沙门氏菌和志贺氏菌的检测

沙门氏菌和志贺菌检测,熊长辉,肠道感染细菌是通过粪-口传播途径进行传播的一类细菌。主要包括肠杆菌科细菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、幽门螺杆菌等。肠杆菌科中与医学有关的包括：埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、变形杆菌属等。,概述肠道感染细菌,肠杆菌科共同特性,相似的形态染色,简单的培养条件,活泼的生化反应,G-小杆菌，有鞭毛(痢疾杆菌外)菌毛，某些有荚膜，无芽胞,需氧或兼性厌氧，营养要求不高,致病菌非致病菌,乳糖发酵实验,阴性,阳性,SS琼脂培养基（含胆盐、乳糖、中性红等）,4、抗原构造复杂,鞭毛抗原（H）IgG,菌体抗原（O）IgM,K或Vi抗原,溶原性转换,生化反应性变异,通过,耐药性变异,毒力性变异,转导,接合,5、抵抗力：不强,6、易变异：,通过,引起,沙门菌检测,美国细菌学家Salmon与Smith于1885年分离出猪霍乱沙门菌。1990年为纪念Salmon，定名这类细菌为沙门菌属。沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌。包括伤寒、副伤寒甲、乙、丙型，肠炎，鼠伤寒等沙门菌，现今已发现2324个血清型。在世界各地的食物中毒中，沙门菌食物中毒常占首位或第二位。规定在药品和食品中不得检出沙门菌。美国每年报道病例45000个左右，实际数量可能多达200-300万。伤寒每年400-500例。,生物学特性,1.形态两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，（0.4-0.9）m(1-3)m，无芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，少数有包膜。光滑型的细菌大小均匀，粗糙型则大小不一，长短不一。,培养和生化反应,兼性厌氧，最适生长温度3537，最适生长PH为6.87.8.本菌属对营养的要求不高，在普通营养琼脂上生长的菌落为圆形、光滑、湿润，半透明，边缘整齐的菌落，有时可出现粗糙型的菌落。在肠道选择性培养基上菌落小至中等，透明或半透明，乳糖不发酵，与志贺菌的菌落相似，有些能产生硫化氢的菌株，在SS琼脂上形成中心黑色的菌落。,抗原构造,菌体抗原（o）：不被乙醇、0.1%石炭酸所破坏。与特异性抗血清呈颗粒状凝集，形成慢，不易摇散。现已知有50多种，多数沙门菌含有两种以上的O抗原，有的O抗原是一种菌独有的，有的是几种菌共有的，凡含有共同特异性抗原成分的血清型归为一个群，可将沙门菌化分为42群，按A-Z排列，Z以后的顺序以O51-O67表示。引起人类沙门菌病的95%以上都在A-F6个群内。,H抗原：为不稳定的蛋白质抗原，加热或用乙醇处理均被破坏。沙门菌H抗原有两个相,第一相特异性较高称特异相,用小写英文字母a、b、c表示，直至z，z以衙用z加阿拉伯数字表示，如z1、z2、z3等，第二相抗原为沙门菌共有，称非特异相，直接用1、2、3表示。同时有第一相和第二相H抗原的细菌称为双相菌，仅有一相者称单相菌。H抗原是定型的依据，其刺激机体产生的抗体以IgG为主，与相应的抗血清呈絮状反应。,表面抗原：在沙门菌属中已被证实的表面抗原有Vi抗原、M抗原、5抗原三种Vi抗原：是一种不耐热的酸性多糖聚合物，加热6030分钟或经石炭酸处理即被破坏，经人工培养基传代后也易失去。新分离的伤寒及副伤寒沙门菌常带有此抗原。Vi抗原位于菌体的最表层，有抗吞噬及保护细菌免受相应抗体和补体的溶菌作用。Vi抗原存在时可阻止O抗原与相应抗体发生凝集，故在沙门血清学鉴定时应加以注意，需事先加热破坏Vi抗原之后，O抗原才得以与相应的O抗血清发生凝集。带Vi抗原的沙门菌亦可用Vi噬菌体进行分型，有助于流行病学调查和追踪传染源。,M抗原：粘液抗原，在菌型鉴定上无特殊意义。5抗原：,4.抵抗力,不强，加热601h，或651520min即被杀死。在水中能存活23周，在粪便中可存活12月。