 time，which procides more mo-lecular experiments chancesKey words摘要nematode； optimized method； DNA extraction； proteinase K； temperature大量线虫 DNA 的提取可能因线虫不纯而受到污染，溶液多次转移造成 DNA 损失，并且在提取过程中加入过多的溶质离子也可能对 PCR 扩增有干扰，从而影响下一步的研究。本研究用液氮快速冷冻单条线虫，继以 85 快速变温，用温度的剧烈变化使线虫裂解，再以蛋白酶 K 降解蛋白质，提高了获得的DNA 的纯度和数量。通过多种线虫的验证试验表明，该方法高效、快速、稳定。该试验方法有如下优点：（ 1） 使用 Taq 酶附带的 PCR Buffer 代替 WLB 裂解液和 SDS 裂解液，减少了配置的不确定性和外来离子的影响。（ 2） 整个提取过程在一个 PCR 管中完成，并可直接用于 PCR 扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添加，减少污染和对后续 PCR 的影响。（ 3） 使用变温处理代替其他手工破碎方法，减少了外界污染物的掺入，不需要手工操作技巧。与另外 2 种提取线虫 DNA 的蛋白酶 K 方法相比，本研究提取单条线虫 DNA 的时间短，效率高，PCR 扩增结果稳定可靠，符合快速检测的需求； 此外，本研究所使用的方法降解单条线虫蛋白质彻底，提取 DNA 数量多，稀释 32 倍仍能扩增出明显的条带，可进行多次分子试验研究。关键词线虫； DNA 提取； 方法优化； 蛋白酶 K； 温度；中图分类号S763由于线虫体形较小，形态学鉴定十分困难，分础是单条线 虫 DNA 提 取。近 年 来，许 多 学 者 曾 尝子生物学方法已成为十分有效的辅助手段，而其基1 3、蛋白酶 K 法4 9、试剂盒法10基金项目 ： 国家质量监督检验检疫总局科技项目（ 2010IK269） ； 宁波市农业科研攻关合作项目 （ 2008C10014 ） ； 宁波市自然科学基金项目（ 2010A610018）通讯作者 ： E mail ： gujf nbciq gov cn收稿日期： 2010 10 13 32 试用碱裂解法2011 年第 2 期植物检疫 PLANT QUARANTINEVol 25 No 2等进行单条线虫 DNA 提取，但存在实验时间长、所用试剂多、价格贵、结果不稳定等问 题。本 实 验 室11 1材料与方法供试线虫在蛋白酶 K 方法的基础上，利用温度的急剧变化提高提取效果，并 对 蛋 白 酶 K 的 处 理 时 间 进 行 了 优化，使利用单条线虫制备的 DNA 可进行 32 次 PCR反应，而且操作简单、结果稳定。表 1试验 选 用 16 种 线 虫，分 别 为 伞 滑 刃 属 （ Bur-saphelenchus） 、滑刃属（ Aphelenchoides） 、外真滑刃属（ Ektaphelenchus ） 和 鲁 姆 滑 刃 属 （ Ruehmaphelen-chus） ，见表 1。线虫来源编号3069794520114800175890722138387179123种类松材线虫（ B xylophilus）拟松材线虫（ B mucronatus）食菌伞滑刃线虫（ B fungivorus）小角伞滑刃线虫（ B corneolus）豆伞滑刃线虫（ B doui）弗氏伞滑刃线虫（ B fuchsi）拟小刺伞滑刃线虫（ B paraparvispicularis）外真滑刃属线虫（ E sp ）来源美国乌克兰印度尼西亚台湾韩国荷兰香港美国编号2349333463118503020K69965234037002种类鲁姆滑刃属线虫（ R sp ）雄双滑刃线虫（ A stammeri）滑刃属线虫（ A sp ）滑刃属线虫（ A sp ）滑刃属线虫（ A sp ）滑刃属线虫（ A sp ）滑刃属线虫（ A sp ）滑刃属线虫（ A sp ）来源台湾西班牙比利时日本香港美国瑞典韩国1 2比较1 2 13 种方法提取单条松材线虫 DNA PCR 扩 增制备单条线虫 DNA 的 3 种方法提取液（ 3 种提 取 方 法 得 到 的 全 部 DNA 提 取 液） ，ddH2 O 补齐 50 L。扩增程序： 94 4 min； 94 40 s，52 1 min，方法 1： 线虫放入 ddH2 O 清洗，挑取单条放 入72 1 5 min，36 个循环； 72 8 min。200 L PCR 管中（ 含 8 L ddH2 O 和 1 L 10 PCR1 2 3处理设置2+min，向 PCR 管 中 加 入 1 L 1 mg / mL 蛋 白 酶 K，56 加热 15 min，95 加热 10 min，得到 DNA 提取液直接进行 PCR 扩增。11有 20 L ddH2 O 的离心管中， 84 冷冻过夜，室温融化后加入 2 L 10 倍 PCR 缓冲液和 2 L 蛋白酶 K（ 20 mg / mL） ，混合并简单离心，55 温浴 2 3h，95 30 min。