对胆盐和煌绿等染料有抵抗力。因此可用于制备沙门菌的选择培养基。,5.变异性,S-R变异:自临床标本初次分离的菌株一般都是光滑型，经人工培养，传代后可逐渐变民粗糙型菌落。此时菌体表面的特异多糖抗原丧失，在生理盐水中可出现自凝。H-O变异：是指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异位相变异：具有双相H抗原的沙门菌变成只有其中某一相的单相菌，称位相变异。在沙门菌血清学分型时，如遇到单相菌，特别是只有第相（非特异相）抗原时，需反复分离和诱导出第相（特异相）抗原方可作出鉴定。V-W变异：是指沙门菌失去Vi抗原的变异。初次分离得到的具有Vi抗原、O抗原不凝集的沙门菌称V型菌；Vi抗原部分丧失，与O抗原血清发生凝集又可与Vi抗血清凝集者称VW型菌。Vi抗原完全丧失，与O抗原血清发生凝集又与Vi抗血清不凝集者称W型菌。V-W变异的过程是V型菌经人工培养，逐渐丧失部分Vi抗原而成为VW型，进而丧失全部Vi抗原而成为W型菌。,二、致病性与免疫性致病物质：1.侵袭力：菌毛帮助细菌黏附肠粘膜上皮细胞Vi抗原可阻断相应抗体和补体的作用，抵抗吞噬细胞的吞噬作用。内毒素：可激活补体系统、吸引白细胞，引起肠道炎症，吸收入血可引起全身中毒，发热、白细胞减少、中毒性休克。肠毒素：类似于大肠杆菌肠毒素。,2.所致疾病1)肠热症（伤寒和副伤寒）：由伤寒沙门菌、甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起。2）食物中毒（急性胃肠炎）：由鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌引起，有发热、恶心呕吐、水样泻，严重者致脱水、休克、肾衰而死亡（主见于婴儿、老人等），但，大多23天自愈。3）败血症：常由猪霍乱沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等引起。有高热、寒战、贫血等严重症状。多见于儿童及免疫力低下者。免疫性：主要依靠细胞免疫，牢固。,二、微生物学检查,标本采集根据疾病的类型、病情和病程的不同分别采集不同的标本。分离培养原则上于发病第1周采血，第2周取粪便或尿液，全程均可作骨髓培养。血清学诊断应在病程的不同时期分别采集23份标本。,血液、骨髓,粪、尿、可疑食物,增菌培养,（胆盐葡萄糖肉汤）,分离培养,（SS、EMB、MAC、血平板）,增菌培养,(SF、CN、TT),371824h,可疑菌落,初步鉴定,（涂染检、KIA、MIU、IMViC等生化反应、A-F多价血清凝集）,最终鉴定,肠道杆菌系统生化反应单价因子血清定血清型,371824h,371824h,371824h,检验程序,检验方法,直接检测将病人标本或肉汤增菌培养物直接用商品乳胶凝集试剂进行试验，可快速检出沙门菌和志贺菌。,检验方法,分离培养常规的肠道选择鉴别培养基能有效地分离沙门菌。常用肠道鉴别培养基（MAC或EMB）和选择培养基（SS等），强选择性培养基（孔雀绿和亚硫酸铋等）仅适用范围于暴发流行时。,分离培养,（1）血液和骨髓：血液5ml或骨髓液0.5ml胆汁葡萄糖肉汤或胰化蛋白大豆肉汤中，35-37孵育，若有生长（多在24日内出现）则移种至血琼脂平板和SS培养基中。（2）粪便或肛拭：最好作床边接种，或用卡-布（Cary-Blair）运送培养基。（3）尿液和体液：无菌采集的中段尿、胆汁、脑脊液、胸腹水等经3000r/min离心沉淀后接种于增菌液、血琼脂和肠道选择培养基。（4）食物等固体物质：磨碎后加10ml无菌生理盐水混匀，接种于增菌液和肠道选择培养基。,鉴定与分型生化鉴定,疑为沙门菌的可疑菌落可用手工或商品生化反应进行生化鉴定，常用三糖铁(TSI)琼脂和赖氨酸琼脂来初步鉴定。本菌在TSI上典型的生化模式为：碱/酸，葡萄糖产气，硫化氢阳性（K/A+）。少数菌株为乳糖发酵型，呈（A/A），这些菌株的硫化氢往往阴性。在赖氨酸铁琼脂上的典型生化模式为K/K和硫化氢阳性，但亦存在赖氨酸和硫化氢阴性的菌株（副伤寒A沙门菌）。初步反应疑为沙门菌的菌株必须经全面生化反应证实和血清学分型后才能发出报告。,乳糖:蔗糖:葡萄糖=10:10:1以酚红作指示剂当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养基均呈黄色；如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于细菌生长分解蛋白胨而释放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化亚铁。,生化反应,初步鉴别：三糖铁琼脂,斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄色，无黑色斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可出现上述反应。吲哚试验：阴性,志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生H2S，多数产气。下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？,沙门菌属细菌的初步鉴定,MIU触酶氧化酶,硝酸盐还原,诊断血清凝集,KIA,斜面底层产气H2S,甲型副伤寒KA+-/+-+AF多价+A群+乙型副伤寒KA+-+AF多价+B群+丙型副伤寒KA+-+AF多价+C群+vi+猪霍乱沙门菌KA+-/+-+AF多价+C群+伤寒沙门菌KA-+/-+-+AF多价+D群+vi+其他沙门菌KA+-+AF多价+肠炎+,鉴定与分型血清学分型,2.血清学分型用抗血清对所分离菌种的O抗原、表面Vi抗原，第一相和第二相H抗原进行凝集试验（O：Vi：第一相H：第二相H）。多数实验室先用多价O抗血清（A-F）对沙门菌分离株进行分群。95%以上的沙门菌临床分离株都属A-F群，多价抗血清凝集后再用分别代表每一个O血清群的单价因子血清定群。O分群之后再用H因子血清检查第一相和第二相H抗原，综合O、H及Vi因子血清的检查结果，判断血清型。,鉴定与分型血清型分型,注意：试验时与多价血清不凝集时，可在玻璃试管内用生理盐水将细菌制成尝菌液，放入沸水中1530min，冷却后再次做凝集试验。因Vi抗原能阻断O凝集反应，而煮沸处理能破坏菌体表面的Vi抗原。仅出现单相H抗原（第一相或第二相）时，需用位相分离的方法诱导出另一相抗原后再进行检查。,鉴定与分型Vi噬菌体分型,标准的Vi噬菌体共有33型，该法可用于流行病学调查和追踪传染源，常在一些特殊的参考实验室内进行，一般医院的微生物实验室不列为常规检查项目。,血清学诊断,用已知伤寒、副伤寒的O、H抗原，检测受检血清中有无相应的抗体的半定量试管内凝集试验，称为肥达反应。方法将受检血清用生理盐水作倍比稀释，每个稀释度需作出努力个复管，分别加入等量的伤寒沙门菌O、H抗原及副伤寒沙门菌甲、乙、丙的H抗原进行试管内凝集，凡血清最高稀释度出现明显凝集者为凝集将价。,1）正常凝集价正常人由于隐性感染或预防接种，血清中通常可含有一定水平的凝集抗体，正常的凝集价可因不同地区而有差异一般情况下，伤寒沙门菌O抗体的凝集价应在180以上，H抗体凝集价在1160以上，引起副伤寒沙门菌H抗体凝集价在180以上才有诊断意义2）动态观察有时单次效价不能定论，可在病程中逐周检查。若效价逐次增加或恢复期效价比初次4倍者有意义,O与H抗体的诊断意义：O抗体出现较早，为IgM，持续时间短（约半年），消退后不易受非特异性病原刺激而重现。H抗体出现较晚，为IgG，持续时间长达数年，消退后易受非特异性病原刺激而重现。O、H凝集价均超过正常值，则肠热症的可能性大：若两者均底，肠热症的可能性小：若O不高H高，可能是预防接种或非特异性反应；若O高H不高，则可能为伤寒早期，或与其他沙门菌有交叉反应。,结果判断及报告,（1）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阳性反应，做出检出沙门菌报告。