8上加 15 L 灭菌的超纯水，用 3 号针将单条线虫挑入水滴中，切成 2 3 段，吸取 12 L 含有所有线虫的双蒸水，加入 200 L PCR 管中，加入 1 5 L 10 PCR Buffer，1 5 L 蛋白酶 K（ 1 mg / mL） ， 80冷冻至少 30 min，65 温育 60 min，95 10 min。1 2 2 PCR 扩增PCR 扩增采用 50 L 反应体系： 10 PCR Buff-er （ Mg2 + free ） 5 L，25 mmol / L MgCl2 5 L，0 1mmol / L dNTP 4 L，10 mol / L 上 游 引 物 F19412（ 5 CGTAACAAGGTAGCTGTAG 3 ） 3 L，10分别用 3 种方法提取单条松材线虫 DNA，每方法设 10 个重复。提取获得的 DNA 直接 PCR 扩增，并电泳拍照。1 3 方法 1 和方法 2 对线虫蛋白质降解比较用方法 1 和方法 2 分别对 10 条松材线虫进行DNA 的提取处理，并在处理结束后吸出全部提取液在显微镜下检查。1 4 单条线虫 DNA 梯度浓度 PCR 扩增取 2 条松材线虫，按照方法 1 用 20 L 提取液提取 DNA。继 而 取 出 10 L 提 取 液 进 行 PCR 扩增，剩余 10 L 提取液分别梯度稀释为 2 倍、4 倍、8倍、16 倍、32 倍、64 倍，稀释后各取 10 L 进行 PCR扩增，电泳拍照。1 5 方法 1 提取多种线虫 DNA PCR 扩增用方法 1 分别提取 1 1 中 除 松 材 线 虫 外 其 他线虫 DNA，PCR 扩增，并电泳拍照。2 结果与分析2 1 3 种方法提取单条线虫 DNA PCR 扩增比较根据 PCR 扩增条带的亮度，由图 1 可看出： 单条线虫 DNA 提取方法 1 PCR 扩增条带亮度清晰、均一，扩增效果稳定，且明显优于方法 2 和方法 3；13（ 5 TTTCACTCGCCGT-方法 2 PCR 扩增条带亮度一般且不稳定； 而方法 3TACTAAGG 3） 3 L，5 U / L Taq 酶 0 6 L，DNA提取成功率不高，还出现了非特异性条带，说明在 33 Buffer（ Mgfree） ） ，液氮中放置 1 min，85 加热 2方法 2： 参考沈锡权。单条线虫放入预先加方法 3： 参 考 王 金 成，在 灭 菌 的 洁 净 载 玻 片mol / L 下游引物 5368r2011 年第 2 期植物检疫 PLANT QUARANTINEVol 25 No 2处理线虫的过程中有可能受到了污染。2 2方法 1 和方法 2 对线虫蛋白质降解比较从图 2 可以看到，方法 1 更有利于蛋白酶 K 发挥作用，且基本降解了线虫的蛋白质； 而方法 2 不能完全降解线虫的蛋白质，甚至还有完整的线虫存在，不能保证得到大量线虫 DNA。这也证明了该方ab图 1法提取线虫 DNA 没有方法 1 高效。c3 种方法提取单条松材线虫 DNA PCR 扩增结果M DL2000 Marker； 泳道 1 10 为单条松材线虫； a 方法 1，b 方法 2，c 方法 3a图 2b两种提取单条线虫 DNA 方法对线虫组分溶解情况a 方法 1； b、c 方法 2c2 3单条线虫 DNA 梯度浓度 PCR 扩增结果方法 1 可适用于多种线虫 DNA 的提取，提 取单条松材线虫 DNA 提取液稀释 2、4、8 倍时可以扩增出较好的条带，稀释 32 倍时仍能扩增出条带效果可达到 100% （ 对于供试线虫） ，并且没有非特异性条带产生，结果准确可靠（ 图 4） 。（ 图 3） ，说明方法 1 提取线虫 DNA 的浓度和纯度都较高，在极微量的情况下仍能扩增出理想的条带。3讨论线虫的分子生物学研究需要制备用于 PCR 反应的核酸，早期研究多需要抽提大量线虫，提取方法 多 为 SDS 破 壁 结 合 氯 仿 去 除 蛋 白 及 其 他 杂14 15。虽然该方法提取 DNA 纯度高，但氯仿的毒性较高，操作步骤繁琐，样本线虫种类纯度也不能完全保证。随着线虫研究的发展，要保证线虫样本的纯度，特别是线虫种类鉴定的需要，许多学者对提取线虫 DNA 的方法进 行 了 摸 索 和 改 进，于 是单条线虫的快速提取方法被应用于线虫分子生物图 3单条松材线虫 DNA 梯度浓度 PCR 扩增结果学研究。M DL2000 Marker； 泳道 1 7 单 条 线 虫 DNA 提 取 液 的 1、2、4、8、16、32、64 倍稀释液2 4 方法 1 提取多种线虫 DNA PCR 扩增结果 34 提取单条线虫 DNA，主要分两步，第一是线虫虫体及虫体细胞破裂，核酸溶解到溶液中； 另一方面需要降低虫体中酶类和蛋白对 DNA 纯度及产量质2011 年第 2 期图 4植物检疫 PLANT QUARANTINE经方法 1 提取的多种线虫 DNA PCR 扩增结果Vol 25 No 2M DL2000 Marker； 1 6 食菌伞滑刃线虫、拟松材线虫、小角伞滑刃线虫、豆伞滑刃线虫、弗氏伞滑刃线虫、拟小刺伞滑刃线虫； 7 12 6 种滑刃属线虫； 13 15 雄双滑刃线虫、鲁姆滑刃属线虫、外真滑刃属线虫的影响。很明显，SDS 结合氯仿大量提取方法提取单条线虫需多次转移溶液并不断舍弃部分溶液组分，不但增加了污染的可能，降低了产量，而且加入大量的离子也可能影响 PCR 扩增，及进行 RLFP 等进一步的研究，不 适 合 单 条 线 虫 的 DNA 提 取。而部分学者采用的方法，比如微型搅拌器（ micro vi-bromixer） 破碎法、研磨法、手工切断法、超声波匀浆法都可能因仪器工具进入溶液带来污染，也会给本来微量的样品带来损失，而手工切断线虫还需要一tagged sites Genetics Society of America， 1992， 131： 609 6246 Stanton J M，Mcnicol C D，Steele V Non manual lysis of sec-ond stage Meloidogyne juveniles for identification of pure andmixed samples based on the polymerase chain reaction Australa-sian Plant Pathology，1998，27： 112 1157 Castagnone C，Abad P，Castagnone Sereno P Satellite DNA based species specific identification of single individuals of thepinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus（ Nematoda： Aphe-lenchoididae） European Journal of Plant Pathology，2005，112：191 193定的技巧。8Wang J C，Yu B Y，Lin M S Description of a new species采用剧烈变化的温度处理线虫，可使虫体及细胞充分破裂，而且极端的温度也会使酶类钝化或变性失活，减少核酸降解。另外，本实验 室 相 关 研 究表明，当没有液氮时用 70 冷冻线虫至少 15 min替代，同样可达到液氮处理 1 min 的效果。本文采 取 的 快 速 提 取 方 法 主 要 有 如 下 优 点：（ 1） 使用 Taq 酶附带的 PCR Buffer 代替 WLB 裂解液和 SDS 裂解液，减少了配置的不确定性和外来离子的影响。（ 2 ） 整个提取过程在一个 PCR 管 中 完成，并可直接用于 PCR 扩增，没有溶液的转移和过多的溶质 添 加，减 少 污 染 和 对 后 续 PCR 的 影 响。（ 3） 使用变温处理代替其他手工破碎方法，减少了外界污染物的掺入。参考文献1 张立海，廖金铃，冯志新 松材线虫 rDNA 的测序和 PCR SS-CP 分析 植物病理学报，2001，31（ 1） ： 84 892 蒋立琴 伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究D 杭州： 浙江大学，2006： 293 葛建军，刁鹏，陈洪俊 马铃薯金线虫的分子检测技术 植物检疫，2008，22（ 1） ： 21 234 Barstead R J，Kleiman L，Waterston R H Cloning，sequencingand mapping of an actinin gene from the nematode Cae-norhabditis elegans Cell Motil Cytoskeleton，1991 20（ 1） ： 69 785 Williams B D，Schrank B，Huynh C，et al A genetic mappingsystem Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence （ Nematoda，Aphelenchoididae） isolated from wood packging ma-terial Acta Zootaxonomica，2005，30（ 2） ： 314 3199 Subbotin S A，Ragsdale E J，Mullens T，et al A phylogeneticframework for root lesion nematodes of the genus Pratylenchus（ Nematoda） ： Evidence form 18S and D2 D3 expansion seg-ments of 28S ribosomal RNA genes and morphological charactersMolecular Phylogenetics and Evolution，2008，48： 491 50510 Burgermeister W，Metge K，Braasch H，et al ITS RFLP pat-terns for differentiation of 26 Bursaphelenchus species （