（2）生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阴性反应，做出未检出沙门菌报告。（3）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阴性反应；或生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价O血清凝集试验阳性反应；均应进一步鉴定后再做结论报告。,对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生化试验。糖醇发酵试验明胶液化试验硝酸盐还原试验甲基红试验VP试验,柠檬酸盐利用试验半乳糖苷酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验丙二酸钠试验有机酸盐利用试验甘油品红试验,注意事项,培养基对照挑取菌落纯培养严格按照规定进行避免对环境造成污染,志贺菌属检测,志贺菌属是人类细菌性痢疾最常见的病原菌，通称痢疾杆菌。根据生化反应与血清学试验该属细菌分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内志贺菌四群。CDC分类系统（1989）将生化性状相近的A、B、C群归为一群，统称为A、B、C血清群，将鸟氨酸脱羧酶和-半乳糖苷酶均阳性的宋内志贺菌单列出来。我国以福氏和宋内志贺菌引起的菌痢-最为常见。细菌性痢疾是一种常见病，主要流行于发展中国家，全世界年病例数超过2亿，其中500万例需住院治疗，年死亡病例达65万。,生物学性状形态结构和染色,革兰阴性杆菌，菌体短小，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。,培养特性,兼性厌氧、营养要求不高在肠道选择培养基上呈无色半透明S型菌落菌落SS平板无色菌落Mac平板无色菌落EMB平板无色菌落宋内志贺菌多呈扁平、R型菌落，个别菌株可迟分解乳糖,生化反应,氧化酶试验（）分解葡萄糖、不分解乳糖，（个别菌株迟分解乳糖或不分解乳糖）KIA：KAMIU：/IMViC：/除A群外，均能发酵甘露醇,抗原结构,只有O、K抗原，无H抗原K抗原可阻断O抗原与相应抗体的凝集根据O抗原分4群和44型,志贺菌抗原分类,抵抗力,对理化因素抵抗力弱尤其对酸敏感对消毒剂敏感易产生耐药性,变异性,S-R变异宋内志贺的菌落由光滑型变为粗糙型为S-R变异,此外尚伴有生化特征、抗原构造及致病性的变异，而出现不典型菌株。耐药性变异志贺菌于50年代首先出现对磺胺的耐药性，后发展成多重耐药性，在70年代和80年代分别出现对四环素和氨苄青霉素的耐药性，最近又出现对SMZ-TMP的耐药性。志贺菌的多重耐药性的问题已成为一个严重的医学问题,临床意义,致病物质：侵袭力：菌毛、大质粒内毒素：志贺毒素：属外毒素，由A群志贺菌产生，具有肠毒、细胞毒、神经毒作用,急性菌痢发热、腹痛、里急后重、脓血粘液便。急性中毒性菌痢休克为主要表现的全身中毒症状；小儿多见，为内毒素在特殊情况下的反应。慢性菌痢病程超过2个月，反复发作或迁延不愈。携带者恢复期带菌、慢性带菌、健康带菌,所致疾病,免疫性,志贺菌感染局限与肠粘膜，一般不入血，SIgA为主，病后免疫力短暂。,致病性与免疫性,1、侵袭力：,菌毛有利于菌粘附回结肠粘膜,2、毒素：,加重局部和全身症状,内毒素,作用于肠壁,通透性增加,粘膜炎症、溃疡,局部,全身,内毒素血症,外毒素（A群1型）,与内毒素协同作用,致病物质,肛门括约肌,临床表现,急性细菌性痢疾,急性典型：发热、腹痛、脓血粘液便,非急性典型：小儿中毒型成人易误漏诊,慢性细菌性痢疾：病程迁移二月以上,传染源:患者与带菌者,所致疾病,免疫力:SIgA,中毒性痢疾病人,微生物学检验,标本采集粪便或肛拭新鲜脓血便立即送检或床边接种保存于30甘油盐水或卡-布培养基,及时送/暂用3%甘油缓冲水保存,SS平板（无色透明小菌落）,血清学反应（玻片凝集）,检测报告,分离培养,新鲜脓血便/肛拭,双糖培养基（生化反应）,快速诊断,荧光菌球试验,协同凝集试